本申请要求2016年1月22日提交的美国系列号62/286,269和2016年2月3日提交的美国系列号62/290,745的优先权，其全部内容并入本公开中。本公开内容涉及对程序性细胞死亡1(pd-1)(例如，人pd-1)具有特异性的结合剂以及使用其治疗和/或预防感染(例如，由人免疫缺陷病毒(hiv)引起的感染)、癌症和/或自身免疫的方法。
背景技术：
：：随着我们进入hiv流行病的第四个十年，在了解hiv发病机理和开发有效和安全的抗病毒药物方面已经取得了重大进展。已经注册了超过30种抗病毒药物并且组合抗逆转录病毒疗法(art)对于发病率和死亡率的影响已经是卓越的。但是，尽管在对art有最佳依从性的患者中实现了hiv复制的长期抑制，但是在治疗中断后hiv不可避免地出现反弹。此外，成功的疗法不会诱导或允许恢复/发展病毒特异性免疫应答，该病毒特异性免疫应答能够在没有art的情况下控制hiv复制。因此，大部分hiv感染主体(subject)需要终身art以控制的hiv复制和相关的疾病。已经在血液中鉴定出由hiv潜在感染的一群长期存活的中枢记忆cd4t细胞，其作为hiv细胞库的重要组成部分并且是hiv持久性的主要原因。在存在以art完全抑制hiv的情况下，该潜伏细胞库的寿命估计约为70年。但是，最近的研究已经表明存留在淋巴结中的两个cd4t细胞群用作hiv感染、复制和产生的主要cd4t细胞区域。这两个cd4t细胞群由pd-1和cxcr5的表达定义，并且包括pd-1+cxcr5+(即滤泡辅助性t细胞(tfollicularhelpercells)(tfh))和pd-1+cxcr5-cd4t细胞群。已经提出了很多负责建立和维持hiv潜伏细胞库的机制。一种机制是在art下持续的最小病毒复制，其可以补充hiv细胞库。因此，art不能诱导完全抑制hiv复制，并且在art下的“天然”hiv-1特异性免疫应答也不能完全抑制和消除正在进行的残留病毒复制。art和hiv特异性免疫应答的失败提供了研究另外的干预以同样靶向持续的hiv细胞库的根据。过去已经研究了许多免疫干预，并且目前正在进一步开发以实现hiv功能治愈的目标，其中在没有持续抗病毒治疗的情况下抑制病毒复制(9)。治疗性疫苗策略已经成为研究的主要干预策略，但结果显示在实验动物模型和患者中效果不太好(modest)，除了基于cmv的载体hiv疫苗(nhp模型中50％的效力；10)。最近的研究已经产生了关于使用抗包膜广谱中和抗体(bnabs)作为hiv感染治疗剂的可能性的令人感兴趣的结果(11，12)。此外，拮抗剂pd-1abs已经显示在hiv感染患者中恢复t细胞功能，并且已经提出使用这些abs作为治疗策略，以增强hiv特异性t细胞应答效力的可能性(13，14)。众所周知，浸润肿瘤特异性cd8t细胞在增殖和介导细胞毒活性的能力方面，它们是功能失调的。大部分浸润肿瘤特异性cd8t细胞处于所谓的耗竭(exhaustion)功能状态。负责浸润肿瘤特异性cd8t细胞耗竭的主要机制是许多调节受体特别是pd-1调节受体的表达增加。pd-1/pdl-1/2(pd-1配体)的阻断与cd8t细胞从耗竭中恢复相关的观察已经为开发靶向耗竭的cd8t细胞表达的pd-1分子的干预策略提供了理论基础。最近的研究使用具有拮抗活性的pd-1抗体在患有晚期癌症相关疾病的患者中显示出了非常有希望的结果。研究显示出在患有晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾癌的患者中大幅的应答比例，范围从18％至40％。这些研究中的抗pd-1抗体可单独使用或与抗ctl-a4抗体组合使用。在这些初步研究之后，目前的研究正在患有包括血液肿瘤的各种肿瘤的患者中进行。本领域需要用于靶向pd-1的其它试剂及其使用方法。本公开内容通过提供可用于靶向pd-1和表达其的细胞和/或组织的试剂和方法解决了这些需要。附图说明图1.抑制pd-1/pd-l1相互作用的抗体浓度响应曲线(图a-c)。图2.来自残基33至149的pd-1蛋白胞外域的结构表示。涉及与pd-l1或pd-l2相互作用的氨基酸位于结构上，通过具有残基编号的紫色圆圈指示(残基编号涉及seqidno.275(图3h))。图3.a.人pd-1胞外域的氨基酸序列。31个突变(m1至m31)中的每一个突变指示了氨基酸取代针对的残基。紫色文本中的残基对应于涉及pd-1/pd-l1相互作用的氨基酸，绿色的天冬酰胺残基是n-连接糖基化的潜在位点。b-g.修饰的pd-1多肽。h.人pd-1氨基酸序列(seqidno.275)。i.猴pd-1氨基酸序列。图4.阻断和非阻断抗pd-1抗体与在瞬时转染的hela细胞表面表达的经修饰的pd-1蛋白m13、m14和m23(野生型(wt)对照(seqidno.275))的结合。图5.阻断和非阻断抗pd-1抗体与在瞬时转染的hela细胞表面表达的经修饰的pd-1蛋白m13、m23和m4(野生型(wt)对照(seqidno.275))的结合。图6.阻断和非阻断抗pd-1抗体与在瞬时转染的hela细胞表面表达的经修饰的pd-1蛋白m31、m5和m18(野生型(wt)对照(seqidno.275))的结合。图7.阻断和非阻断抗pd-1抗体与在瞬时转染的hela细胞表面表达的经修饰的pd-1蛋白m1、m9、m13、m17、m18、m23和m28(野生型(wt)对照(seqidno.275))的结合。图8.阻断和非阻断抗pd-1抗体与在瞬时转染的hela细胞表面表达的经修饰的pd-1蛋白m17、m30和m26(野生型(wt)对照(seqidno.275))的结合。图9.与pd-1上不同表位结合的两种拮抗性抗pd-1抗体的组合，一种阻断而一种非阻断pd-1/pd-l1相互作用，导致功能耗竭的缓解加强和hiv特异性cd8t细胞的增殖增加超过单独的抗体可以实现的。图10.单个拮抗性抗pd-1抗体和结合pd-1上的不同表位的两种拮抗性抗pd-1抗体的组合导致在混合淋巴细胞反应试验中pd-1+记忆cd4t细胞的增殖增强(a)和ifnγ产生增强(b)。图11.p1(a)和p2(b)进化保守的pd-1块片(patch)的结构示意，以及来自不同物种的pd-1胞外域氨基酸序列的比对(c)。图12.对活化的cd4+t细胞上的细胞表面pd-1的抗体竞争性结合研究。图13a-b.使用定点诱变和抗体竞争结合结果的组合对结合pd-1结构的抗体结合位点的表位作图。图14a-b.相对于单独使用抗pd-1抗体或igg对照抗体，在用抗pd-1adc处理后，来自病毒血症hiv感染供体的pd-1高cd4t细胞中选择性增加细胞死亡(aqua染色(图a))或细胞凋亡(膜联蛋白v染色(图b))。图15.抗pd-1抗体药物缀合物(adc)处理导致来自多个不同的病毒血症hiv感染的供体的pd-1高cd4+t细胞中的细胞凋亡(膜联蛋白v染色)和/或细胞死亡(aqua染色)增加。在用单独的抗pd-1抗体或igg1对照抗体处理的对照样品中观察到低的细胞死亡/凋亡。图16.评估抗pd-1抗体药物缀合物(adc)介导杀灭来自慢性感染的hiv供体的pd-1阳性感染的cd4+t细胞。在抗体处理5天后，将细胞用于定量病毒过度生长(outgrow)测定以监测不同处理的样品中感染细胞的数量。图17.一组人源化抗体的功能活性，所述人源化抗体含有来自137f2阻断(pd-1/pd-l1相互作用(a35795、a35796、a35797、137f2嵌合体))和135c12非阻断pd-1/pd-l1相互作用(a35774、a35783、a35789、a346443、135ch2l2、135ch1cl1c、135ch1cl1b、135c12嵌合体)抗pd-1抗体的重链和轻链可变cdr环，在功能耗竭恢复试验中在hiv肽特异性cd8t细胞增殖的修复方面显示出与mk3475相当的拮抗活性。图18.结合pd-1上不同表位的两种拮抗性抗pd-1抗体的组合，一种阻断(mk3475或a35795)而一种非阻断(a35774)pd-1/pd-l1相互作用，所述组合导致功能耗竭的缓解增强和hiv特异性cd8t细胞增殖的增加超过单独的抗体可以实现的。图19.结合pd-1上不同表位的两种拮抗性抗pd-1抗体的组合，一种阻断(mk3475)而一种非阻断(135ch1cl1b或135ch1cl1c)pd-1/pd-l1相互作用，所述组合导致功能耗竭的缓解增强和hiv特异性cd8t细胞增殖的增加超过单独的抗体可以实现的。图20.用瞬时转染的293t细胞系刺激jurkatpd-1nfat报告细胞系，所述293t细胞系表达tcr活化剂和pd-l1蛋白。a.mk3475和a35774。b.mk3475和135ch1cl1c。图21.在阻断、非阻断抗pd-1抗体，或阻断和非阻断抗pd-1抗体的组合与来自慢性感染的hiv供体的记忆t细胞孵育后，细胞表面pd-1内化。在抗体处理后的不同时间点测量记忆cd4+t细胞(图20，图a、c和e)和cd8+t细胞(图20，图b、d和f)上的pd-1的细胞表面水平。图22.来自具有高基础水平pd-1的记忆t细胞的慢性感染hiv供体的pbmc与阻断(mk3475)、非阻断(a35774)，或阻断和非阻断抗pd-1抗体的组合(a35774和mk3475)一起孵育，然后在存在或不存在pd-l1的情况下用tcr活化细胞刺激24小时。在用表达pd-l1的tcr活化细胞刺激时，组合的阻断和非阻断抗pd-1抗体的处理导致细胞培养基(a)和与pd-1+cd8t细胞相关的细胞内ifn-γ(b)的ifn-γ水平增加。图23.hpd-1/faba35774复合蛋白质晶体。a.a35774的重链和轻链cdr环与人pd-1蛋白质相互作用。b.用人pd-l1(pdb4zqk)进行的hpd-1/faba35774结构的建模证实，与pd-l1相比，非阻断抗pd-1抗体结合pd-1上的不同的非重叠表位。图24.在pd-1hugemm小鼠中进行体内功效研究，以评估人源化igg4非阻断抗pd-1抗体(135ch1cl1c)、阻断抗pd-1抗体keytruda(mk3475)或135ch1cl1c+keytruda的组合的治疗潜力。(a)给出了媒介(vehicle)对照小鼠相对于不同抗体处理的mc38细胞的平均肿瘤体积。(b)与单独的媒介对照相比，抗体处理的肿瘤生长的平均抑制百分比。(c)每个抗pd-1处理组中表现出植入的mc38肿瘤完全缓解的小鼠的百分比。图25.a.137f2可变重(vh)链。b.137f2可变轻(vl)链。c.135c可变重(vh)链。d.135c可变轻(vl)链。技术实现要素：本公开内容涉及对于程序性细胞死亡1(pd-1)(例如，人pd-1)具有特异性的结合剂和使用其的方法，比如治疗、预防和/或减轻感染(例如，由人免疫缺陷病毒(hiv)引起)、癌症和/或自身免疫病和/或神经退行性病症。也提供了鉴定与pd-1相互作用的结合剂的功能试验。也提供了结合剂，比如阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合剂与不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合剂的组合，其协同用于挽救(rescue)t细胞避免耗竭。具体实施方式本公开内容涉及体外和/或体内结合细胞表面上的程序性细胞死亡(pd-1)蛋白质(例如，美国专利号5,698,520(honjo等)的seqidno:1，图1a、图1b，该专利通过引用将其整体并入本文)(例如，人pd-1)的结合剂。结合剂通常也可以在体外结合分离的pd-1多肽(例如，人pd-1)和/或其片段和/或衍生物。也提供了使用这种结合剂诊断、治疗、预防和/或减轻与存在表达pd-1的细胞相关的一种或多种疾病的方法。例如，结合剂可以是可与pd-1的表位作用和/或结合的抗体(例如，单克隆抗体)。本文所述的“结合剂”可包括例如pd-1的激动剂或拮抗剂。激动剂结合剂是通常不能恢复t细胞功能和/或表达pd-1的结合剂。激动剂pd-1结合剂可用于治疗自身免疫性疾病和其中pd-1表达细胞参与疾病进展的其它疾病。相反，拮抗剂结合剂是能够恢复t细胞功能和/或减少pd-1的细胞表面表达的结合剂。例如，pd-1拮抗剂结合剂可能够从如已知在hiv感染和各种肿瘤中出现的功能耗竭中恢复pd-1表达t细胞的功能。t细胞功能的恢复可通过例如测量这种细胞的增殖、细胞因子产生、细胞毒活性或其它特征来确定。本文所述的结合剂的另一用途是选择性靶向和消除包含有复制能力的hiv的感染hiv的cd4+t细胞群(例如，在潜伏和/或复制状态)。已知这种表达pd-1的pd-1表达细胞用作有复制能力的hiv的主要细胞库。用于消除这些cd4+t细胞群的潜在机制是使用本文所述的结合剂(例如，单特异性pd-1抗体和/或双特异性pd-1抗体)的抗体依赖性细胞毒性(adcc)。在一些实施方式中，可以组合具有例如不同特异性(例如，识别不同的表位)的一种或多种pd-1拮抗结合剂，以诱导挽救抗原特异性cd8+t细胞避免由那些细胞中的pd-1表达造成的功能耗竭(例如，恢复或改善增殖、细胞因子产生和/或细胞毒活性)。在一些实施方式中，也可提供本文所述的结合剂用于选择性消除和/或抑制pd-1表达细胞。在一些实施方式中，本文所述的pd-1激动剂或拮抗剂结合剂可用于抑制和/或消除pd-1表达细胞，以治疗，例如，传染病(例如，hiv)、癌症和/或，尤其，自身免疫病症。下面描述了其它实施方式、用途等。结合剂可以是抗体比如单克隆抗体，其可以包括例如表1中显示的任何一种或多种氨基酸序列(和/或其一个或多个片段和/或衍生物)。本公开内容也提供了这种单克隆抗体分离、鉴定和/或靶向表达pd-1的细胞的用途。在某些实施方式中，这些单克隆抗体可以对在细胞的表面上表达的pd-1是有反应性的。术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”可以指未纯化形式或部分纯化形式(例如，杂交瘤上清液、腹水、多克隆抗血清)或纯化形式的完整抗体或片段化抗体。