一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用与流程

本发明属于微生物检测技术领域，涉及针对单增李斯特菌的恒温扩增快速检测技术，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用。

背景技术：

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)广泛存在于自然界中，易污染肉类、奶类、海产品和蔬菜等，由于其易形成生物被膜，使它在食品中存活更长的时间。世界卫生组织在有关食物中毒报告中指出4％一8％的海产品、5％一10％的奶及制品和30％以上的肉制品存在单增李斯特菌污染。而且，由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖，使潜在的危害性进一步增大。食用被单增李斯特菌污染的食物除了会出现恶心、败血、腹泻等一般细菌性食物中毒症状外，还会导致心肌炎、脑膜炎、肠胃炎和肺炎等。在1986年WHO和FDA设立了李斯特菌研究中心，专门协调该菌的病原学、流行学及临床等研究工作，该菌已被列为90年代四大食品致病菌之一。在欧美、日本由单增李斯特菌造成的临床疾病和食物污染问题，在细菌性食物中毒中占第一位。因此现在世界各国都把单增李斯特菌列为食品卫生的法定检测项目。

目前单增李斯特菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。细菌分离鉴定工作量大，成本较低，但检测周期长，灵敏度低；免疫学方法易交叉污染，假阳性严重，灵敏度偏低；分子生物学方法应用最广泛的是PCR，但操作繁琐耗时，必须依赖昂贵的实验设备，不便于在基层或现场检测进行推广。

近年来，重组酶聚合酶(RPA)方法受到关注，该方法是一种新型核酸扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，被认为是最接近所谓的“等温扩增”，具有广阔的应用前景。胶体金试纸条(LF)最大的特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到的检测结果。

通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：

选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

而且，所述引物对为：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。

而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin标记。

而且，所述胶体金试纸条包括背板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处(部分)重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。

而且，所述背板为带有不干胶的衬垫。

而且，所述金标垫的制备步骤如下：

⑴制备胶体金

根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：

将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；

⑵胶体金标记抗体

取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG 20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫原板上，真空干燥过夜，即得带有胶体金标记抗体的金标垫。

而且，具体步骤如下：

⑴RPA反应体系：

10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol乙酸镁，2.5μL，反应总体积50μL；

⑵RPA反应体系扩增：

向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，39℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；

⑶试纸条检测：

取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；

当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在单增李斯特菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在单增李斯特菌；若质控线未出现条带，结果无效。

一种如上所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法在单增李斯特菌的检测中的应用。

本发明取得的优点和积极效果是：

1、本方法快速简便，特异性强，灵敏度高，可重复性高，该方法在39℃下恒温扩增仅需10分钟，胶体金试纸条检测结果5分钟以内，检测结果肉眼观察，整个反应过程不需要昂贵实验仪器，只需一个恒温仪器，可以应用于偏远、资源贫乏地区和现场检测。该方法有望成为简易的常规检测手段，对保证食品安全有重要意义。

2、本发明提供的基于分子生物学的快速检测单增李斯特菌的方法，可以实现对单增李斯特菌进行快速，灵敏，简便的快速检测，该方法能够在检验检疫方面、食品工业部及卫生安全部有广阔的应用前景。

3、本发明方法简便，快速，在20min内即可完成检测，结果可用肉眼观察；整个扩增过程只需39℃恒温，不需要复杂的仪器，使用范围广泛。

附图说明

图1为本发明中胶体金试纸条的检测试纸条工作原理、组装方法及结构连接示意图；

图2为本发明方法优化温度与时间的结果图；其中，图a中的1-8分别依次表示25℃，30℃，35℃，37℃，39℃，42℃，45℃和阴性对照，图b中的1-6分别依次表示5min，10min，15min，20min，25min和阴性对照；

图3为本发明方法优化羊抗鼠二抗和链霉亲和素浓度图；其中，图a中1-4分别依次表示0.1、0.5、0.8、1mg/mL的不同羊抗鼠二抗浓度，图b中1-4分别依次表示0.5、1.0、1.5、2mg/mL的不同链霉亲和素浓度；

图4为本发明方法检测单增李斯特菌的特异性结果图；

图5为本发明方法检测单增李斯特菌的灵敏度结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：

根据单增李斯特菌保守区hlyA(GenBank:AF253320.1)设计特异性引物序列，选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

具体地，所述引物对为：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。

具体地，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin标记。

具体地，所述胶体金试纸条包括背板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处部分重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。

具体地，所述背板为带有不干胶的衬垫。

具体地，所述金标垫的制备步骤如下：

⑴制备胶体金

根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：

将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；

⑵胶体金标记抗体

取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG 20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。

较优地，所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，体步骤如下：

⑴RPA反应体系：

10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol乙酸镁，2.5μL，反应总体积50μL；

⑵RPA反应体系扩增：

向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，39℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；

⑶试纸条检测：

取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；

当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在单增李斯特菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在单增李斯特菌；若质控线未出现条带，结果无效。

