一种非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于共有引物介导的非对称pcr的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒。

背景技术：

我国是农业大国，保障和促进农业的可持续发展一直是国家非常重视的问题。植物病原菌严重危害各种农作物的生长，是现代农业生产的最主要威胁之一。植物病害造成的经济损失是多方面的。首先，对生产者来说，由于病害引起的产量减少和产品质量降低，导致收入减少；由于防治植物病害（比如喷洒农药）所产生的防治费用而增加了成本；有时不得不种植抗病但产量不高的品种或者改种其他经济效益低的作物。其次，对消费者来说，病害引起的减产会导致农产品价格上涨，使他们生活开支增加，生活品质下降。据联合国粮农组织（fao）估计，植物因受病害损失平均为总产量的10%-15%。全球因此造成的经济损失平均每年高达2000亿美元。因此，无论是病害预测还是病害防治，都亟需发展一种快速、灵敏、特异、安全的检测植物病原菌的方法。

对发病植物进行快速准确的病害诊断，对无病状植物材料和植物生长环境中病原物的及时检测和监测是控制植物病害流行和成灾的重要基础。在植物病害检测中，传统的检测方法一般是在植物出现症状以后，通过观察其症状表现，进行病原物的分离等一系列繁琐的过程，最终才得到鉴定结果，而且有一些病原物的分离鉴定比较困难，尤其是大多数专性寄生物难以人工离体培养，这就使得病原物检测和病害诊断过程存在检测周期长、工作量大、结果不准确等缺点。近年来随着分子生物学技术的发展，一些新的检测技术得到了迅速的发展和应用，比如核酸试纸条检测技术，其源于成熟的免疫层析技术。免疫层析技术的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。核酸试纸条技术的原理则是基于核酸杂交而不是抗原抗体特异性结合，其与免疫试纸条相比，具有成本低、应用范围广、灵敏度高、准确性好的特点，因而已被应用于转基因生物的检测、细菌感染的分子诊断和基因分型等领域，同时在控制植物病害的传播、成灾中也发挥了重要作用。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于共有引物介导的非对称pcr与核酸试纸条检测结合的快速、灵敏、准确、操作简便的检测植物病原菌的方法。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法检测致病疫霉的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

基于共有引物介导的非对称pcr结合核酸试纸条检测植物病原菌的方法，具体包括以下步骤：

（1）模板的准备：提取植物病原菌的dna。

（2）设计扩增引物：包括一条共有引物以及一对能够特异地扩增植物病原菌保守序列的上游引物和下游引物。共有引物为与植物病原菌基因组不能完全互补配对的一段序列。上游引物的5’端添加了一段与共有引物序列相同的序列。

（3）非对称pcr反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行非对称pcr扩增反应，得到单链dna产物。

（4）探针的设计：根据单链dna产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链dna产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团。

（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。

（6）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜（nc膜）和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜（nc膜）和吸水板依次搭接固定于底板上（如图1b所示结构）组装得到胶体金核酸试纸条。

所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线（c线）和含链霉亲和素和探针2的检测线（t线），检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。

（7）检测：将由步骤（3）得到的dna产物与检测缓冲液（4×柠檬酸钠缓冲液+5%甲酰胺+1%tritonx-100）混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加检测缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测植物病原菌，仅有控制线变成红色表明没有待测植物病原菌。

步骤（1）中所述植物病原菌包括致病疫霉（phytophthorainfestans）、立枯丝核菌（rhizoctoniasolani）、茄科雷尔氏菌（ralstoniasolanacearum）、稻瘟菌（magnaporthegrisea）、玉米锈病菌（pucciniasorghischw.）、小麦壳针孢叶枯病菌（zymoseptoriatritici）、柑桔溃疡病菌（xanthomonasaxonopodispv.citri,xac）和马铃薯早疫病菌（alternariasolani）等。

步骤（2）中所述植物病原菌保守序列优选为植物病原菌的16s核糖体rna基因（16srrna基因）保守区、基因组重复序列或毒力基因片段，如致病疫霉o8重复序列、立枯丝核菌的内毒素endo1基因和稻瘟菌的16srrna基因等。