抗体可以具有任何适当的来源或形式，包括例如鼠源的(例如，通过鼠杂交瘤细胞产生)，或作为人源化抗体、嵌合抗体、人抗体等表达的。例如，抗体可全部或部分源自例如人(例如，igg(igg1、igg2、igg2a、ig2b、igg3、igg4)、igm、iga(iga1和iga2)、igd和ige)、犬(例如，igga、iggb、iggc、iggd)、鸡(例如，iga、igd、ige、igg、igm、igy)、山羊(例如，igg)、小鼠(例如，igg、igd、ige、igg、igm)，和/或猪(例如，igg、igd、ige、igg、igm)、大鼠(例如，igg、igd、ige、igg、igm)抗体。制备、利用和储存各种类型的抗体的方法是本领域技术人员熟知的并且可适当地在本发明中实施(参见，例如，harlow等antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,1988；harlow等usingantibodies:alaboratorymanual,portableprotocolno.1,1998；kohler和milstein,nature,256:495(1975))；jones等nature,321:522-525(1986)；riechmann等nature,332:323-329(1988)；presta(curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)；verhoeyen等(science,239:1534-1536(1988)；hoogenboom等，j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等，j.mol.biol.,222:581(1991)；cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77(1985)；boerner等，j.immunol.,147(1):86-95(1991)；marks等，bio/technology10,779-783(1992)；lonberg等，nature368856-859(1994)；morrison，nature368812-13(1994)；fishwild等，naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger，naturebiotechnology14,826(1996)；lonberg和huszar，intern.rev.immunol.1365-93(1995)；以及美国专利号4,816,567、5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和9,090,994b2)。在某些应用中，抗体可包含在杂交瘤上清液或腹水中并且就此直接使用或使用标准技术浓缩之后使用。在其它应用中，可使用例如盐分级分离(saltfractionation)和离子交换色谱，或使用蛋白质a、蛋白质g、蛋白质a/g，和/或蛋白质l，和/或共价结合至固体载体比如琼脂糖珠的其它配体的亲和性色谱或这些技术的组合，将抗体进一步纯化。抗体可以任何适当的方式储存，包括作为冻干制剂(例如，-20℃或-70℃)，以冻干形式，或在通常的冷藏条件下(例如，4℃)储存。例如，当以液体形式储存时，优选地使用适当的缓冲液比如tris缓冲盐水(tbs)或磷酸盐缓冲液(pbs)。在一些实施方式中，结合剂可制备为可注射的制剂，比如在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮液。可使用的适当的媒介和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液、tbs和/或pbs等等。可适于体外或体内使用的这种制剂可如本领域已知的来制备并且具体的制备可取决于具体的应用。但是，所描述的结合剂不以任何方式限于抗体。例如，结合剂可以是表现与另一个结合剂类似结合性质的任何化合物(例如，模拟物)。例如，示例性结合剂可以是结合pd-1和/或可与对其具有特异性的结合剂(例如，单克隆抗体)竞争的结合剂。在一些实施方式中，模拟物在结合试验中可表现与相比较的结合剂(例如，单克隆抗体)基本上相同的亲和力。可通过任何适当的试验测量特定的结合剂的亲和力，包括但不限于活化的cd4+t细胞上内源细胞表面pd-1的facs染色，如在实施例中描述的。其中测量值(例如，具有纳摩尔亲和力的表观结合常数)在彼此的约任何1-20、1-5、5-10、10-15、15-20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250百分比范围内时，可认为一种结合剂与另一结合剂具有“基本上相同的亲和力”。示例性模拟物可包括例如特异性结合pd-1的有机化合物，或亲和体(affibody)(nygren等febsj.275(11):2668–76(2008))、affilin(ebersbach等j.mol.biol.372(1):172–85(2007))、affitin(krehenbrink等j.mol.biol.383(5):1058–68(2008))、anticalin(skerra,a.febsj.275(11):2677–83(2008))、avimer(silverman等nat.biotechnol.23(12):1556–61(2005))、darpin(stumpp等drugdiscov.today13(15–16):695–701(2008))、fynomer(grabulovski等j.biol.chem.282(5):3196–3204(2007))、kunitz结构域肽(nixon等curr.opin.drugdiscov.devel.9(2):261–8(2006))，和/或单体(koide等methodsmol.biol.352:95–109(2007))。其它模拟物可包括例如抗体的衍生物，比如，例如，fab、fab2、fab’单链抗体、fv、单结构域抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多价抗体、嵌合抗体、犬-人嵌合抗体、犬-小鼠嵌合抗体、包括犬fc的抗体、人源化抗体、人抗体、犬源化cdr移植抗体、鲨鱼抗体、纳米抗体、骆驼(canelid)抗体、微体和/或胞内抗体(intrabody)，或其衍生物。本文也提供了本领域普通技术人员理解的其它结合剂。可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法产生对于pd-1具有特异性(例如，结合)的结合剂。例如，为了产生和分离单克隆抗体，可以将一种或多种pd-1蛋白(例如，pd-1fc融合蛋白和/或pd-1组氨酸标记蛋白)施用于(例如，免疫的)动物比如小鼠。然后可以选择对在活化的人t淋巴细胞上表达的pd-1表现血清反应性(如通过例如流式细胞术和/或显微镜测定)的动物，用于产生抗pd-1杂交瘤细胞系。这可以重复多轮。例如，结合剂选择的第一轮的主要标准可包括但不限于：i)通过流式细胞术，在活化的人t淋巴细胞上pd-1染色的水平；(ii)与现有抗pd-1抗体的那些序列相比，cdrvh和vl序列的多样性；和(iii)通过与pd-1缀合的与pd-l1预偶联的luminex珠或数种商业上可获得的结合至pd-1上不同表位的抗pd-1抗体之一的竞争结合研究而进行的表位作图。选择的示例性第一或第二轮也可包括例如亲和性结合(不是主要标准，因为其可以与抗pd-1抗体的刺激潜能不相关)；和/或功能表征，以将结合剂鉴定为激动剂或拮抗物。如本文实施例1所描述，可以使用例如耗竭功能恢复试验(efra)。在该试验中，试验测试结合剂从耗竭中挽救免疫细胞比如t细胞的能力。这可以通过在存在抗原比如源自病毒比如人免疫缺陷病毒(hiv)的测试肽的情况下，测量结合剂修复这种细胞增殖的能力来测定。在cfse试验中，与对照比如单独的测试肽或阳性对照抗pd-1抗体比如mk-3475(派姆单抗(pembrolizumab))比较，测量增殖。在一些实施方式中，当与单独的肽对照或具有同种型对照小鼠igg1抗体的肽相比较，该比较显示显著差异(比如p值<0.001)时，确定结合剂修复增殖。该试验可用于鉴定与结合至pd-1(比如pd-l1或pd-l2)的其它结合剂竞争和/或引起免疫细胞的功能恢复的结合剂(比如抗体)。实施例1也描述了使用基于luminex试验对本文描述的抗体(例如表3中列出的)进行表位作图的两种方法。在一种生物化学试验中，pd-1fc融合蛋白与珠子结合，并且在表3中描述的抗pd-1抗体和两个不同商业上可获得的抗pd-1抗体中的一个抗体之间进行竞争结合研究。实施例1描述了结合至pd-1上不同表位的四类单克隆抗体，它们是：类别1(与阻断pd-1与pd-l1的相互作用的第一单克隆抗体竞争)、类别2(与结合pd-1但是不阻断pd-1与pd-l1的相互作用的第二单克隆抗体竞争)、类别3(与第一和第二单克隆抗体都竞争)，和类别4(不与第一或第二抗体竞争)。在单独的试验中，对于表3中列举的抗pd-1抗体和生物素化的pd-l1重组蛋白，评估结合至重组pd-1蛋白的竞争。从推测结合至pd-1上不同表位的所有四个结合类别中鉴定出了在efra中诱导增殖的抗体。同样地，efra允许鉴定抗pd-1抗体，该抗pd-1抗体阻断或非阻断pd-1/pd-l1相互作用并且特异性恢复hiv特异性cd8+t细胞的增殖功能。也可鉴定结合剂的组合。在一些实施方式中，可鉴定组合，以提供与使用仅仅一种或多种结合剂并且没有其它时获得的结果呈统计学上显著的差异。在一些实施方式中，可鉴定展示对于恢复免疫细胞功能协同或协作能力的组合。在一些实施方式中，组合可包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合剂与不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合剂。第一和第二结合剂可以是不同的实体，比如两种或更多种不同单克隆抗体或其衍生物，或可出现在相同的实体上，比如双功能抗体(单个抗体或其衍生物，其包括多种结合特异性)。例如，示例性双功能抗体可包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合区域和不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合区域。也考虑提供多种类型的各个结合剂的组合。例如，组合可包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的多种类型的结合剂与不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的一种或多种结合剂。在一些实施方式中，组合可包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的一种或多种结合剂和不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的多种结合剂。在一些实施方式中，组合可包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的多种结合剂和不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的多种结合剂。如本文所描述的这样的组合也可结合可影响免疫细胞功能的一种或多种其它试剂，比如针对ctla-4的抗体等等。本领域普通技术人员将认识到许多这种组合可适于如本文所述的用途。在结合剂是抗体的情况下，其可参考对应于其变异和/或互补决定区(“cdr”)的核苷酸和/或氨基酸序列来鉴定。可变区/cdr序列可结合一个或多个其它可变区/cdr氨基酸序列使用。可变区/cdr氨基酸序列可以可选地和/或也可连接至抗体分子的一种或多种类型的恒定区多肽。例如，表1a和1b中显示的cdr氨基酸序列可与相同或不同物种(例如，人、山羊、大鼠、绵羊、鸡)任何抗体分子的恒定区和/或衍生cdr氨基酸序列的抗体亚型的恒定区邻接或相关联。例如，示例性结合剂可以是，或可衍生自，或可相关于列举的杂交瘤所产生的单克隆抗体，和/或可具有大约相同的亲和力和/或增殖效果，和/或展示与表3和11-13中相同结合类别，和/或可具有seqidno.1-190和/或表1a和1b中显示的任何一个或多个氨基酸序列。结合剂可包括抗体重链和/或轻链，每条链包括一个或多个恒定区和/或可变区。可变区通常包括可确定抗体的结合特异性的一个或多个cdr。单克隆抗体也可通过分析这种可变区的氨基酸序列(例如，其可通过这种核苷酸序列编码)来鉴定。例如，结合pd-1的结合剂的重链cdr的示例性氨基酸序列可包括选自下述的至少一条氨基酸序列的任何一个或多个：seqidno.1-190，和/或表1a和/或1b中显示的任何其它序列。使用标准技术，本文所述的任何氨基酸序列，和/或其任何片段和/或衍生物也可以以任何顺序与任何其它可变区和/或cdr和/或组合进行组合，以形成混合和/或融合结合剂，和/或插入至其它重链和/或轻链可变区。本公开内容出现的pd-1(例如，人pd-1)结合剂中的cdr的示例性组合(例如，重链和/或轻链cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列的组合)可包括例如表1a和/或1b中所示的实施方式。表1a表1b在优选的实施方式中，每个克隆的重链cdr与它们相应的轻链cdr组合成结合剂。