一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法与流程

本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种利用数字pcr技术检测egfrg719x基因变异的方法。

背景技术：

非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，尽管手术和化疗技术不断提高，但患者的预后仍较差，5年存活率小于20％。目前，以人表皮生长因子受体(epitheliumgrowthfactorreceptor,egfr)为靶点的分子靶向治疗已成为治疗nsclc最重要的方式。

目前临床上使用的针对egfr的靶向药物是egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)，egfr-tki通过抑制egfr自身磷酸化而阻断egfr信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖分化，实现靶向治疗。egfr-tki的疗效与egfr基因突变状况密切相关，egfr酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(tkis)的敏感性密切相关。egfr基因突变除了常见的19外显子缺失和l858r活性突变外，外显子18点突变g719x大约占4％。这种突变egfr-tki治疗通常反应良好。因此，egfr基因外显子18点突变g719x的检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，然而目前egfr基因g719x变异检测仅能检测出其中的一种或两种变异形式。

血浆游离dna(cfdna)含有循环肿瘤dna(ctdna)，对血浆中游离dna进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离dna可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfdna检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。然而，由于血浆游离dna在血液中含量极少，且有大量血源dna干扰，即使采用高效的dna富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、arms-pcr)，仍难以准确而可靠地检测出肿瘤相关的游离dna的具体种类和序列。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者体内egfrg719x基因变异的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的是针对患者非肿瘤组织中egfrg719x基因变异检测灵敏度低的缺陷，提出一种利用数字pcr技术检测egfrg719x基因变异的方法。该方法以数字pcr为检测平台，针对egfrg719x基因的三种变异形式(g719a、g719s、g719c)设计合成用于检测egfrg719x基因变异上下游引物、egfrg719x基因变异检测探针，通过数字pcr技术判断待测样品中是否含有egfrg719x基因变异的模板和发生突变的模板含量。该方法对于检测非肿瘤组织中egfrg719x基因变异灵敏度高，且可同时检测egfrg719x基因三种变异形式。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了ddpcr技术检测egfrg719x基因变异的引物和探针，egfrg719x基因变异包括egfrg719a基因变异、egfrg719s基因变异和egfrg719c基因变异，用于检测egfrg719x基因变异的上游引物序列如seqidno：1所示，用于检测egfrg719x基因变异的下游引物序列如seqidno：2所示，egfrg719a基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：3所示，egfrg719s基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：4所示，egfrg719c基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：5所示，egfrg719x野生型的检测探针的核苷酸序列如seqidno：6所示。

进一步地，所述egfrg719a基因变异的检测探针、egfrg719s基因变异的检测探针、egfrg719c基因变异的检测探针、egfrg719x野生型的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

本发明还提供了一种利用数字pcr技术检测egfrg719x基因变异的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提取受试者骨髓、外周血或组织的cfdna；

2)以cfdna为模板，将待测样品cfdna模板、用于检测egfrg719x基因变异的上下游引物、egfrg719x基因变异的检测探针、egfrg719x野生型的检测探针以及pcr预混液混合，制备ddpcr混合液；

所述egfrg719x基因变异包括egfrg719a基因变异、egfrg719s基因变异和egfrg719c基因变异，用于检测egfrg719x基因变异的上游引物序列如seqidno：1所示，用于检测egfrg719x基因变异的下游引物序列如seqidno：2所示，egfrg719a基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：3所示，egfrg719s基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：4所示，egfrg719c基因变异的检测探针的核苷酸序列如seqidno：5所示，，egfrg719x野生型的检测探针的核苷酸序列如seqidno：6所示；

3)ddpcr混合液制作pcr微反应液滴，再进行pcr扩增反应；

4)信号收集并进行结果判读：pcr扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有egfrg719x基因变异的模板和发生突变的模板数量及含量。

进一步地，ddpcr混合液中cfdna模板的含量为0.3～2ng/μl。

更进一步地，ddpcr混合液中cfdna模板的含量为1ng/μl。

进一步地，ddpcr混合液中上游引物和下游引物含量均为400～700nm，egfrg719x基因变异的检测探针、egfrg719x野生型的检测探针含量均为200～400nm。

更进一步地，ddpcr混合液中上游引物和下游引物含量均为500nm，egfrg719x基因变异的检测探针、egfrg719x野生型的检测探针含量均为250nm。

进一步地，步骤4)中ddpcr混合液制作pcr微反应液滴的方法为：将ddpcr混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。

进一步地，步骤3)中pcr扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

更进一步地，步骤3)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于pcr检测时灵敏度可达到0.01％(即可以从1万个正常dna分子中检测到一个突变分子的存在)，避免产生假阴性结果；