步骤（3）中所述非对称pcr反应的体系包含：模板dna、聚合酶、聚合酶缓冲液、共有引物、上游引物、下游引物、dntps和双蒸水；所述的共有引物的终浓度为300～500nm；所述的上游引物的终浓度为30～60nm；所述的下游引物的终浓度为30～60nm。

步骤（3）所述非对称pcr反应的条件优选为每25μl反应体系的组成如下：模板dna1ng/μl、共有引物300nm，上游引物30nm、下游引物30nm、聚合酶0.5u、聚合酶缓冲液、dntps0.1mm（每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.1mm）；

步骤（3）所述扩增过程优选为：95℃反应3min；接着95℃反应30s，52℃反应30s，72℃反应30s，共反应45个循环；72℃反应10min。

步骤（3）中所述单链dna产物的长度优选为100～300nt。

步骤（4）中所述探针1和探针2的长度优选为20～30nt。

步骤（4）中所述探针1的功能基团优选为巯基，探针2和探针3的功能基团优选为生物素。

步骤（5）中所述纳米金的粒径优选为13-20nm。

步骤（5）中所述包埋缓冲液为：na3po420mm，bsa（牛血清白蛋白）质量百分比5%，tween20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比10%。

步骤（6）中所述的底板的材料优选为pvc塑料。

步骤（6）中所述样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述样品板处理缓冲液为：ph8.0，体积百分比0.25%的tritonx-100，0.05mtris-hcl，0.15mnacl。

步骤（6）中所述金垫的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用20μl步骤（5）中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存。

步骤（6）中所述硝酸纤维素膜的处理方法优选为：用喷膜仪将5μl链霉亲和素溶液和探针2混合液喷到检测线（t线）的位置，将5μl链霉亲和素溶液和探针3混合液喷到控制线（c线）的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1mg/ml，所述的探针2和探针3的浓度为100μm；所述的检测线与控制线间隔6mm；所述的检测线宽1mm与金垫相隔6mm，所述的控制线宽1mm与金垫相隔12mm。

步骤（6）中所述吸水板的材料优选为吸水纤维。

步骤（6）中所述组装优选为：底板在最下层，nc膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于nc膜的上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于nc膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与nc膜重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的条。

步骤（7）中所述检测的过程优选为：将25μl由步骤（3）得到的dna产物与125μl检测缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，10min后，再滴加50μl检测缓冲液，15min之内读取结果。

所述的植物病原菌为致病疫霉时，其保守序列为o8重复序列；

体系中扩增保守序列的引物为：

共有引物：5’-ccaatccaatccaatcccccc-3’；

上游引物：5’-ccaatccaatccaatccccccaagatgatgttggatgattg-3’；

下游引物：5’-tgcctgatttctaccttct-3’；

单链dna产物的序列为：5’-ccaatccaatccaatccccccaagatgatgttggatgattggagagctcggatccacggcgagtgtacaattacagtgaagtggatccaagcgacctggatccggatgagtgtacccataatagggtgaccatgatgattacgtcatggatccggtggatctgaagataatacagctgggatgatgggtcaagggaagaagggacatgcagccgagcctggtaagggatttagcagatgaaagacatagaaggtagaaatcaggca-3’；单下划线部分为与探针1互补配对的，双下划线表示的是探针2结合的区域；探针3与探针1完全互补；