在一些实施方式中，结合剂可以包含如下所示的重链cdr和轻链cdr：122f10(seqidno.1、24、47、70、93和116)；139d6(seqidno.2、25、48、71、94和117)；135d1(seqidno.3、26、49、72、95和118)；134d2(seqidno.4、27、50、73、96和119)；121g1(seqidno.5、28、51、74、97和120)；136b5(seqidno.6、29、52、75、98和121)；127c2(seqidno.7、30、53、76、99和122)；137f2(seqidno.8、31、54、77、100和123)；138h5(seqidno.9、32、55、78、101和124)；140a1(seqidno.10、33、56、79、102和125)；135h12(seqidno.11、34、57、80、103和126)；131d11(seqidno.12、35、58、81、104和127)；132f7(seqidno.13、36、59、82、105和128)；126e4(seqidno.14、37、60、83、106和129)；135g1(seqidno.15、38、61、84、107和130)；136e10(seqidno.16、39、62、85、108和131)；135c12(seqidno.17、40、63、86、109和132)；136f4(seqidno.18、41、64、87、110和133)；136b4(seqidno.19、42、65、88、111和134)；135e10(seqidno.20、43、66、89、112和135)；140g5(seqidno.21、44、67、90、113和136)；122h2(seqidno.22、45、68、91、114和137)；或139f11(seqidno.23、46、69、92、115和138)。包含一个或多个本文所述cdr的示例性重链和轻链可变区可包括但不限于人源化重链和/或轻链可变区。例如，包含137f2重链cdrseqidno.8、31和54的示例性人源化“137f2”可变重链序列可以包括：包含137f2轻链cdrseqidno.77、100和123的示例性人源化“137f2”可变轻链序列可以包括：包含135c12重链cdrseqidno.17、40和63的示例性人源化“135c12”可变重链序列可以包括：包含135c12轻链cdrseqidno.86、109和132的示例性人源化“135c12”可变轻链序列可以包括：本文还描述了编码这些氨基酸序列的示例性核酸序列和/或用于确定它们的方法(例如，seqidno.191-243)。上文或本文其它地方公开的任何相容的人源化可变序列可以彼此组合以提供结合剂，比如结合pd-1的抗体。例如，在一些实施方式中，seqidno.143和155可以组合成结合剂(例如，maba35795)；seqidno.166和180可以组合成结合剂(例如，maba35774)；seqidno.196和189可以组合成结合剂(例如，mab135ch1cl1b)；seqidno.196和190可以组合成结合剂(例如，mab135ch1cl1c)。此外，可变重链和轻链可以存在于结合剂内(例如，组合)，如表2所示：表2“阻断”抗体是与pd-l1竞争结合细胞表面上的pd-1的抗体，如通过任何合适的试验所确定，包括但不限于luminex生物化学pd-1/pd-l1相互作用试验(图1)。用阻断抗pd-1抗体进行的表位作图研究也映射到与pd-1/pd-l1相互作用重叠的pd-1区域。“非阻断”抗体是在合适的试验中仅部分竞争或不与pd-l1竞争结合pd-1的抗体，所述合适的试验包括但不限于luminex生物化学pd-1/pd-l1相互作用试验(图1)。表位作图研究和/或人pd-1/fab共结晶研究证实，非阻断性抗体在与pd-1/pd-l1相互作用重叠的位点不结合pd-1。在一些实施方式中，结合剂可以包含两对或更多对此类序列，例如，在双特异性抗体中(例如，seqidno.143和155以及seqidno.166和180可以组合成结合剂或结合剂的组合)。本领域普通技术人员可以确定的其它组合也可以是有用的。包含表1a和/或1b的cdr或本文另外描述(例如，包含seqidno.139-190和/或表2中所示的任何一种)的结合剂也可以表现出以下特征：表3*通过活化的cd4t细胞上内源细胞表面pd-1的facs染色来评估表1中列举的抗体的结合亲和力。**通过luminex试验竞争结合研究确定结合类别。结合类别1mab克隆与eh12.2h7克隆商业抗体竞争，类别2mab克隆与j116克隆商业抗体竞争，类别3mab克隆与eh12.2h7和j116抗体都竞争，并且类别4mab克隆在eh12.2h7和j116抗体都存在的情况下结合。***在第二luminex结合试验中确定与pd-1/pd-l1相互作用的抗体竞争。在该试验中，在没有或存在来自表3中浓度为20nm的抗pd-1抗体的情况下孵育pd-1fc融合蛋白包被的珠子。然后，固定浓度的1.25nm生物素化的pd-l1(约等于pd-1/pd-l1相互作用的ic50)与pd-1/抗体复合物培育，并且通过以藻红蛋白标记的链霉亲和素的荧光检测pd-l1结合。基于结合至pd-1/抗体复合物的pd-l1，将抗体定义为对pd-1/pd-l1相互作用是阻断性的或非阻断性的。使用cfse试验评估增殖效果(耗竭功能恢复试验(“efra”)的实施方式)。在存在或没有抗pd-1抗体的情况下，用hiv特异性肽刺激从慢性感染的hiv主体分离的pbmc。培育6天之后，相对于单独肽对照，在抗pd-1处理的样品中评估hiv特异性cd8t细胞的增殖。na＝未获得如实施例部分中所解释的，表位作图研究揭示pd-1上至少两个保守块片(patch)(包括线性和/或构象表位)，本文所述的结合剂可与之结合，称为“p1”和“p2”(参见，例如，图11a和11b)。p1块片在进化上是保守的，并且对应于pd-1与pd-l1/pd-l2配体之间相互作用涉及的pd-1中心区域，并且对应于图2和图11a中的紫色圆圈。第二个“块片”p2也是进化上保守的并且占据相似的表面积但是与p1块片不同的氨基酸序列(图11b)。p2先前未在pd-1上发现结构或功能作用。本文所述的pd-1结合剂，比如包括135c12(seqidno.17、40、63、86、109和132)、139d6(seqidno.2、25、48、71、94和117)，135d1(seqidno.3、26、49、72、95和118)和136b4(seqidno.19、42、65、88、111和134)的氨基酸序列的抗pd-1抗体，结合与p2块片重叠的表位，从而为该新鉴定的pd-1功能区的功能重要性提供直接证据。实施例部分描述了使用图3所示的修饰的pd-1多肽和seqidno.244-274进行的表位作图研究。这些研究表明，具有最大“功能效力”或“拮抗活性”的非阻断性抗体结合至与以下区域重叠的pd-1的“块片”：m4氨基酸取代区域(丝氨酸38至丙氨酸，脯氨酸39至丙氨酸和亮氨酸41至丙氨酸(图3；seqidno.247))，和/或m17氨基酸取代的区域(天冬酰胺102至丙氨酸和精氨酸104至丙氨酸(图3；seqidno.260)，和/或m18氨基酸取代的区域(天冬氨酸105至丙氨酸(图11；seqidno.261)，和/或m26氨基酸取代的区域(精氨酸138至丙氨酸和谷氨酸141至丙氨酸(图3；seqidno.269))和/或m31氨基酸取代的区域(亮氨酸41至丙氨酸和缬氨酸43至亮氨酸(图3；seqidno.274)。该“块片”在本文中称为“p2”。这些研究表明p2包含至少一个与这种非阻断性抗体结合的表位(线性、构象或其组合)。鉴于该区域先前在pd-1的功能活性中没有涉及，本文提出与p2结合代表在pd-1上的新位点处的新作用机制，其中可以发挥对pd-1的拮抗活性。本文进一步提出，可以与pd-1的p2区相互作用的其它抗体、抗体片段或其它蛋白结合剂也可以以与抗pd-1抗体不同的方式和互补的方式充当pd-1拮抗剂，所述抗pd-1抗体通过阻滞pd-1/pd-l1相互作用来起作用。例如，本文所述的结合剂可以与尚未鉴定的配体相互作用；干扰、诱导和/或增强pd-1多聚化；和/或通过与p2相互作用(例如，结合)，改变与pd-1相关的细胞内信号传导。因此，本文所述的与p2相互作用(例如，结合)的结合剂可通过任何这些或任何其它尚待鉴定的机制提供pd-1拮抗功能。因此，本公开内容提供了通过与细胞内或细胞上的pd-1的此p2块片相互作用来影响pd-1功能的方法。pd-1的p2块片中的氨基酸残基可包含苏氨酸36、苯丙氨酸37、丝氨酸38、脯氨酸39、亮氨酸41、缬氨酸43、丙氨酸50、苏氨酸51、苯丙氨酸52、苏氨酸53、半胱氨酸54、丝氨酸55、天冬酰胺102、精氨酸104、天冬氨酸(天门冬氨酸)105、苯丙氨酸106、组氨酸107、甲硫氨酸108、精氨酸138和谷氨酸(谷氨酸盐)141，氨基酸编号对应于seqidno.275。在一些实施方式中，p2块片的氨基酸残基可包含苏氨酸36、苯丙氨酸37、丙氨酸50、苏氨酸51、苯丙氨酸52、苏氨酸53、半胱氨酸54、丝氨酸55、天冬氨酸(天门冬氨酸)105、苯丙氨酸106、组氨酸107和甲硫氨酸108，氨基酸编号对应于seqidno.275。在一些实施方式中，p2块片的氨基酸残基可包含氨基酸残基丝氨酸38、脯氨酸39、亮氨酸41、缬氨酸43、天冬酰胺102、精氨酸104和/或天冬氨酸(天门冬氨酸)105。因此，在一些实施方式中，所述方法可包括与氨基酸苏氨酸36、苯丙氨酸37、丝氨酸38、脯氨酸39、亮氨酸41、缬氨酸43、丙氨酸50、苏氨酸51、苯丙氨酸52、苏氨酸53、半胱氨酸54、丝氨酸55、天冬酰胺102、精氨酸104、天冬氨酸(天门冬氨酸)105、苯丙氨酸106、组氨酸107和/或甲硫氨酸108相互作用，氨基酸编号对应于seqidno.275。在一些实施方式中，所述方法可包括与氨基酸苏氨酸36、苯丙氨酸37、丙氨酸50、苏氨酸51、苯丙氨酸52、苏氨酸53、半胱氨酸54、丝氨酸55、天冬氨酸(天门冬氨酸)105、苯丙氨酸106、组氨酸107和/或甲硫氨酸108相互作用。在一些实施方式中，所述方法可包括与氨基酸丝氨酸38、脯氨酸39、亮氨酸41、缬氨酸43、天冬酰胺102、精氨酸104和/或天冬氨酸(天门冬氨酸)105相互作用。在一些实施方式中，所述方法包括p2块片内和/或与p2块片重叠的任何氨基酸(例如，包含上述氨基酸残基的pd-1部分)相互作用。在此类方法的一些实施方式中，所述方法包括与以下氨基酸残基相互作用：对应于seqidno.275(m4；图3；seqidno.247)的丝氨酸38、脯氨酸39和/或亮氨酸41的一个或多个氨基酸残基；和/或相对于seqidno.275(m17；图3；seqidno.260)对应于天冬酰胺102和/或精氨酸104的一个或多个氨基酸残基；和/或相对于seqidno.204(m18；图3；seqidno.261)对应于天冬氨酸(天门冬氨酸)105的一个或多个氨基酸残基；和/或对应于精氨酸138和/或谷氨酸(谷氨酸盐)141的一个或多个氨基酸残基(m26；图3；seqidno.269)和/或对应于亮氨酸41和/或缬氨酸43(m31；图3；seqidno.274)的一个或多个氨基酸残基。在一些此类实施方式中，可以通过修饰(例如，取代、消除)任何一个或多个这样的氨基酸残基来减少和/或消除相互作用。在一些实施方式中，所述方法包括拮抗地影响pd-1的功能。在一些实施方式中，所述方法包括使用pd-1结合剂与pd-1相互作用。在一些实施方式中，pd-1结合剂对包含一个或多个相应氨基酸残基的区域(例如，表位)具有特异性，例如seqidno.275的亮氨酸41和/或缬氨酸43(m4)；和/或相对于seqidno.275对应于天冬酰胺102和/或精氨酸104(m17)的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述相互作用可以涉及具有结合pd-1(seqidno.275)但不结合pd-1m4(seqidno.247)的能力的结合剂，和/或涉及具有结合pd-1(seqidno.275)但不结合pd-1m17(seqidno.260)的能力的结合剂。在一些实施方式中，所述方法可包括在涉及pd-1与pd-l1和/或pd-l2(例如p1块片)和p2的相互作用的位点处与pd-1相互作用。短语“对应于seqidno.275的“氨基酸”的一个或多个氨基酸残基”是指pd-1的另一种形式的氨基酸，其位置类似于seqidno.275中(图3h)。但是，本领域普通技术人员将理解，除seqidno.275(图3h)之外的pd-1多肽中的氨基酸通过其在多肽内的环境可以确定为“对应于”seqidno.275(图3h)中的特定氨基酸。例如，猴pd-1(seqidno.276(图3i))包含位置41的亮氨酸，seqidno.275也是如此。但是，另一个pd-1的编号可由于例如一个或多个添加、缺失和/或取代而不同，使得该特定pd-1中的“对应”亮氨酸可以在例如位置40或43处发现。但是，本领域普通技术人员将理解，亮氨酸相对于其在seqidno.275(图3h)中的环境(例如，它可以由如seqidno.275中的氨基酸pa和lv包围(图3h))“对应于”亮氨酸41。在一些实施方式中，结合剂具有结合pd-1(seqidno.275)的氨基酸f37、p39、a40、l41、v43、l138、r139和r143的能力；和/或结合pd-1(seqidno.275)的p34、s137和r139(例如，a35774包括用于vhcdr环的f37、p39、a40、l41、v43、l138、r139和r143以及用于vlcdr环的p34、e136、s137和r139)的能力。如本领域普通技术人员所理解的，本文还考虑了此类方法和氨基酸的其它实施方式(例如，一个“对应于”另一个)。可通过本领域普通技术人员可用的任何技术确定结合亲和力。通过流式细胞术染色用植物血凝素(pha)刺激3至6天时间的cd4t细胞上的内源细胞表面pd-1，来评估表3中呈现的结合亲和力数据。