用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其是用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法。
背景技术：
：随着肿瘤研究的发展，科学发现肿瘤是一种基因突变引起的慢性疾病。肿瘤的产生、发展、转移、治疗和检测，都与基因，特别是一些被称为驱动基因的突变有关。因此，肿瘤的基因检测已经成为肿瘤临床诊治中不可缺少的一环。AKT1基因位于人染色体14q32.32，基因全长26396bp，编码产物是AKT丝氨酸/苏氨酸激酶，长度为460个氨基酸。P53激酶/AKT途径是人类细胞信号中最为活跃的途径，AKT激酶是该途径的活性中心。在多种肿瘤，包括肺癌，乳腺癌，膀胱癌中都发现AKT1的基因突变rs121434592(即C49的鸟嘌呤变成了腺嘌呤，缩写为49G>A(p.Glu17Lys))导致癌细胞的过度生长，降低对药物的敏感性。因此，AKT1rs121434592基因是肿瘤诊治过程中最常见的检测突变之一。由于在肿瘤检测中，基因鉴定的方法主要是新一代基因测序法和荧光PCR方法。新一带基因测序方法能全面检测基因，甚至能发现未知的突变，但价格偏高。而荧光PCR只能检测已知的突变，但是其价格便宜。现有肿瘤检测的长期实践中，由于某些基因只是一个核苷酸突变，这种突变型和野生型的差异比较小，肿瘤基因鉴定的特异性不足是主要问题。即使科学的设计了针对某种基因的野生型和突变型的探针和引物并进行了优化，但是还可能出现低程度的交叉反应，给判断增加难度。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可准确地检测突变的AKT1基因的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：在一个方面，本发明提供了用于检测突变的人AKT1基因的荧光PCR引物，所述引物碱基序列如下：野生型AKT1引物F1：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATddW-3’(SEQIDNO.1)；突变型AKT1引物F2：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATddW-3’(SEQIDNO.2)；通用AKT1引物R1：5’-GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC-3’(SEQIDNO.3)；其中，g代表鸟嘌呤核糖核苷酸，G代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，a代表腺嘌呤核糖核苷酸，A代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，ddW代表双脱氧核糖核苷酸，W可以是A、T、C或G。应当说明的是，野生型和突变型AKT1引物F1的3’端第1个核苷酸是双脱氧核糖核苷酸，双脱氧核糖核苷酸无游离的3’羟基，不能进一步被DNA聚合酶延伸。因此，该设计能有效防止引物二聚体等非特异产物的生成，有效的降低了非特异信号。在野生型和突变型AKT1引物F1的3’端第9个核苷酸是核糖核苷酸，而不是脱氧核糖核苷酸。单独的引物并不会被深海热球菌的RNaseH2识别并结合；当引物与模板在退火温度结合并正确配对后，引物-模板复合物中的3端第9个核糖核苷酸才被深海热球菌RNaseH2识别，切割，形成了正常的引物-模板复合物，PCR的延伸反应才会起始。这两个设计有效的降低了非特异扩增，通常认为反应的特异性提高了30-100倍。在另一个方面，本发明提供了用于检测突变的人AKT1基因的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和深海火球菌的RNaseH2酶。深海火球菌(Pyrococcusabyssi)是一种嗜热的古菌，分离自北斐济2000米深的海底火山喷口。深海热球菌属于火球菌纲热球菌属，是一种厌氧的革兰氏阴性球菌，代谢硫化物为主要能源。RNaseH2是一种核糖核酸内切酶。如果一条DNA双链中某些位置是RNA，RNaseH2能识别该结构，并且从RNA分子的5’端切开，留下3’羟基游离的DNA分子和5’端磷酸基游离的RNA。在DNA聚合酶的作用下，3’羟基游离的DNA继续延伸，将后面’5端为游离RNA的核苷酸片段取代，形成完全的DNA双链。深海热球菌的RNaseH2与普通RNaseH2酶相比，能够在高温下(96℃)保持活性。基于深海热球菌的RNaseH2性质，将其应用于PCR体系中，能改善PCR体系的特异性。优选地，所述试剂盒还包括用于内控的引物，所述引物用于特异性扩增真核生物的18srDNA，所述引物序列如下：18srDNA引物F3:5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAATACaGGACddW-3’(SEQIDNO.4)；18srDNA引物R2:5’-ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC-3’(SEQIDNO.5)；由此，引物F3和R2用于监测PCR反应体系的有效性。优选地，所述试剂盒还包括对照品，所述对照品包括插入了如SEQIDNO.6所示的序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-W)和插入了如SEQIDNO.7所示序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-M)。