探针1为：5’-gggattggattggattggttttttttttttttt-sh-3’（sh表示巯基）；

探针2为：5’-bio-tttttttttttttgcctgatttctaccttct-3’（bio表示生物素）；

探针3为：5’-ccaatccaatccaatccctttttttttttt-bio-3’（bio表示生物素）。

使用上述方法检测致病疫霉的试剂盒，包含a、b两个分试剂盒；

a分试剂盒包含引物、聚合酶、聚合酶缓冲液、dntps、双蒸水，其中：

所述的引物包括共有引物、上游引物和下游引物：

共有引物：5’-ccaatccaatccaatcccccc-3’；

上游引物：5’-ccaatccaatccaatccccccaagatgatgttggatgattg-3’；

下游引物：5’-tgcctgatttctaccttct-3’；

b分试剂盒包含探针、检测缓冲液、胶体金核酸试纸条；

所述的探针包括探针1、2和3：

探针1为：5’-gggattggattggattggttttttttttttttt-sh-3’（sh表示巯基）；

探针2为：5’-bio-tttttttttttttgcctgatttctaccttct-3’（bio表示生物素）；

探针3为：5’-ccaatccaatccaatccctttttttttttt-bio-3’（bio表示生物素）；

所述的检测缓冲液为含5%甲酰胺和1%tritonx-100的4×ssc缓冲液。

所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板（材料为pvc塑料）上且依次搭接的样品板（材料为玻璃纤维）、金垫（材料为玻璃纤维）、硝酸纤维素膜和吸水板（材料为吸水纤维）；金垫包埋有连接探针1的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线（c线）和含链霉亲和素和探针2的检测线（t线），检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。

本发明的基本原理（如图1所示）：当检测体系中存在目的基因片段时，上游引物和下游引物会与目的片段结合，进行对称pcr扩增（指数扩增），产生双链产物。当上下游引物耗尽后，共有引物与双链产物的其中一条链结合，进行非对称pcr扩增（线性扩增），产生大量的单链dna产物（图1a）。所得的dna产物滴加到样品板上时，通过层析作用，先与金垫处已经包埋的纳米金探针杂交，当其到达已包埋有与dna产物互补的探针2的检测线（t线）处时，dna、纳米金探针和探针2形成“三明治结构”，就会形成一条红色的线，过量的纳米金探针继续层析，到达已包埋有探针3的控制线（c线）处时形成第二条红色的线(图1c)。

而不含目的基因片段时，检测线（t线）处因不能形成“三明治”结构的杂交产物，而没有红色的线出现，只有过量的纳米金探针继续层析，到达已包埋有探针3的控制线（c线）处时形成一条红色的线(图1c)。

若检测线（t线）和控制线（c线）处都无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）共有引物介导的非对称pcr特异性高，不易出现假阳性结果；

（2）共有引物介导的非对称pcr产物为单链，因此无需任何预处理就可以用于试纸条检测，缩短了检测时间；

（3）将共有引物介导的非对称pcr与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，结果稳定；

（4）检测速度快，特异性好，灵敏度高；

（5）设备简单，成本低，无需昂贵的仪器；

（6）探针设计简单，操作步骤简短，易于推广；

（7）本发明没有溴化已锭、同位素等有害物质的使用，没有安全隐患，使用安全。

附图说明

图1是本发明原理图，a：共有引物介导的非对称pcr扩增原理，b：试纸条各部分包埋情况，c：试纸条检测原理。

图2是基于共有引物介导的非对称pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3是13nm胶体金的吸收光谱图。

图4是基于共有引物介导的非对称pcr的试纸条检测致病疫霉结果图，阳性结果（1号试纸条）和阴性结果（2号试纸条）。

图5是基于共有引物介导的非对称pcr的试纸条检测致病疫霉灵敏度结果图，a：试纸条检测结果，b：琼脂糖凝胶电泳结果。

图6是基于共有引物介导的非对称pcr的试纸条检测致病疫霉特异性结果图，a：试纸条检测结果，b：琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

将本发明的方法应用于致病疫霉的检测。如图1所示为基于共有引物介导的非对称pcr的试纸条检测植物病原菌的原理图。实施例中所用试剂均购自北京全式金生物技术有限公司、宝生物工程（大连）有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司，试纸条材料及设备均购自上海金标生物有限公司。

实施例1检测方法的建立

（1）致病疫霉基因组dna的提取：采用hpfungaldnakit抽提致病疫霉基因组dna。

（2）引物及探针设计：根据致病疫霉的o8重复序列设计一对引物，另设计一条共有引物，再在上游引物的5’端添加一段与共有引物序列相同的序列，最后的得到的单链dna产物大小为266nt。根据扩增所得的产物来设计试纸条检测所需的探针。所用到的引物和探针如表1所示：