也可通过本领域普通技术人员可用的任何技术确定结合类别。通过luminex试验竞争结合研究测定表3中呈现的结合类别数据。在表3中，结合类别1mab抗体是测定与eh12.2h7克隆商业抗体(可获得自biolegend,sandiego,ca(例如，货号329905))竞争的那些；类别2抗体是测定与j116克隆商业抗体(可获得自affymetrixebioscience，sandiego，ca(例如，货号16-9989-80))竞争的那些；和类别3抗体是测定与eh12.2h7和j116抗体都竞争的那些；以及类别4mab克隆抗体是测定在eh12.2h7和j116抗体都存在的情况下结合pd-1的那些。可通过本领域普通技术人员可用的任何技术测定增殖效果。例如，可使用上述的和实施例1中使用的efra系统。这种试验用于确定表3中呈现的增殖效果数据。简言之，羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(cfse)试验，其中从慢性感染的hiv主体分离外周血单个核细胞(pbmc)并且用hiv特异性肽在存在和缺少抗pd-1抗体的情况下刺激。也测试对照抗pd1抗体(merck抗体mk-3475，也称为pembrolizimab或keytruda(描述于美国专利8,354,509和8,900,587，并且可从merck&co.获得；和/或包含raskgvstsgysylh(seqidno.287)、lasyles(seqidno.288)、qhsrdlplt(seqidno.289)、nyymy(seqidno.290)、ginpsnggtnfnekfkn(seqidno.291)，和/或rdyrfdmgfdy(seqidno.292))作为阳性对照。培育六天之后，相对于单独的肽对照，在抗pd-1处理的样品中评估hiv特异性cd8t细胞的增殖并且结果表达为超过对照的百分数(percentageabovecontrol)(“增殖效果”)。在一些实施方式中，可结合用于鉴定和表征pd-1结合剂比如抗体的技术，以提供用于鉴定和表征这些结合剂的系统。例如，一种或多种候选结合剂，比如一种或多种单克隆抗体可通过efra或类似的试验测定，以确定候选结合剂恢复免疫细胞功能的能力，通过例如，在存在免疫原性肽的情况下增殖所测量的。在一些实施方式中，这类试验可用作初始筛选，以确保进一步研究的候选结合剂能够恢复免疫细胞功能。在一些实施方式中，这些类型的试验之后可以是确定对免疫细胞比如激活的外周血单个核细胞(pbmc)的结合亲和力的试验。在一些实施方式中，这种试验可使用技术比如荧光激活细胞分选(facs)。在一些实施方式中，所述试验可包括存在或没有非特异性结合和/或使用已知的结合试剂比如抗pd1抗体(例如，merck抗体mk-3475)的竞争结合研究。然后这些试验之后可以是比如上述表1a和/或1b中提供的候选结合剂的cdr的测序。然后，本文所述的efra、亲和力测定、表位作图研究和cdr鉴定方法一起提供了可鉴定候选结合剂的系统。表1a和/或1b中的任何氨基酸序列，和/或seqidno.139-190中的任何氨基酸序列(和/或其任何一个或多个片段和/或衍生物)也可以由任何其它氨基酸取代，如本领域普通技术人员期望的。例如，如下面表4中显示，本领域技术人员通过用其它氨基酸取代具体的氨基酸，可进行保守取代。所选择的特定氨基酸取代可取决于选择的位点的位置。这种保守氨基酸取代可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得几乎不影响或不影响在该位置的氨基酸残基的尺寸、极性、电荷、疏水性或亲水性，并且尤其不产生降低的pd-1结合。表4因此，本文考虑本文所述结合剂的氨基酸序列中的保守或非保守氨基酸取代。例如，可以进行氨基酸取代，其对应于本文所述的人源化可变重链(vh)和轻链(vl)的氨基酸序列(例如，seqidno.139-190)。示例性的非保守和保守取代，同样可以使用表4表征，如下表5-8所示(也参见图25a-d)：表5对应于a35790vh的示例性取代(137f2，seqidno.139)*示例性的非保守取代**示例性保守取代表6对应于a35790vl的示例性取代(137f2，seqidno.151)*示例性的非保守取代**示例性保守取代表7对应于a35775vh的示例性取代(135c12，seqidno.164)*示例性的非保守取代**示例性保守取代表8对应于a35775vl的示例性取代(135c12，seqidno.178)*示例性的非保守取代**示例性保守取代在一些实施方式中，本公开内容提供了具有多特异性的结合剂，使得pd-1和至少一种其它第二抗原(例如，细胞表面蛋白)可被单个结合剂结合。在一些实施方式中，第二抗原可以是由传染剂感染的细胞表达的抗原。例如，示例性第二抗原可以是hivenv抗原。这种结合剂可结合第二抗原和/或可用于中和传染剂。例如，在某些实施方式中，比如对于双特异性结合剂，其具有对于pd-1和hiv抗原比如env和/或另一抗原的双重特异性。hiv免疫原可源自本文所述的任何亚型，或任何其它。在一些实施方式中，这种结合剂可包括：pd-1激动剂/env结合；pd-1激动剂pd-1/env结合和中和；pd-1拮抗物/env结合；和/或pd-1拮抗物/pd-1/env结合和中和。考虑各种亚型的普遍性，可优先选择来自hiv-1亚型b和/或c的抗原。也可期望在单个组合物中包括对于来自多种hiv亚型(例如，hiv-1亚型b和c、hiv-2亚型a和b，或hiv-1和hiv-2亚型的组合)的抗原具有特异性的结合剂。对于治疗疾病比如癌症，可有益地获得具有多种pd-1特异性(例如，对于两个不同表位具有特异性的双特异性pd-1a/pd1b拮抗物pd-1抗体)和/或对于pd-1和一种或多种肿瘤抗原(例如，癌症-睾丸(ct)抗原(即，mage、ny-eso-1)；黑素细胞分化抗原(即，melana/mart-1、酪氨酸酶、gp100)；突变抗原(即，mum-1、p53、cdk-4)；过表达的‘自体’抗原(即，her-2/neu、p53)；和/或病毒抗原(即，hpv、ebv))都有特异性的结合剂。结合剂(例如，单克隆抗体)可大体上如上述产生。这种结合剂的特异性可以使用本领域普通技术人员广泛可用的技术重组成单个结合剂。在一些实施方式中，多种单特异性结合剂也可以组合和使用(例如，施用)，以提供有效的多特异性试剂。在一些实施方式中，本文所述的结合剂可以缀合至活性试剂，以靶向和抑制表达pd-1(和/或在结合剂具有多特异性的情况下的另一抗原)的细胞群的功能和/或消除表达pd-1(和/或在结合剂具有多特异性的情况下的另一抗原)的细胞群。例如，可使用结合剂/药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物(adc))，靶向并且消除包含复制能力的hiv的cd4+t细胞群。单特异性和/或双特异性候选结合剂可与一类或多类药物(例如，破坏dna、靶向微管的药物)缀合。本文所述的结合剂和/或其衍生物也可连接至和/或缀合至功能剂，用于体外和/或体内使用。例如，结合剂可连接至和/或缀合至功能部分，比如细胞毒性药物或毒素，和/或其活性片段，比如白喉a链、外毒素a链、蓖麻毒素a链、相思子毒素a链、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等等。适当的功能部分也可包括放射化学品。使用本领域的标准技术，结合剂(比如抗体)可邻接至和/或缀合至一种或多种功能剂。在一些实施方式中，结合剂可结合其它试剂比如抗感染剂(例如，抗生素、抗病毒药剂)施用。例如，本文所述的结合剂可结合单克隆抗体和/或其它试剂比如尼伏鲁单抗(也称为mdx-1106、bms-936558(topalian等n.eng.j.med.2012；366(26):2443-2454)、mdx-1106、ono-4538，全人igg4mab，可获得自bristol-myerssquibb)、pembrolizumab(也称为mk-3475和sch900475，人源化的igg4单克隆抗体，可获得自merck)、皮地珠单抗(人源化的igg1单克隆抗体，可获得自curetech)、amp-224(b7-dc/igg1融合蛋白，可获得自glaxosmithkline/amplimmune)，和/或任何美国专利号8,354,509b2(carven等)、美国专利号8,008,449b2(korman等)、wo2012/135408a1(manoj等)、us2010/026617(carven等)、wo2011/110621a1(tyson等)、美国专利号7,488,802b2(collins等)、wo2010/029435a1(simon等)、wo2010/089411a2(olive,d.)、wo2012/145493a1(langermann等)、wo2013/0435569a1(rolland等)、wo2011/159877a2(kuchroo等)、美国专利号7,563,869b2(onopharm.)、美国专利号7,858,746b2(honjo等)、美国专利号8,728,474b2(onopharm.)和/或美国专利号9,067,999(onopharm.)中描述的抗体或其它试剂或方法，它们中的每一篇以其整体并入本公开。根据优选的实施方式，任何pd-1结合剂可以与其它结合剂融合以形成双特异性结合分子，特别是双特异性抗体。这种双特异性分子有利地将pd1结合剂与另一种pd1结合剂偶联，或与另一种靶向检查点(checkpoint)抑制剂或调节剂的结合剂偶联，特别是ctla-4、lag3、tim3、cd137、4-1bb、ox40、cd27、gitr(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子)、cd40、kir、idoil-2、il-21和csf-1r(集落刺激因子1受体)。如本领域普通技术人员所理解的，本文还涵盖其它组合和/或双特异性结合分子。如上所述，本文所述的pd-1结合剂(例如，pd-1拮抗物)可用于治疗和/或预防和/或减轻hiv感染的症状。如本领域熟知的，现在将hiv分离株划分为不同的基因亚型。已知hiv-1包括至少十种亚型(a1、a2、a3、a4、b、c、d、e、f1、f2、g、h、j和k)(taylor等nejm,359(18):1965-1966(2008))。已知hiv-2包括至少五种亚型(a、b、c、d和e)。世界范围内，亚型b与男同性恋和静脉内药物使用者中的hiv流行病相关。大部分hiv-1免疫原、实验室采用的(adapted)分离物、试剂和作图的表位属于亚型b。在撒哈拉以南非洲、印度和中国，新hiv感染发病率高的地区，hiv-1亚型b仅仅占感染的小部分，并且亚型hiv-1c好像是最常见的感染亚型。任何这些类型的分离株可使用本文所述的结合剂处理。一种或多种结合剂也可与一种或多种用于预防、治疗和/或减轻hiv的试剂比如例如，蛋白酶抑制剂、hiv进入抑制剂、逆转录酶抑制剂和/或抗逆转录病毒核苷类似物施用或结合。可使用适当的化合物包括例如agenerase(安普那韦)、combivir(retrovir/epivir)、crixivan(茚地那韦)、emtriva(恩曲他滨)、epivir(3tc/拉米夫定)、epzicom、fortovase/invirase(沙奎那韦)、fuzeon(恩夫韦地)、hivid(ddc/扎西他滨)、kaletra(洛匹那韦)、lexiva(福沙那韦)、norvir(利托那韦)、rescriptor(迪拉夫定)、retrovir/azt(齐多夫定)、reyatax(阿扎那韦，bms-232632)、sustiva(依法韦仑)、trizivir(阿巴卡韦/齐多夫定/拉米夫定)、truvada(恩曲他滨/泰诺福韦df)、videx(ddi/地达诺欣)、videxec(ddi，地达诺欣)、viracept(奈韦拉平)、viread(富马酸替诺福韦酯)、zerit(d4t/司他夫定)和ziagen(阿巴卡韦)。其它适当的试剂是本领域技术人员已知的并且可适于如本文所描述的用途。这样的试剂可在施用结合剂和/或使用本文所述的方法之前、期间或之后使用。如上所述，本文所述的pd-1结合剂(例如，pd-1拮抗物)可用于治疗和/或预防和/或减轻癌症的症状。示例性癌症可包括例如乳腺癌、血癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、骨骼组织癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、脑癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和/或肝癌等等中的任意。此外，本文所述的pd-1结合剂，优选对pd-1/pd-l1相互作用无阻断的抗体，特别是本文中称为结合类别ii的那些，例如但不限于135c12、139d6、136b4和135d1，特别适用于单独或彼此组合和/或组合其它pd-1抗体，用于治疗各种类型的恶性肿瘤，特别是黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、膀胱癌、前列腺癌(例如，去势难治性前列腺癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、merkel细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤和其它肿瘤性恶性肿瘤。上述优选的pd-1结合剂更特别地用于治疗血液恶性肿瘤，例如霍奇金病(hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤如滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)、急性淋巴细胞白血病(all)和骨髓增生异常综合征。