在另一个方面，用于检测突变的人AKT1基因的方法，包括以下步骤：1)从样品中提取DNA；2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1的引物分别进行荧光PCR扩增反应获得扩增曲线；3)对扩增曲线分析，确定样品中AKT1基因的基因型。优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应体系为：其中，第一对引物为F1(SEQIDNO.1)和R1(SEQIDNO.3)，第二对引物为F2(SEQIDNO.2)和R1(SEQIDNO.3)。应当说明的是，p.a.是Pyrococcusabyssi(深海火球菌)的缩写，该细菌是从深海温泉中分离的一种古细菌，因此它的RNaseH2是一种热稳定的酶，能够在高温中将双链DNA中的RNA分子切除。p.a.RNaseH2能够在配对的双链核酸中包括DNA-RNA，RNA-RNA，切除RNA分子；而且p.a.RNaseH2酶的热稳定高，在95℃高温能保持稳定，适合应用于本申请的荧光PCR体系；进而，在PCR扩增时，只有当引物正确结合上模板，并且被p.a.RNaseH2切割下RNA及其后面的多个脱氧核苷酸后，引物才能延伸，有效防止引物二聚体的形成和其他非特异扩增的形成。优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃延伸30s；循环50次。优选地，所述步骤2)中荧光PCR还包括作为对照的6组PCR体系，其根据模板和引物对的不同分为：a组：模板PUC57-AKT1-W、引物F1、引物R1；b组：模板PUC57-AKT1-W、引物F2、引物R1；c组：模板PUC57-AKT1-W、引物F3、引物R2；d组：模板PUC57-AKT1-M、引物F1、引物R1；e组：模板PUC57-AKT1-M、引物F2、引物R1；f组：模板PUC57-AKT1-M、引物F3、引物R2。应当说明的是，6组PCR体系与样品DNA的PCR体系区别仅在于模板和引物，其他试剂相同。优选地，所述步骤2)中扩增曲线的具体分析过程为：当作为内控信号的c组或f组的荧光PCR扩增曲线形成正常对数扩增“S”型曲线时，1)如果一个样品在采用引物对F1和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，则该样本含有野生型AKT1；2)如果一个样品在采用引物对F2和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，则该样本含有突变型AKT1。综上所述，本发明的有益效果为：本发明采用依赖RNaseH2酶的荧光PCR方法，同时对引物进行非常规设计以提高PCR反应的特异性，从而使得采用本申请的荧光PCR引物及方法可以精确地扩增出AKT1基因的序列，从而判断样品中AKT1基因的基因型，为肿瘤的诊断和治疗提供强有力的支持。附图说明图1为PCR体系中加入热火球菌RNaseH2的质粒PUC57-AKT1-W质粒和PUC57-AKT1-M的荧光PCR扩增曲线；图2为PCR体系中未加入热火球菌RNaseH2的质粒PUC57-AKT1-W和PUC57-AKT1-M的扩增结果；图3为肿瘤患者A的组织扩增曲线，其中，引物F1/R1，引物F3/R1都有典型扩增曲线，并且引物F2/R1也有典型扩增曲线，说明A组织中含有AKT1基因突变的肿瘤细胞；图4为肿瘤患者B的组织扩增曲线，其中，引物F1/R1，引物F3/R1都有典型扩增曲线，单引物F2/R1没有典型扩增曲线，说明B组织中无AKT1基因突变的肿瘤细胞。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI7500或BioRadCFX96。实施例1.引物和对照品的制备(1)引物根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)的核酸序列数据库GeneBank公开的人类AKT1基因的参考序列(NG_012188.1)，采用ABI公司的PrimerEWpress3.0软件分别设计检测人特异的AKT1基因引物。AKT1引物，具体如下：野生型正向引物AKT1-F1:5’-CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATddW-3’(SEQIDNO.1)；突变型反向引物AKT1-F2:5’-CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATddW-3’(SEQIDNO.2)；通用反向引物：AKT1-R1:5’-GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC(SEQIDNO.3)；(2)内控引物为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取真核生物保守基因18srDNA(其参考序列编号为：NR_003278.3)，分析其保守序列，采用ABI公司的PrimerExpress3.0软件设计检测引物，具体序列如下所示：内控引物对：正向引物18srDNA-F3:5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAATACaGGACddW-3’(SEQIDNO.4)；反向引物18srDNA-R2:5’-ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC-3’(SEQIDNO.5)；其中，引物AKT1-F1和AKT1-F2的序列中，大写字母表示脱氧核糖核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，ddW表示双脱氧核糖核苷酸，可以是四种常见双脱氧核糖核苷酸的一种，例如ddA、ddT、ddC或ddG。