本发明所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法可以应用在单增李斯特菌的检测中。

本发明方法的优化时间与温度的优化：

(1)根据DNA提取试剂盒说明书提取DNA；

取细菌培养液1mL，10000rpm，1min,弃上清、加入180μL终浓度为20mg/mL溶菌酶，37℃处理30min以上；加入20μL蛋白酶K溶液混匀；加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心除去管壁水珠；加入220μL无水乙醇，震荡15s，简短离心除去管壁水珠；将上一步所得溶液和沉淀移至吸附柱CB3中，12000r/min，30s，弃上清，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱中加入500μL缓冲液GB，12000r/min，30s，弃上清，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min，30s，弃上清，将吸附柱CB3放回收集管中；重复两次。吸附柱CB3放回收集管中，加入500μL缓冲液GB，12000r/min，30s，弃上清，将吸附柱CB3放回收集管中，向吸附膜中间部位滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000r/min,2min,收集至离心管中，-20℃保存。提取的DNA用酶标仪检测其OD值，判断DN A的质量(OD260有显著吸收峰，OD260/OD280值在1.7-1.9间)。

(2)RPA反应体系

体系包括2.4μL各引物(10μM)，29.5μL1×补液缓冲液，10.7μLddH2O，2.5μLDNA，重组酶聚合酶，迅速振荡混匀，最后加入2.5μL乙酸镁，放入水浴锅中反应。设置反应温度为25℃，30℃，35℃，37℃，39℃，42℃和45℃，反应时间分别为5min，10min，15min，20min和25min。取100μLRPA产物，900μLPBS(PBS+0.05％Tween 20)，将二者混匀，将1000μL混合物滴加在试纸条上，室温下静置5min，观察结果。

正向引物：5’—digoxin—GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG—3’

反向引物：5’—biotin—ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA—3’

所有引物由江苏金唯智公司合成。

阴性对照：无菌双蒸水。

对RPA的反应时间和温度进行优化，结果显示扩增最佳温度为39℃，反应时间仅需10min即可检测，如图2所示，图2a中的1-8分别表示25℃，30℃，35℃，37℃，39℃，42℃，45℃和阴性对照，图2b中的1-6分别表示5min，10min，15min，20min，25min和阴性对照。上述实施例1结果说明，用本发明的方法整个检测仅需要15min左右就能完成，大大缩短检测时间。

较优地，本发明制备胶体金试纸条的方法可以如下：

1)制备胶体金

根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分。取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min。溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，4℃避光保存。

2)胶体金标记抗体

取1mL上述的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度20％的BSA溶液、混合后溶液总体积1％的质量浓度20％的PEG20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混匀后的溶液于4℃静置30min；2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。

3)NC膜包被质控线和检测线抗体

该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫、胶体金结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，检测线上有链霉亲和素包被，质控线上有羊抗鼠抗体。确定包被C线上的羊抗鼠抗体稀释为0.1、0.5、0.8、1mg/mL和包被在T线的链霉亲和素浓度，用PB缓冲液稀释其浓度梯度分别为0.5、1.0、1.5、2mg/mL，利用划膜仪在NC膜上按照1μL/cm划出C、T线，37℃过夜干燥备用。根据显色结果分析不同稀释条件组合其检测线的颜色强度、稳定性、显色时间、节约成本等因素，选择最合适的羊抗鼠二抗和链霉亲和素浓度。结果显示0.1mg/mL羊抗鼠二抗和2mg/mL链霉亲和素分别作为C线和T线时，条带清晰，稳定性好。如图3所示，图3a中1-4分别表示0.1、0.5、0.8、1mg/mL的不同羊抗鼠二抗浓度，图3b中1-4分别表示0.5、1.0、1.5、2mg/mL的不同链霉亲和素浓度。

本发明方法检测单增李斯特菌的特异性：

按照本发明方法检测单增李斯特菌ATCC 19115，格氏李斯特菌CICC 21494，斯氏利斯特菌CICC 10867，单增李斯特菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 10305，产气肠杆菌CICC 10293，霍乱沙门氏菌CICC 21494以及阴性对照，结果显示本发明的检测方法具有良好特异性，除单增李斯特菌ATCC 19115，其他菌种检测均为阴性。如图4所示，图中1-8分别依次表示单增李斯特菌ATCC 19115，格氏李斯特菌CICC 21494，斯氏利斯特菌CICC 10867，单增李斯特菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 10305，产气肠杆菌CICC 10293，霍乱沙门氏菌CICC 21494以及阴性对照。

本发明方法检测单增李斯特菌的灵敏度：

对单增李斯特菌基因组DNA进行定量，分别稀释至浓度3ng，300pg，30pg，3pg，300fg，30fg采取本发明方法来确定检测单增李斯特菌的灵敏度。结果如5所示，图中1-7分别依次表示3ng，300pg，30pg，3pg，300fg，30fg和阴性对照的实验结果，可以发现本方法检测限为300fg，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测单增李斯特菌的要求。