如本领域普通技术人员所理解的，本文所述的结合剂也可用于治疗其它类型的癌症。在一些实施方式中，一种或多种pd-1结合剂也可与用于预防、治疗和/或减轻癌症的一种或多种试剂结合和/或施用或联合，这种试剂比如例如，烷基化试剂(例如，任何氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂和/或其衍生物)、抗代谢物(例如，任何甲氨蝶呤、培美曲塞、氟尿嘧啶和/或其衍生物)、抗微管试剂(例如，长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素和/或其衍生物)、拓扑异构酶i和/或ii抑制剂(例如，喜树碱、伊立替康、拓扑替康、足叶乙甙、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊甙、新生霉素、美巴龙(merbarone)、阿柔比星和/或其衍生物)和/或细胞毒性抗生素(例如、任何蒽环类、放线菌素、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素和/或其衍生物)。一种或多种结合剂也可，或可替代地，结合一种或多种本领域普通技术人员可得的用于治疗、预防和/或减轻癌症的其它结合剂，比如例如，尼伏鲁单抗、pembrolizumab、皮地珠单抗和/或其他类似的试剂和/或其衍生物。一种或多种pd-1结合剂也可单独使用或与靶向pd-1、pdl-1和/或其它免疫检查点效应子的其它结合剂组合使用。这些也可以与其它抗肿瘤药物或免疫原性试剂(例如，减毒癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如，il-2、ifna2、gm-csf)，和/或用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞，例如但不限于gm-csf；标准癌症治疗(例如，化疗、放疗或手术)；或针对vegf、egfr、her2/neu、vegf受体，其它生长因子受体的其它药剂组合使用。根据优选的实施方式，一种或多种pd-1结合剂与疫苗试剂和/或免疫检查点调节剂组合，更特别地作用于ctla-4、lag3、tim3、cd137、4-1bb、ox40、cd27、gitr(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子)、cd40、kir、idoil-2、il-21和/或csf-1r(集落刺激因子1受体)，以形成治疗组合物和/或试剂盒(用于顺序治疗性给药)。其它适当的试剂是本领域技术人员已知的并且可适于如本文所描述的用途。这种试剂可在施用结合剂和/或使用本文所述的方法之前、期间或之后施用。如上所述，本文所述的pd-1结合剂(例如，pd-1激动剂)可用于治疗和/或预防和/或减轻自身免疫的症状。示例性自身免疫病症可包括例如其中pd-1参与保持自身耐受的任何病症和/或涉及炎症t细胞(例如，自身反应性或自身抗原特异性t细胞)的病症，比如，例如，系统性红斑狼疮(sle)、i型糖尿病、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎和多发性硬化症。这种pd-1结合剂也可与其它试剂比如抗ctla-4试剂(例如，伊匹单抗)组合。一种或多种结合剂也可与用于预防、治疗和/或减轻自身免疫的一种或多种试剂组合和/或施用或结合，比如例如糖皮质激素、细胞抑制剂(例如，烷基化试剂、抗代谢物、氨甲喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、细胞毒性抗生素(例如，更生霉素、蒽环类、丝裂霉素c、博来霉素、光辉霉素)、抗体(例如，atgam、即复宁(thymoglobuline)、舒莱(simulect)、赛尼哌(zenapax))、作用于免疫亲和素的药物(例如，环孢素、他克莫司、西罗莫司)、干扰素、阿片类、tnf-结合剂(例如，类克(remicade)、恩利(enbrel)、修美乐(humira))、麦考酚酯、芬戈莫德、多球壳菌素和/或其衍生物。其它适当的试剂是本领域技术人员已知的并且可适于如本文所描述的用途。这种试剂可在施用结合剂和/或使用本文所述的方法之前、期间或之后使用。在一些实施方式中，结合剂可邻接至和/或缀合至一种或多种可检测的标签。例如，适当的可检测的标签可包括例如荧光素(例如，dylight、cy3、cy5、fitc、hilytefluor555、hilytefluor647；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-fam)；5-hat(羟基色胺)；5-羟基色胺(hat)；6-joe；6-羧基荧光素(6-fam)；fitc；6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯荧光素(tet)；6-羧基-1,4-二氯-2’,4’,5’,7’-四-氯荧光素(hex)；6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(joe)；alexafluors(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；bodipy荧光团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-x、650/665-x、665/676、fl、flatp、fi-神经酰胺、r6gse、tmr、tmr-x缀合物、tmr-x、se、tr、tratp、tr-xse))、罗丹明(例如，110、123、b、b200、bb、bg、bextra、5-羧基四甲基罗丹明(5-tamra)、5gld、6-羧基罗丹明6g、丽丝胺、丽丝胺罗丹明b、phallicidine、鬼笔环肽、红(red)、rhod-2、rox(6-羧基-x-罗丹明)、5-rox(羧基-x-罗丹明)、磺基罗丹明bcanc、磺基罗丹明gextra、tamra(6-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(tritc)、wt)、德克萨斯红，和/或德克萨斯红-x。本领域已知的其它可检测的标签也可适于使用。使用本领域的标准技术，结合剂比如抗体可连接至和/或缀合至一种或多种可检测的标签。在某些实施方式中，编码本文所述的一种或多种结合剂的核酸分子可插入一种或多种表达载体，如下面更详细地讨论。在这种实施方式中，结合剂可由对应于氨基酸序列的核苷酸编码。编码各种氨基酸(aa)的核苷酸(密码子)的具体的组合是本领域熟知的，如在本领域技术人员使用的各种参考文献中描述的(例如，lewin,b.genesv,牛津大学出版社(oxforduniversitypress),1994)。例如，编码所述结合剂的氨基酸的核苷酸序列可参考表9确定。核酸变体可使用编码结合剂的核苷酸的任何组合。表9编码其变体的seqidno.1-138的氨基酸(aa)的密码子本领域普通技术人员理解编码具体氨基酸序列的核苷酸序列可容易地衍生自氨基酸序列和表9(和，在一些实施方式中，例如表5-8)中呈现的信息。例如，可从氨基酸序列ddflh(seqidno.：1)和表9中呈现的信息推断，该氨基酸序列可由核苷酸序列gatgattttttacat(seqidno.:191)编码。本领域普通技术人员将理解，编码seqidno.2-190中任何序列的核苷酸序列可以以相同的方式推断，并且本文考虑这种核苷酸序列。在结合剂是抗体的情况下，编码其可变区的核苷酸序列也可分离自噬菌体和/或表达其的克隆至表达载体的杂交瘤细胞，以产生某些制剂(例如，人源化抗体)。表10显示了编码seqidno.139-190的可变区序列的示例性核酸序列。表10如本领域普通技术人员所理解的，可以修改(比如密码子优化或本领域可用的其它技术)来使用上文使用的序列。制备此类制剂的方法在本文中描述和/或以其它方式熟知并且可由本领域普通技术人员获得。为了确定感兴趣的可变区(例如，cdr)的氨基酸序列，可使用本文所述的功能试验和本领域普通技术人员容易获得的克隆技术选择来自用pd-1抗原/免疫原免疫的小鼠的杂交瘤细胞。例如，为了分离和测序编码所选择的杂交瘤的重链和轻链可变区的核酸，可使用trizol试剂根据制造商的方案从新鲜杂交瘤细胞提取总rna。可使用同种型特异性反义引物或通用引物使用标准技术(例如，根据primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit的技术手册)，从rna合成cdna。然后可进行聚合酶链式反应(pcr)，以扩增编码由选择的杂交瘤产生的抗体的可变区(重链和轻链)的核酸，其然后可分别被克隆至标准克隆载体并且测序。然后可进行集落pcr筛选，以鉴定具有正确尺寸的插入片段(insert)的克隆。优选地，对不小于五个具有正确尺寸的插入片段的单集落的每个抗体可变区进行测序。标准方案然后可用于抗pd-1抗体的表达和纯化。例如，杂交瘤克隆可在无血清培养基中生长并且使细胞培养发酵液离心并且然后过滤。然后可将所过滤的包含抗体的上清液加载在亲和性柱(例如，蛋白质a)柱子上，用适当的缓冲液(例如，pierceigg洗脱缓冲液)冲洗和洗脱。然后可聚集所洗脱的馏分并且缓冲液交换成pbs，ph7.2。然后可经由sds-page和蛋白质印迹通过使用用于分子量、产率和纯度的标准方案分析所纯化的抗体。然后可在适当的柱子(例如，tskgel-g3000swxl柱(tosoh))上进行尺寸排阻色谱hplc，用于生物物理学表征，以便确保高的抗体纯度(一般>90％)，具有少的蛋白质聚集物。这些程序用于从所选择的细胞和其它来源分离和测序编码seqidno.1-190的核酸。如本领域普通技术人员将理解的，这些技术、其变型，和/或其它技术也可用于这些目的。编码一种或多种pd-1结合剂的核酸分子可包含在病毒和/或非病毒载体中。在一个实施方式中，dna载体用于将编码一种或多种pd-1结合剂的核酸递送至患者。这样做时，各种策略可用于提高这种机制的效率，包括例如使用自复制病毒复制子(caley等1999.vaccine,17:3124-2135；dubensky等2000.mol.med.6:723-732；leitner等2000.cancerres.60:51-55)；密码子优化(liu等2000.mol.ther.,1:497-500；dubensky，上文；huang等2001.j.virol.75:4947-4951)；体内电穿孔(widera等2000.j.immunol.164:4635-3640)；并入编码共刺激分子、细胞因子和/或趋化因子的核酸(xiang等1995.immunity,2:129-135；kim等1998.eur.j.immunol.,28:1089-1103；iwasaki等1997.j.immunol.158:4591-3601；sheerlinck等2001.vaccine,19:2647-2656)；并入刺激基序比如cpg(gurunathan，上文；leitner，上文)；靶向内吞或泛素加工途径的序列(thomson等1998.j.virol.72:2246-2252；velders等2001.j.immunol.166:5366-5373)；初始免疫-加强策略(prime-boostregimen)(gurunathan，上文；sullivan等2000.nature,408:605-609；hanke等1998.vaccine,16:439-445；amara等2001.science,292:69-74)；蛋白酶体-敏感切割位点；和使用粘膜递送载体比如沙门氏菌(darji等1997.cell,91:765-775；woo等2001.vaccine,19:2945-2954)。其它方法是本领域已知的，下面描述了其中的一些。已经成功使用将核酸引入至宿主的各种病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(aav)、疱疹病毒和痘病毒等等。可使用本领域技术人员广泛可用的标准重组体技术构建载体。这种技术可见于常规的分子生物学参考文献中，比如molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook等1989,coldspringharborlaboratorypress)、geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,vol.185,editedbyd.goeddel,1991.academicpress,sandiego,ca)和pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis等1990.academicpress,sandiego,ca)。“非病毒”质粒载体也可适于某些实施方式。优选的质粒载体与细菌、昆虫和/或哺乳宿主细胞兼容。这种载体包括例如pcr-ii、pcr3和pcdna3.1(invitrogen,sandiego,ca)、pbsii(stratagene,lajolla,ca)、pet15(novagen,madison,wi)、pgex(pharmaciabiotech,piscataway,nj)、pegfp-n2(clontech,paloalto,ca)、petl(bluebacii,invitrogen)、pdsr-α(pct公开号wo90/14363)和pfastbacdual(gibco-brl,grandisland,ny)以及质粒衍生物(基于高拷贝数cole1的噬菌粒，stratagenecloningsystems,lajolla,ca)、设计用于克隆taq-扩增的pcr产物的pcr克隆质粒(例如，topotmta试剂盒，质粒衍生物，invitrogen,carlsbad,ca)。