(3)对照品—质控质粒根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的人类AKT1基因的参考序列(NG_012188.1)，分布设计野生型和突变型的序列，插入PUC57质粒中，分别得到PUC57-AKT1-W和PUC57-AKT1-M。AKT1基因扩增的野生型片段序列：AKT1基因扩增的突变型片段序列：其中，加粗且有下划线的碱基序列分别是引物AKT1-F1和AKT1-F2所靶向的序列；加粗且倾斜的序列是引物AKT-R1靶向的位置；加粗、有下划线且倾斜的碱基分别是AKT1野生型和突变型变异的相对应位点。实施例2引物和质控质粒序列的制备将设计好的实施例1的引物及质控质粒序列(SEQIDNO.6和7)交由基因合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。实施例3rh-PCR(RNaseH酶依赖的PCR)检测试剂盒本发明的用于检测突变的人AKT1基因的试剂盒的一种实施例，包含PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP、SYBRGreenI等物质外，还包含检测引物\内控引物，其具体组成如下表1所示。表1rh-PCR检测试剂盒的组成编号试剂1Tris-HCl(pH＝8.4)2KCl3MgCl24dNTPs5TritonX1006SYBRGreenI7TaqDNApol8p.a.RNaseH29上游引物10下游引物上述各特异性检测的PCR反应涉及的引物的序列信息如下：野生型正向引物AKT1-F1:5’-CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATdW-3’(SEQIDNO.1)；突变型反向引物AKT1-F2:5’-CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATdW-3’(SEQIDNO.2)；通用反向引物AKT1-R1:5’-GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC-3’(SEQIDNO.3)；其中，F1和R1组成第一对引物，F2和R1组成第二对引物。内控引物包括：正向引物18srRNA-F3:5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAATACaGGACddW-3’(SEQIDNO.4)；反向引物18srRNA-R2:5’-ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC-3’(SEQIDNO.5)。实施例4检测p.a.RNaseH2对PCR扩增效果的影响试验步骤：第一步：准备DNA1、将合成的质粒PUC57-AKT1-W和PUC57-AKT1-M转入大肠杆菌DH5a，筛选成功的转化子。2、用LB过夜培养菌株PUC57-AKT1-W/DH5a和PUC57-AKT1-M/DH5a，提取质粒DNA，推荐使用商业化的试剂盒；3、测定质粒DNA浓度和纯度，要求浓度调整为107copies/μl。4、将四种肉做10倍倍比稀释，共7个浓度。第二步：PCR反应体系配制将实验分为两组，第1组使用p.a.RNaseH2,第2组不使用p.a.RNaseH2；对于第1组，在荧光定量PCR专用的管子内按照下表2配制PCR反应体系。表2PCR反应体系组成试剂终浓度Tris-HCl(pH＝8.4)20mMKCl50mMMgCl23.0mMdNTPs0.8mMTritonX1000.01％SYBRGreenI0.01％TaqDNApol0.5Up.a.RNaseH20.5mU/μl质粒2ul上游引物200nM下游引物200nM总体积10μl第2组不添加p.a.RNaseH2，其余成分的最终浓度同表2。选用PUC57-AKT1-W质粒和PUC57-AKT1-M作为模板，浓度为104copies/μl进行检测，分别用质粒自己的特异性引物扩增。PUC57-AKT1-W质粒采用AKT1-F1和AKT1-R1，PUC57-AKT1-M采用AKT1-F2和AKT1-R1。这样，一共有4组荧光PCR体系：a组：模板PUC57-AKT1-W、引物F1、引物R1，含有p.a.RNaseH2；b组：模板PUC57-AKT1-M、引物F2、引物R1，含有p.a.RNaseH2；c组：模板PUC57-AKT1-W、引物F1、引物R1，无p.a.RNaseH2；d组：模板PUC57-AKT1-M、引物F2、引物R1，无p.a.RNaseH2。第三步：上机检测按照下表3设置温度循环及信号采集程序：表3.PCR反应程序第四步：分析结果在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，加入待检测的样品DNA,分别采用引物对F1和R1、引物对F2和R1进行扩增。