表1引物及探针列表

（3）非对称pcr反应：

25μl的扩增体系如表2：

表2pcr体系中各组分浓度

反应条件：95℃反应3min；接着95℃反应30s，54℃反应30s，72℃反应30s，共反应40个循环；最后72℃反应10min。

琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图2所示（m为2kmarker，c为空白对照，1为致病疫霉目的片段扩增产物），得到的产物可直接用于试纸条检测。

（4）纳米金的制备

采用柠檬酸盐还原法制备纳米金，将100ml1mm的haucl4加热沸腾，快速搅拌下迅速加入10ml38.8mm的柠檬酸钠溶液，2min内溶液颜色由金黄色→灰色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌20min，冷却至室温得到纳米金胶体溶液，用紫外吸收光谱仪测得其吸收峰在520nm左右处（图3所示），即得到13nm的纳米金胶体溶液。

（5）探针1与纳米金的连接

向pcr管中加入20μl200μm的5’端修饰有巯基的探针1，接着向pcr管中加入0.66μl500μm的醋酸缓冲液（ph5.2）和1μl10μmtcep（磷酸三氯乙酯）以活化巯基，室温、避光孵育1小时；取洁净的离心管，加入1ml10nm的纳米金胶体溶液，然后在不断的摇动下，加入tcep处理过的探针1溶液，盖上管盖，室温避光放置至少16小时，用振荡器600rpm加速反应；缓慢震荡下向管中逐滴加入20μl500mm的tris醋酸缓冲液（ph8.2），tris醋酸缓冲液的终浓度为5mm；再向管中逐滴加入200μl1mnacl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，取出离心管，纳米粒子沉积在管底，轻轻吸掉上清，用1ml包埋缓冲液（20mmna3po4，质量百分比5%bsa，体积百分比0.25%tweenx-100，质量百分比10%sucrose）重悬，用于试纸条金垫处的包埋。

（6）胶体金核酸试纸条的组装与准备

①样品板：用样品板处理缓冲液（ph8.0、体积百分比0.25%的tritonx-100，0.05mtris-hcl，0.15mnacl）浸润，置于干燥器中室温保存；

②金垫：将20μl标记好的纳米金-探针1溶液喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存；

③nc膜：用喷膜仪将6μl1mg/ml的链霉亲和素和100μm5’端修饰有生物素的探针2的混合液喷到检测线（t线）的位置，将6μl1mg/ml的链霉亲和素溶液和100μm3’端修饰有生物素的探针3的混合液喷到控制线（c线）的位置，c线和t线处划线宽度为1mm，两条线相隔6mm，包埋好探针的nc膜置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；

组装：按图1b所示结构组装，底板在最下层，nc膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于nc膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；每部分之间重叠2mm，最后切成4mm宽的条。

（7）样品准备与检测

将25μl由步骤（3）得到的dna产物与125μl检测缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，10min后，再滴加50μl检测缓冲液，15min之内读取结果。检测结果如图4所示：1号试纸条（致病疫霉阳性）在c线和t线处都形成红线，2号试纸条（空白对照）只在c线处形成红线，表明该试纸条能正确检测样品中是否含有目的基因片段，进而确定所检测植物病原菌。

实施例2致病疫霉检测灵敏度实验

分别取10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl、10fg/μl致病疫霉基因组dna，按照实施例1所建立的方法所得的检测结果如图5所示（1：10pg/μl；2：1pg/μl；3：0.1pg/μl；4：10fg/μl；5：空白对照），由图5a可知，当致病疫霉基因组dna浓度为0.1pg/μl时，试纸条上的c线和t线处都能形成明显的红线，与图5b的琼脂糖凝胶电泳结果一致，因此可以判断本发明检测目的基因具有非常好的灵敏度。

实施例3致病疫霉检测特异性实验

按照实施例1所建立的方法分别检测大豆疫霉、辣椒疫霉、恶疫霉、烟草疫霉和致病疫霉的基因组dna，检测结果如图6所示（1：大豆疫霉；2：辣椒疫霉；3：恶疫霉；4：烟草疫霉；5：空白对照；6：致病疫霉），由图6a可知，1—5号试纸条只有在c线处形成红线，6号试纸条在c线和t线都形成红线，与图6b的琼脂糖凝胶电泳结果一致，因此可以判断本发明检测目的基因具有非常好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>福建农林大学

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