也可使用细菌载体。这些载体包括例如志贺氏杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳杆菌、卡介苗(bcg)和链球菌(见例如，wo88/6626、wo90/0594、wo91/13157、wo92/1796和wo92/21376)。许多其它非病毒质粒表达载体和系统是本领域已知的并且可被使用。也可使用(suffice)其它递送技术，包括例如dna-配体复合物、腺病毒-配体-dna复合物、dna的直接注射、capo4沉淀、基因枪技术、电穿孔和胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。优选的胶体系统是脂质体，其是用作体外和体内递送媒介的人工膜囊。rna、dna和完整的病毒粒子可封装在水性内部并且以生物活性形式被递送至细胞(fraley,r.等1981,trendsbiochem.sci.,6:77)。脂质体的组合物通常是磷脂，尤其是高相变温度磷脂的组合，通常与类固醇类，尤其胆固醇结合。也可使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特征取决于ph、离子强度和二价阳离子的存在。用于脂质体生产的脂质的例子包括磷脂酰化合物，比如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂和神经节苷脂。尤其有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分包含14-18个碳原子，尤其16-18个碳原子，并且是饱和的。示例性磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。也提供了包括载体的培养的细胞。培养的细胞可以是以载体转染的培养的细胞或细胞的子代，其中细胞表达免疫原性多肽。适当的细胞系是本领域技术人员已知的并且是商业上可获得的，例如，通过美国模式培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc)。转染的细胞可用于产生免疫原性多肽的方法。该方法包括在允许表达免疫原性多肽的条件下(任选地在表达序列的控制下)培养包括载体的细胞。可使用标准蛋白质纯化方法从细胞或培养基分离免疫原性多肽。技术人员掌握许多适当的技术用于使用本文所述的结合剂(例如，抗体)来鉴定包含与其结合的蛋白质的生物样品。例如，使用例如免疫沉淀或其它捕获类型试验，抗体可用于分离pd-1。通过将抗体附着至固体载体或层析材料(例如，包被有蛋白质a、蛋白质g和/或蛋白质l的珠)来进行该熟知的技术。接着，将结合的抗体引入至包含或认为包含pd-1的溶液(例如，感染hiv的t细胞裂解物)。pd-1然后可结合至抗体并且在pd-1保持与抗体结合的条件下冲洗掉非结合材料。结合的蛋白质然后可与抗体分离并且根据需要来分析。使用抗体用于分离蛋白质的类似的方法是本领域熟知的。结合剂(例如，抗体)也可用于检测生物样品中的pd-1。例如，抗体可用于试验比如，例如，流式细胞术分析、elisa、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、原位测定、免疫细胞化学和/或免疫组织化学。进行这种试验的方法是本领域熟知的。本文所述的结合剂也可用于确定患者中疾病状态的存在，以预测预后或确定化疗或其它治疗方案的效力。如本文所描述进行的或如本领域另外已知的表达谱分析(expressionprofileassay)可用于确定pd-1的表达的相对水平。然后可使表达的水平与基础(例如，对照)水平相关联，以确定患者中是否存在具体的疾病、患者的预后，或具体的治疗方案是否有效。例如，如果患者用具体的抗感染方案治疗，则患者组织(例如，外周血、乳腺组织活检)中增加或降低的pd-1的表达水平可指示方案恶化或改善了宿主中传染剂的载荷。表达的增加或降低可指示方案具有或没有期望的作用并且所以可选择另一治疗形式。也可能使用本文所述的结合剂作为药物筛选试验中的试剂，以测试例如新的候选药物。试剂可用于确定候选药物对患者的细胞系或细胞或组织中免疫原性靶标的表达的作用。表达谱技术可与高通量筛选技术结合，以允许快速鉴定有用的化合物和监测用候选药物治疗的效力(见，例如，zlokarnik等，science279,84-8(1998))。候选药物可以是化学化合物、核酸、蛋白质、抗体，或其衍生物，无论是天然存在的或合成衍生的。这样鉴定的候选药物可用作施用至患者或用于进一步筛选试验的药物组合物等其它用途。在一些实施方式中，结合剂为纯化的形式。“纯化的”结合剂(例如，抗体)可以是分离自至少约50％的与其最初一起存在的蛋白质和/或其它组分(例如，在单克隆抗体的情况下，作为杂交瘤上清液或腹水制剂的一部分)的结合剂。纯化的结合剂(例如，抗体)可以是分离自至少约50％、60％、75％、90％、或95％的与其最初一起存在的蛋白质和/或其它组分的结合剂。在施用至宿主之前，本文所述的多肽和核酸可结合一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是非生物或以其它方式非期望的材料，例如，该材料可施用至主体，而不造成任何非期望的生物作用或以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。载体可以是自然选择的，以使活性成分的任何降解最小化并且以使主体中任何不利副作用最小化，如本领域技术人员熟知的。适当的药学载体和它们的制剂描述在，例如，remington’s:thescienceandpracticeofpharmacy,21stedition,davidb.troy,ed.,lippicottwilliams&wilkins(2005)中。典型地，适量的药学上可接受的盐用于制剂，以使制剂等渗。药学上可接受的载体的例子包括但不限于无菌水、盐水、缓冲溶液，如林格溶液和右旋糖溶液。溶液的ph一般是约5至约8或约7至约7.5。其它载体包括持续释放制剂，比如包含多肽或其片段的固体疏水聚合物的半渗透基质。基质可以为成形物体的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的，某些载体可以是更优选的，这取决于，例如，所施用的组合物的施用的路径和浓度。载体是适于施用多肽和/或其片段至人或其它主体的那些。除了免疫原性多肽，药物组合物也可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、免疫刺激剂。药物组合物也可包括一种或多种活性成分，比如抗微生物剂、消炎剂和麻醉剂。药物组合物可通过口服、肠胃外、吸入喷雾、直肠、节点内(intranodally)或局部施用，以包含常规的药学上可接受的载体、佐剂和媒介的剂量单位制剂施用。如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”指适于实现或增强作为药物组合物的核酸、多肽或肽的递送的一种或多种制剂材料。“药物组合物”是包括治疗有效量的核酸或多肽的组合物。术语“有效量”和“治疗有效量”分别指用于观察期望的疗效(例如，恢复t细胞功能)的结合剂、核酸等的量。也提供了用于治疗哺乳动物宿主中的一种或多种疾病病症(例如，hiv或癌症)的方法，其包括向哺乳动物施用至少一个或多个有效剂量的本文所述的一种或多种结合剂(和/或其衍生物)。在一些实施方式中，结合剂是单克隆抗体或其片段或衍生物，其包括seqidno.1-190和/或表1a和1b中显示的一个或多个序列。例如，在一些优选的实施方式中，组合中的结合剂或至少一种结合剂可包括seqidno.1-143和155(例如，如抗体a35795中)、seqidno.166和180(例如，如抗体a35774中)、seqidno.176和189(例如，如抗体135ch1cl1b)和/或seqidno.176和190(例如，如抗体135ch1cl1c)，和/或其保守或非保守取代的变体。优选地，这种结合剂的cdr区(即seqidno.1-138)不被取代。一种或多种结合剂可施用的剂量是约0.1至约50mg/kg、约1至约30mg/kg，或约5至约30mg/kg(例如，约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40mg/kg中的任何)。每种单独的结合剂的量可以相同或不同。在某些实施方式中，一种或多种结合剂可以以约10mg/kg向哺乳动物施用(例如，皮内、静脉内、口服、直肠)一次或多次。当施用多剂时，每剂可包括大概相同或不同量的结合剂。给药也可以相同或不同间隔在时间上彼此隔开。例如，给药可间隔约任何6、12、24、36、48、60、72、84或96小时，1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1.5年、2年、3年、4年、5年，或任何这些时间段之前、之后和/或之间的任何时间段。在一些实施方式中，结合剂可结合其它试剂(例如，抗感染剂和/或化疗剂)施用。这种其它试剂可与结合剂大概同时，或在不同的时间和/或频率施用。这种方法的其它实施方式也可以是合适的，如可由本领域普通技术人员容易确定的。为了帮助技术人员使用本文所述的结合剂比如抗体，其可提供为试剂盒形式。提供了包括这种结合剂比如抗体和任选地对于使用抗体检测表达pd-1的细胞必要的其它组分的试剂盒。可以任何适当的形式提供试剂盒的结合剂比如抗体，包括冷冻、冻干或在药学上可接受的缓冲液比如tbs或pbs中。试剂盒也可包括体外或体内利用抗体所需的其它试剂，比如缓冲液(例如，tbs、pbs)、封闭剂(包括无脂奶粉、正常血清、tween-20清洁剂、bsa或酪蛋白)，和/或检测试剂(例如，山羊抗小鼠igg生物素、链霉亲和素-hrp缀合物、别藻蓝素、b-藻红蛋白、r-藻红蛋白、过氧化物酶、可检测的标签，和其它标签和/或染色试剂盒(例如，abc染色试剂盒，pierce))。试剂盒也可包括其它试剂和/或在上述常用试验中比如，例如，流式细胞术分析、elisa、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、原位测定、免疫细胞化学、免疫组织化学中使用抗体的说明书。在一个实施方式中，试剂盒提供纯化形式的结合剂。在另一实施方式中，结合剂可提供为生物素化的形式，单独或与抗生物素蛋白-缀合的检测试剂(例如，抗体)一起。在另一实施方式中，试剂盒包括含有一种或多种可用于直接检测pd-1的可检测标签的结合剂。使用任何这些系统需要的缓冲液等是本领域熟知的和/或可通过终端使用者制备或提供为试剂盒的组分。试剂盒也可包括固体载体，其包含阳性和阴性对照蛋白质和/或组织样品。例如，用于进行斑点(spotting)或蛋白质印迹类型试验的试剂盒可包括用于sds-page的对照细胞或组织裂解物或包含对于实验样品具有另外的空间的预先固定的对照样品的尼龙或其它膜。用于在载玻片上可视化细胞中pd-1的试剂盒可包括预先格式化的载玻片，其包含对于实验样品具有额外空间的对照细胞或组织样品。本文也考虑试剂盒的其它实施方式，如本领域普通技术人员所理解的。因此，本公开内容提供了激动地(agonistically)或拮抗地结合pd-1的结合剂。在一些实施方式中，结合剂是包括选自seqidno.1-190和/或显示在表1a和1b的至少一条氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，结合剂是包括seqidno.1-138(例如，如表1a和/或1b中显示)和/或任意seqidno.139-190的一个或多个组合的多肽。在一些实施方式中，结合剂是抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.1-23的重链cdr1氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.24-46的重链cdr2氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.47-69的重链cdr3氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.70-92的轻链cdr1氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.93-115的重链cdr2氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括选自seqidno.116-138的重链cdr3氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括seqidno.164-190中的一个或多个序列的抗体，和/或其保守或非保守取代的衍生物。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括seqidno.139-150中的一个或多个序列和seqidno.151-163中的一个或多个序列的抗体。在一些实施方式中，结合剂是多肽，比如包括seqidno.164-177中的一个或多个序列和seqidno.178-190中的一个或多个序列的抗体。例如，在一些优选的实施方式中，组合中的结合剂或至少一种结合剂可包括seqidno.143和155(例如，如抗体a35795中)、seqidno.166和180(例如，如抗体a35774中)、seqidno.175和189(例如，如抗体135ch1cl1b)和/或seqidno.176和190(例如，如抗体135ch1cl1c)，和/或其保守或非保守取代的变体(如表5-8中所示)。