(2)且利用本发明设计合成的引物进行pcr扩增，扩增出来的片段仅为94bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增，因此可以从cfdna中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用；

(3)本方法可以一次检测egfrg719x基因的三种变异形式(g719a、g719s、g719c)，操作过程更加简便，大大减少了临床检测成本及工作量。

附图说明

图1为实施例2中野生型egfr基因的dna样本的荧光检测结果；

图2为实施例2中突变体与野生型含量比为1/100的样本的荧光检测结果；

图3为实施例2中突变体与野生型含量比为1/1000的样本的荧光检测结果；

图4为实施例2中突变体与野生型含量比为1/10000的样本的荧光检测结果。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为ncbi(美国国立生物技术信息中心)。

实施例1：ddpcr技术检测egfrg719x基因变异的引物和探针的设计与合成

针对egfr基因外显子18的egfrg719x的三种变异形式，以egfr基因外显子18全长cdna为模板，使用oligo软件分析taqman引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：

g719x变异上、下游引物：

上游引物seqno1：5’-gctcccaaccaagctctct-3’

下游引物seqno2：5’-ccttatacaccgtgccgaac-3‘

利用上述的引物进行pcr扩增时，扩增片段为94bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增。

设计的g719x变异检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，其序列如下：

g719a检测探针为seqno3：5’-fam-tgctggcctccgg-mgb-3’

g719s检测探针为seqno4：5’-fam-aaagtgctgagctccg-mgb-3’

g719c检测探针为seqno5：5’-fam-aagtgctgtgctccggt-mgb-3’

野生型检测探针为seqno6：5’-hex-agtgctgggctccg-mgb-3’

本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于pcr检测时灵敏度可达0.01％；且利用此套引物进行pcr扩增，扩增出来的片段仅94bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增，能从cfdna中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用；本实施例中提供的引物和探针应用于pcr检测时能一次检测egfrg719x基因的三种变异形式，大大降低临床检测成本及工作量。

实施例2：全血样本中egfrg719x基因变异的检测

1.准备待测样品：含有野生型egfr基因的dna、egfr外显子18的三种变异形式(g719a、g719s、g719c)突变阳性dna以及野生型突变dna混合样本(其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/10000)。dna来源于血浆中。其中，突变dna模板来源于携带egfr外显子18的g719a、g719s、g719c基因变异细胞系(经pcr测序鉴定)。

2.cfdna的提取：采用试剂盒提取cfdna，具体的操作参见qiagen公司的qiaampdnaminikit试剂盒说明书。

3.在pcr板中按照以下配比制备pcr反应液：2×数字pcr预混液(biorad，#1863010)、用于检测egfrg719x基因变异的上、下游引物、egfrg719x基因变异的检测探针与待检测cfdna模板混合，用蒸馏水补足至终体积为20ml，配制成数字pcr混合液。其中上、下游引物含量分别为500nm，检测探针含量分别为250nm。

4.将装有配制好的20ml数字pcr混合液的pcr板、新的96孔pcr板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入autodg自动化微滴发生器，用于制备pcr微反应微滴。

5.将装有pcr微反应液滴的96孔pcr板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。

6.将96孔pcr板放入pcr仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

7.pcr扩增反应后将pcr反应板放置于pcr微反应液滴信号读取仪(qx200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，检测fam和vic的荧光信号。用quantasoft(biorad)软件进行数据分析结果如图1、图2和图3所示。同时进行定量分析，得出样本中突变dna的绝对含量以及相对总dna的比例。例如，待测样本中含有x个突变型基因目标分子，y个野生型基因目标分子。经过反应及检测后，结果采用这样的方式进行分析。

则突变型基因检测数目为x＝b，野生型基因检测数目为y＝c，其突变频率为x/(x+y)＝b/(b+c)。

根据上述的方法对不同突变型与野生型的含量进行样品检测，突变阳性信号(fam)与总信号数(fam和vic)如下：

1/100样品：计算值突变/野生＝1/100，误差为零；

1/1000样品：计算值突变/野生＝1/1000，误差为零；

1/10000样品：计算值突变/野生＝0.998/10000，误差0.2％。

由此可知，突变型dna模板与野生型dna模板比例为1/100-1/1000时，定量检测误差为零，突变型dna模板与野生型dna模板比例为1/100-1/10000时，定量检测误差为0.2％，因此可以从cfdna中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

序列表

<110>良培基因生物科技（武汉）有限公司

<120>一种利用数字pcr技术检测egfrg719x基因变异的方法

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<170>siposequencelisting1.0

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aagtgctgtgctccggt17

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<212>dna

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