对于使用p.a.RNaseH2的a组和b组，均形成正常对数扩增“S”型曲线(见图1)，未使用p.a.RNaseH2的c组和d组，无扩增曲线形成(见图2)。说明本试剂盒中，由于引物的特殊设计，无法在正常条件下形成PCR扩增反应；只有p.a.RNaseH2存在时且在一定条件下，切割了3‘端为双脱氧寡核苷酸的引物，才能形成正常的PCR扩增反应。由此，在本发明中，必须使用p.a.RNaseH2，才能够完成荧光PCR。实施例5对临床样本的扩增第一步：样本准备，1、样本准备，肿瘤患者A和B的DNA，来自于病理组织切片，经高通量测序已经证明，样本A含有rs121434592G→A的突变位点(即位点rs121434592突变为A)，样本B不含有该突变位点，属于野生型。(备注：，由于该位点突变在整个肿瘤中出现的频率并不高，这里选择已知该位点信息的肿瘤样品)；2、阳性参考品使用实施例4中制备的质粒PUC57-AKT1-W质粒和PUC57-AKT1-M，浓度为104copies/μl。第二步：PCR反应体系配制1、PCR反应体系同实施例4中第一组。2、样本分组，参见下表3表4、样本分组序号名称模板引物1阳性对照1PUC57-AKT1-WF1和R12阴性对照1PUC57-AKT1-WF2和R13阳性对照2PUC57-AKT1-MF1和R14阴性对照2PUC57-AKT1-MF2和R15空白对照1超纯水F1和R16空白对照2超纯水F2和R17空白对照3超纯水F3和R18测试1患者A的DNAF1和R19待测2患者A的DNAF2和R110待测3患者A的DNAF3和R211测试4患者B的DNAF1和R112待测5患者B的DNAF2和R113待测6患者B的DNAF3和R2第三步：上机检测同实施例4。第四步：分析结果前面7组参考品的检测结果，出现表5的扩增曲线，则可进行下一步实验判断：表5：对照组的正常结果序号名称熔解曲线1阳性对照1正常对数扩增“S”型曲线2阴性对照1无信号或Ct值小于383阳性对照2正常对数扩增“S”型曲线4阴性对照2无信号或Ct值小于385空白对照1无信号6空白对照2无信号7空白对照3无信号基于表5的正常结果，对测试样本进行判断，判断结果见表6。表6测试样本的判断标准结果判断：结合表6，可以对A组织和B组织的基因型作出判断，具体判断的过程如下：1)如果任何样品，在采用引物对F3和R2的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，则表明该样本的体系正确。2)如果一个样品，在采用引物对F1和R1的荧光PCR反应体系内，以及采用引物对F2和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号均形成对数扩增“S”型曲线，则表明该样本含有突变型的AKT1基因(见图3)。3)如果一个样品，在采用引物对F1和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号均形成对数扩增“S”型曲线；采用引物对F2和R1的荧光PCR反应体系内，荧光信号无，或者极低，则表明该样本只含有野生型的AKT1基因(见图4)。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。SEQUENCELISTING<110>星阵（广州）基因科技有限公司<120>用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法<130>2017<160>7<170>PatentInversion3.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1cccgcacgtctgtaggggagtacatw26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2cccgcacgtctgtagggaagtacatw26<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3ggagcctcacgttggtccacatc23<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtagtgacgaaaaataacaatacaggacw30<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5atacgctattggagctggaattacc25<210>6<211>168<212>DNA<213>智人<400>6gtctgacgggtagagtgtgcgtggctctcaccacccgcacgtctgtaggggagtacatca60agacctggcggccacgctacttcctcctcaagaatgatggcaccttcattggctacaagg120agcggccgcaggatgtggaccaacgtgaggctcccctcaacaacttct168<210>7<211>168<212>DNA<213>智人<400>7gtctgacgggtagagtgtgcgtggctctcaccacccgcacgtctgtagggaagtacatca60agacctggcggccacgctacttcctcctcaagaatgatggcaccttcattggctacaagg120agcggccgcaggatgtggaccaacgtgaggctcccctcaacaacttct168当前第1页1 2 3