在一些实施方式中，结合剂包括表1a和/或1b中显示的cdr的组合和/或具有表3和/或表11-13任何一个或多个中描述的性质。在一些实施方式中，结合剂衍生自或相关于(例如，通过序列或衍生)人抗体、人igg、人igg1、人igg2、人igg2a、人igg2b、人igg3、人igg4、人igm、人iga、人iga1、人iga2、人igd、人ige、犬抗体、犬igga、犬iggb、犬iggc、犬iggd、鸡抗体、鸡iga、鸡igd、鸡ige、鸡igg、鸡igm、鸡igy、山羊抗体、山羊igg、小鼠抗体、小鼠igg、猪抗体和/或大鼠抗体和/或其衍生物。在一些实施方式中，衍生物可选自fab、fab2、fab’单链抗体、fv、单链(例如scfv)、vhh/vh、单特异性抗体、双特异性抗体、三聚体抗体、多特异性抗体、多价抗体、嵌合抗体、犬-人嵌合抗体、犬-小鼠嵌合抗体、包括犬fc的抗体、人源化抗体、人抗体、犬化抗体、cdr移植抗体、鲨鱼抗体、纳米抗体，和/或骆驼(canalid)抗体等等。可以使用任何广泛可用的技术产生这样的抗体、片段等。例如，可以使用美国专利号9,090,994b2(zhang等人)中描述的方法和/或使用广泛可用的试剂盒和/或系统之一(例如，可以从诸如的商业实体(例如，faseba系统)获得)产生人源化抗体。在一些实施方式中，结合剂可以是人源化抗体，其包含seqidno.139-190的一个或多个氨基酸序列(或由编码这种氨基酸序列的核酸序列编码)，和/或其衍生物或变体(例如，保守取代的衍生物或其变体)。如本领域普通技术人员将理解的，还考虑其它实施方式。在一些实施方式中，结合剂可以是人源化抗体，其包含seqidno.139-150中的至少一个和seqidno.151-163中的至少一个，和/或其衍生物或变体(例如，保守取代的衍生物或其变体)。在一些实施方式中，结合剂表现出大约(即，在约250％、200％、150％、100％、75％、50％、25％、20％、15％或10％中的任何之内；和/或最小10nm亲和力(kd10-8m))对人和猴pd-1的结合亲和力(ka(m-1/s-1)、kd(s-1)和kd(m))，由如表12所示的人源化抗体a35796(包括seqidno.140和152)、人源化抗体a35793(包括seqidno.141和153)、人源化抗体a35818(包括seqidno.142和154)、人源化抗体a35795(包括seqidno.143和155)、人源化抗体a35797(包括seqidno.144和156)、人源化抗体a35799(包括seqidno.145和157)、人源化抗体a35805(包括seqidno.146和158)；人源化抗体137fvh1/vl1(包括seqidno.147和159)、人源化抗体137fvh2/vl2(包括seqidno.148和160)、人源化抗体137fvh1b/vl1b(包括seqidno.149和161)、人源化抗体137fvh1c/vl1c(包括seqidno.150和162)，或包括137fvh1b/vl1d(包括seqidno.149和163)的人源化抗体所表明。在一些实施方式中，137fvl1d可以与任何其它137f可变重链组合(或配对)。在其它实施方式中，结合剂可以是包括seqidno.164-177中的至少一个和seqidno.178-190中的至少一个，和/或其衍生物或变体(例如，保守取代的衍生物或其变体)的人源化抗体。在一些实施方式中，结合剂表现出大约(即，约25％、约20％、约15％，或约10％之内；和/或最小10nm亲和力(kd10-8m))对人和猴pd-1的结合亲和力(ka(m-1/s-1)、kd(s-1)和kd(m))，如表13所示的人源化抗体a35775(包括seqidno.164和178)、人源化抗体a35783(包括seqidno.165和179)、人源化抗体a35774(包括seqidno.166和180)、人源化抗体a36443(包括seqidno.167和181)、人源化抗体a35777(包括seqidno.168和182)、人源化抗体a35789(包括seqidno.169和183)、人源化抗体a36448(包括seqidno.170和184)，或人源化抗体a36437(包括seqidno.171和185)；人源化抗体135cvh1/vl1(包括seqidno.172和186)、人源化抗体135cvh2/vl2(包括seqidno.173和187)、人源化抗体135cvh3/vl3(包括seqidno.174和188)、人源化抗体135cvh1b/vl1b(包括seqidno.175和189)、人源化抗体135cvh1ca/vl1b(包括seqidno.176和189)、人源化抗体135cvh1c/vl1c(包括seqidno.176和190)，或包括13scvh1d/vl1c(包括seqidno.177和190)的人源化抗体。在一些实施方式中，结合剂包括至少第一和第二特异性，第一特异性针对pd-1和第二特异性针对不同的抗原(例如，传染剂比如hiv(例如，env)的抗原和/或肿瘤抗原)。在一些实施方式中，结合剂和/或其衍生物可包括可固定地与其连接的可检测标签。在一些实施方式中，任何一种的结合剂和/或其衍生物包括可固定地与其连接的效应子部分(例如，细胞毒性药物、毒素、白喉a链、外毒素a链、蓖麻毒素a链、相思子毒素a链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素和放射化学品)。在一些实施方式中，也提供了编码一种或多种结合剂的多核苷酸(例如，表达载体)。也提供了包括和/或表达这种多核苷酸的多肽产物的宿主细胞。在一些实施方式中，也提供了组合物，其包括至少一种结合剂或衍生物；至少一种分离的多核苷酸；至少一种表达载体；和/或至少一种宿主细胞；或其组合；和药学上可接受的载体。本公开内容也提供了检测细胞上pd-1的方法，该方法包括使测试生物样品与本文所述的结合剂或衍生物接触并且检测与生物样品或其组分结合的结合剂。这种方法可以是体内方法或体外方法。在一些实施方式中，方法可包括比较结合至测试生物样品或其组分的量与结合至对照生物样品或其组分的量，其中相对于对照生物样品或其组分，与测试生物样品或其组分增加的结合指示测试生物样品(例如，哺乳动物血液)中存在表达pd-1的细胞。在一些实施方式中，提供了通过下述方法用于鉴定pd-1抗体结合剂的系统：由耗竭功能恢复试验(efra)测试候选结合剂；确定候选结合剂对于pd-1的亲和力；和，确定候选结合剂的cdr的核苷酸序列。在一些实施方式中，一种用于检测细胞中或细胞上pd-1表达的试剂盒，该试剂盒包括结合剂或其衍生物和使用说明书。在一些实施方式中，结合剂和/或其衍生物为冻干形式。在一些实施方式中，本公开内容提供了用于治疗、预防和/或减轻哺乳动物中传染病、癌症和/或自身免疫的方法，包括向哺乳动物施用至少一个有效剂量的包括结合剂或其衍生物的药物组合物。在一些实施方式中，传染病是人免疫缺陷病毒(hiv)。在一些实施方式中，用于治疗传染病和/或癌症的结合剂和/或其衍生物是pd-1拮抗剂。在一些实施方式中，用于治疗自身免疫病症的结合剂和/或其衍生物是pd-1激动剂。在一些实施方式中，向所述动物施用多剂。在一些实施方式中，结合剂和/或其衍生物可以以约0.1至约50mg/kg、约1至约30mg/kg，或约5至约30mg/kg(例如，约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40mg/kg)的剂量施用。本公开内容也提供了pd-1结合剂的组合。在一些实施方式中，组合包括阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合剂和不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合剂。示例性的组合可包括，例如，一种或多种阻断性抗pd-1抗体和一种或多种本文所述的非阻断性结合剂，比如包括135c12(seqidno.17、40、63、86、109和132)、139d6(seqidno.2、25、48、71、94和117)、135d1(seqidno.3、26、49、72、95和118)，和/或136b4(seqidno.19、42、65、88、111和134)的氨基酸序列的那些中的任何一种或多种。示例性的实施方式包括阻断性抗体mk3475(派姆单抗)或包括氨基酸序列seqidno.8、31、54、77、100和123(137f2)的阻断性结合剂，与包括氨基酸序列seqidno.17、40、63、86、109和132(135c12)的非阻断性pd-1结合剂的组合。如图9a、b所示，这这些示例性组合均导致功能耗竭的减轻增强和hiv特异性cd8+t细胞增殖的增加，超过各抗体单独可以实现的。其它示例性非阻断性抗体可以与阻断性抗体mk3475或137f2和非阻断性p2块片特异性(m4(图3a、b))结合剂135d1(包括seqidno.3、26、49、72、95和118)，和/或结合剂139d6(seqidno.2、25、48、71、94和117)，和/或非阻断性p2块片特异性(m17(图3a、e))结合剂136b4(包括seqidno.19、42、65、88、111和134)组合使用。如本领域普通技术人员可以确定的，其它组合也可以是合适的。这种组合可用于本文所述的或本领域技术人员可另外确定的任何用途。例如，这种组合可用于本文所述的治疗、预防和/或减轻哺乳动物中传染病、癌症和/或自身免疫的方法中。在一些实施方式中，还提供了用于治疗主体的炎症的方法，包括施用至少两种拮抗性pd-1结合剂的组合，其中每种所述结合剂对pd-1上的不同表位具有特异性，至少一种所述结合剂阻断pd-1和pd-l1的相互作用，并且至少一种所述结合剂不阻断pd-1和pd-l1的相互作用。本公开内容还提供了通过施用至少两种拮抗性pd-1结合剂的组合来治疗主体的慢性神经变性病症的方法，其中每种所述结合剂对pd-1上的不同表位具有特异性，至少一种所述结合剂阻断pd-1和pd-l1的相互作用，并且至少一种所述结合剂不阻断pd-1和pd-l1的相互作用。在一些实施方式中，慢性神经变性病症是阿尔茨海默氏病。本公开内容还提供了用于体内抑制肿瘤细胞(例如人肿瘤细胞)生长的方法，例如用于治疗癌症，该方法包括给予至少两种拮抗性pd-1结合剂的组合，其中每种所述结合剂对pd-1上的不同表位具有特异性，至少第一种所述结合剂阻断pd-1和pd-l1的相互作用，并且至少第二种所述结合剂非阻断pd-1和pd-l1的相互作用。在一些实施方式中，所述组合可包括阻断结合剂，比如抗体，包括raskgvstsgysylh(seqidno.287)、lasyles(seqidno.288)、qhsrdlplt(seqidno.289)、nyymy(seqidno.290)、ginpsnggtnfnekfkn(seqidno.291)和/或rdyrfdmgfdy(seqidno.292)；mk3475；和/或keytruda中的至少一种。在一些实施方式中，非阻断性结合剂(比如抗体)可包括seqidno.17、40、63、86、109和132中的至少一种或seqidno.164-190(例如seqidno.176和190)中的任何一个或多个，和/或包括其至少一个氨基酸取代的衍生物。在一些实施方式中，向哺乳动物施用多剂量，其可分开约一周、约两周、约三周，或优选约一个月或更长。本公开内容也提供了通过在细胞中表达结合剂和从细胞或细胞的培养物上清液分离结合剂，来产生本文所述的结合剂的方法。在一些实施方式中，这种方法可进一步包括表达编码这种结合剂的核酸。在一些实施方式中，这种方法也可包括将分离后的结合剂与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。本公开内容也提供了产生结合剂比如阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合剂和不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合剂的组合的方法。在一些实施方式中，第二结合剂结合pd-1。在一些实施方式中，第一和/或第二结合剂是抗体，如单克隆抗体或其片段或衍生物。在一些实施方式中，第二结合剂包括氨基酸序列seqidno.17、40、63、86、109和132(例如135c12)；seqidno.2、25、48、71、94和117(例如139d6)；和/或seqidno.19、42、65、88、111和134(例如136b4)。在一些实施方式中，这些方法可进一步包括添加药学上可接受的赋形剂。术语“大约(about)”、“大概(approximately)”等，当在一列数值或范围之前时，独立地指代该列或范围中的各个单独值，如同该术语就在该列或范围内的各个单独值之前。该术语意思是其指代的值精确地是、接近或类似于该值。如本文所使用，主体或宿主意思是个体。主体可包括家养的动物，比如猫和狗、牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验室动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)和鸟类。在一个方面中，主体是哺乳动物比如灵长类或人。任选的或任选地意思是随后描述的事件或情况可出现或不出现，并且该描述包括出现该事件或情况的例子和其不出现的例子。例如，短语任选地组合物可包括组合，意思是组合物可包括不同分子的组合或可不包括组合，使得描述既包括组合也包括没有组合(即，组合的个体成员)。范围在本文可表达为大约一个具体的值，和/或至大约另一具体的值。当表达这种范围时，另一方面包括从一个具体的值和/或至另一具体的值。类似地，当在前面使用大约或大概，值表达为近似值时，应当理解具体的值形成另一方面。应进一步理解，每个范围的端点即与另一端点显著有关系的，也独立于另一端点。范围(例如，90-100％)意思是包括范围本身以及范围内的每个独立值，如同单独地列出了每个值。术语“组合(combined)”或“组合(incombination)”或“结合(inconjunction)”可指一起施用的试剂的物理组合或在用于治疗、预防和/或减轻具体疾病的方案(例如，物理和/或时间上分别施用)中两种或更多种试剂的使用的物理组合。当本文结合用于给定的病症(例如，预防癌症、hiv感染)的给定治疗使用术语治疗、预防和/或减轻或其衍生字时，意思是表达治疗的患者根本不发展临床上可观察到水平的病症，或比他/她没有治疗时更缓慢地和/或更低程度地发展。无论什么，这些术语不仅仅限于患者未经历病症方面的情况。例如，如果在将患者暴露于可预期产生给定病症表现的刺激期间给予治疗，并且使得患者经受比另外预期的该病症更少的和/或更轻微症状，则认为治疗已经预防了病症。例如，通过使患者仅仅展示感染的轻微明显症状，治疗可“预防”感染；这不意味着感染微生物必须不渗透任何细胞。类似地，如本文结合通过具体的治疗来预防、治疗和/或减轻给定病症使用的减轻(reduce)、减轻(reducing)和减轻(reduction)，通常指主体与在没有治疗(例如，施用一种或多种pd-1结合剂)情况下发展感染的对照或基础水平相比，更缓慢地或较低程度地发展感染。感染风险的降低可使得患者仅仅展示感染的轻微明显的症状或延迟感染的症状；这并不意味着感染微生物必须不渗透任何细胞。本公开内容引用的所有参考文献通过引用以它们的整体并入本文。在下面的实施例中进一步描述某些实施方式。提供这些实施方式仅仅作为实施例并且决不旨在以任何方式限制权利要求的范围。实施例实施例1pd-1结合剂的产生和表征四种小鼠品种(总共16只小鼠)已经用两种pd-1蛋白，即人pd-1fc融合蛋白和人pd-1单体蛋白免疫。已经选择对于激活的人t淋巴细胞上表达的pd-1显示血清反应性的小鼠，用于产生抗pd-1杂交瘤细胞系。选择了总共240个pd-1杂交瘤细胞系，用于产生结合至重组pd-1蛋白的抗体。用于第一轮抗体选择的主要标准是：i)通过流式细胞术，激活的人t淋巴细胞上的pd-1的染色；ii)与现有抗pd-1抗体的那些序列相比，cdrvh和vl序列的多样性；和iii)通过pd-1缀合的luminex珠与两种商业上可获得的结合至pd-1上不同表位的抗pd-1抗体的竞争结合研究进行的表位作图。接着通过如下进行第二轮选择：iv)亲和力结合试验(不是主要标准，因为其与抗pd-1抗体的刺激潜能不相关)；v)在luminex生物化学试验中评估结合pd-1并且阻断或非阻断与pd-l1的结合的抗pd-1抗体；和vi)抗体作为激动剂(不能使t-细胞从功能耗竭中恢复)或拮抗剂(能够使t-细胞从功能耗竭中恢复)的功能表征。在这些研究中，测试抗体并且基于它们挽救hiv特异性耗竭cd8t细胞的增殖的能力来区分。在从单个细胞培养的杂交瘤细胞克隆中初始筛选抗体上清液时，进行efra试验，以评估抗pd1抗体对hiv特异性cd8t细胞的增殖的功能效果。发现抗体克隆e8-3、c2-3、e1-3、f3-3、h8-3、c10-2、g2-1、g3-2、h2-1和h4-2用作pd-1拮抗剂并且刺激增殖，而抗体克隆c8-1和g10-2是激动性的并且促进pd-1负调节作用。肽对照(pep8)诱导的增殖水平仅低于1％，并且merckmk-3475抗pd1抗体诱导的增殖仅高于2％。通过这些方法鉴定的感兴趣的抗体进行第二轮亚克隆并且所得杂交瘤克隆用于产生和纯化表3中的抗体。用纯化的抗pd-1抗体进行结合试验，以确保亚克隆保留它们对pd-1的亲和力。在激活的cd4t细胞上，评估抗pd-1抗体对细胞表面pd-1的浓度应答结合。efra提供用于选择将t细胞从功能耗竭中恢复的结合剂，但是不必限制结合剂不干扰pd-1和其生物配体(例如，pd-l1或pd-l2)的相互作用。efra的实施方式是为了鉴定结合pd-1的这种结合剂(抗体)。用两个独立的生物化学试验进行结合至pd-1的抗体的表位作图。在一个试验中，在两个商业抗pd-1抗体(克隆eh12.2h7和j116)之一和列举的抗pd-1抗体(也描述在表3中)之间评估与pd-1fc融合蛋白标记的珠的竞争结合。基于该试验鉴定了结合至不同的表位的四类单克隆抗体。这些是：类别1(与阻断pd-1与pd-l1的相互作用的eh12.2h7商业单克隆抗体克隆竞争)、类别2(与结合pd-1但是不有效阻断pd-1与pd-l1相互作用的j116商业单克隆抗体克隆竞争)、类别3(与eh12.2h7和j116商业单克隆抗体都竞争)，和类别4(与eh12.2h7或j116商业抗体不竞争)。抗体分入所述四种类别之一，并且这些抗体对于细胞表面pd-1的相对结合由相对于对照抗pd-1抗体的平均荧光强度(mfi)来表示。这些结果显示从所有四个结合类别中鉴定了紧密的结合抗体。第二luminex结合试验用于直接评估抗pd-1抗体是否阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用。使用pd-1fc融合蛋白包被的珠进行该试验，所述珠用表3中的20nm的抗pd-1抗体培育，接着用不同浓度的生物素化pd-l1培育pd-1/抗体复合物。将结合曲线与不存在抗pd-1抗体竞争剂的情况下pd-l1的结合进行比较。发现来自表3的一些抗pd-1抗体可以竞争性地阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用(图1a中所示的抗体137f2)。表3中列出非阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体导致pd-l1对pd-1的结合亲和力的变化，但是当pd-l1的浓度增加时不阻断相互作用(分别如图1b和c所示的抗体135c12和136b4)。在一种解释中，这些抗体与pd-1/pd-l1相互作用是非竞争性的或部分竞争性的。这些抗体中的一些抗体相对于对照也显示具备统计学上显著增加的增殖。类别1抗体(与阻断pd-1与pd-l1相互作用的eh12.2h7商业单克隆抗体竞争)或在pd-1/pd-l1相互作用试验中阻断的通常确定为提供改善的增殖恢复。结合来自多个efra实验的数据和使用mk-3475作为常见的比较物，选择表2中描述的抗体，所述抗体与基准mk-3475抗体相比展示等同的或统计上改善的活性(p<0.007)。实施例2抗体组合在功能耗竭恢复试验中，发现结合至不同pd-1表位的抗体的组合增强恢复hiv肽特异性cd8+t细胞增殖。也观察到了抗体类型之间的协同作用。例如，确定了类别1(mk-3475)和类别2(139d6)抗体能够同时结合pd-1。尽管对于mk-3475观察到的最大刺激一致地相对于hiv肽是大约200％，但是各5μg/ml的mk-3475和139d6单克隆抗体的组合展示了协同作用，hiv特异性cd8t细胞增殖相对于单独hiv肽对照增加288％或相对于单独添加的mk-3475或139d6增殖有144％增加。在数个实验测试中观察到了增殖的该协同增加，统计学上显著的p值是0.007。作为比较，单独添加10μg/ml的mk-3475或139d6，在efra中不导致增加的增殖。因此，已经确定了阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第一结合剂与不阻断pd-1和pd-l1的相互作用的第二结合剂的组合协同作用，以挽救t细胞避免耗竭。实施例3抗pd-1抗体的表位作图初步表位作图评估依赖于市售抗pd-1抗体(eh12.2h3和j116)与本专利中定义的新鉴定的抗pd-1抗体之间的生物化学竞争性结合测定试验。该方法允许我们基于与两种商业抗体中的任一种竞争性或非竞争性结合将抗体分类为四种结合类别之一。定义pd-1上抗体结合表位的更精确方法是监测抗体与不同pd-1蛋白的相互作用，该pd-1蛋白在溶剂可及残基上具有谨慎的(discreet)氨基酸取代。如果这些残基对于抗pd-1抗体的紧密结合是重要的，则所述取代可导致pd-1蛋白的结合降低。这些研究通过在cmv启动子控制下在preceiver-m67哺乳动物表达载体内编码的pd-1基因的定点诱变来进行。使用3rrqpdb公布的pd-1蛋白结构数据，设计了31个不同的pd-1克隆，其在溶剂可及残基处具有单、双或三个氨基酸取代。基于人pd-1和pd-l2之间复合物的公开晶体结构确定pd-1和pd-l1/l2之间相互作用涉及的残基(lazar-molnar，pnas，2008，p10483-10488)并映射到图2中的pd-1结构作为编号球体(编号对应于人pd-1的氨基酸残基(图2h，seqidno.275))。选择残基处的取代，该残基涉及pd-1/pd-l1相互作用(由m10、m11、m12、m14、m23、m24、m25表示)，或在pd-1蛋白的相对或相邻表面上而不直接涉及pd-l1相互作用(由m1、m2、m3、m4、m5、m6、m7、m8、m9、m13、m15、m16、m17、m18、m19、m20、m21、m22、m26、m27、m28、m29、m30、m31表示)并在图3中定义。然后使用lipofectamine2000转染试剂将pd-1编码dna载体用于瞬时转染hela细胞。将细胞在37℃的细胞培养箱中孵育36-48小时以允许pd-1蛋白的细胞表面表达，然后将细胞重新悬浮并用0.3至2μg/ml之间的选自表3的给定抗pd-1抗体孵育30分钟。洗涤步骤后，用pe标记的抗小鼠igg二级抗体对细胞染色，然后通过流式细胞术分析。在每个实验中，野生型pd-1蛋白用作抗体结合的阳性对照，并且平行评估几种结合pd-1上不同表位的抗体(通过阻断或非阻断pd-1/pd-l1相互作用或从与市售pd-1克隆的竞争性结合研究来确定)以监测具有不同氨基酸取代的pd-1蛋白的相对表达水平。来自表3的测试的所有抗pd-1抗体特异性结合用野生型pd-1转染的hela细胞，但不结合用空载体对照转染的细胞。所有突变体pd-1蛋白在接近野生型水平表达或相对于未转染的对照产生平均荧光强度的显著变化(当用阻断或非阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗pd-1抗体染色时)。然后系统地测试来自表3的一组选择的抗体结合在转染的hela细胞的细胞表面表达的野生型或突变体pd-1蛋白的能力。这些结果汇总在表11中，突变表明消除或减少每种不同抗pd-1抗体克隆的结合。图4-8中描绘的流式细胞术直方图提供了不同抗体的实例，所述抗体与用指定的突变体pd-1构建体转染的hela细胞有效结合或具有降低的亲和力。正如预测的那样，在生物化学试验中显示阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体(mk-3475、137f2、140g5和139f11)也与pd-1上与这种相互作用位点重叠的表位结合。与生化pd-1/pd-l1相互作用研究一致，非阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体(136b4、135c12、136e10)与远离(distalto)涉及pd-1/pd-l1相互作用的氨基酸残基的不同表位结合。在图8中，对于136b4和122f10抗体观察到与m17pd-1蛋白结合的显著变化(shift)，而对于m26pd-1蛋白观察到135c12抗体的结合的小变化。这些差异突出了这样的事实：136b4和135c12具有属于不同家族的cdr环并且结合pd-1上的不同表位，其与p2块片重叠，如图13所示。表11阻断或非阻断pd-1/pd-l1相互作用的不同抗pd-1抗体克隆的表位作图。*通过对活化的cd4t细胞上的内源细胞表面pd-1的facs染色评估表1中列出的抗体的结合亲和力。**结合类别通过luminex试验竞争结合研究确定。结合类别1mab克隆与eh12.2h7克隆商业抗体竞争，类别2mab克隆与j116克隆商业抗体竞争，类别3mab克隆与eh12.2h7和j116抗体竞争，并且类别4mab克隆在eh12.2h7和j116抗体的存在下结合。***在第二luminex结合试验中确定与pd-1/pd-l1相互作用的抗体竞争。在该试验中，将pd-1fc融合蛋白包被的珠在不存在或存在表3的抗pd-1抗体的情况下以20nm的浓度培养。固定浓度的1.25nm生物素化pd-l1(大约相当于pd-1/pd-l1相互作用的ic50)然后与pd-1/抗体复合物一起培养，并通过用藻红蛋白标记的链霉亲和素的荧光检测pd-l1结合。基于pd-l1与pd-1/抗体复合物的结合，抗体定义为阻断或非阻断pd-1/pd-l1相互作用。使用cfse试验(耗竭功能恢复试验“efra”的实施方式)评估增殖效应。在存在和不存在抗pd-1抗体的情况下，用hiv特异性肽刺激从慢性感染的hiv主体中分离的pbmc。培养6天后，相对于单独的肽对照，在抗pd-1处理的样品中评估hiv特异性cd8t细胞增殖。§抗体与编码氨基酸取代的突变体pd-1结合的小变化。na＝未获得实施例4非阻断抗体表位与pd-1的新拮抗作用相关在功能耗竭恢复试验中评估结合pd-1上不同表位的抗体的拮抗活性。这些研究揭示拮抗性抗体可以阻断或不阻断pd-1/pd-l1相互作用。考虑到归因于抗pd-1抗体的功能活性的作用模式是通过pd-1阻断，这些结果表明非阻断拮抗性抗体抑制pd-1的新功能。该主张得到以下事实的支持：阻断和非阻断抗pd-1抗体的组合在体外耗竭功能恢复测定中导致增强的拮抗活性。这种增强的功能活性超出了单独给予各抗体时可以达到的诱导水平，并且由阻断(即竞争性)抗pd-1抗体(mk3475或137f2)与非阻断的(即，生物化学pd-1/pd-l1相互作用试验中的非竞争性或部分竞争性)抗pd-1抗体135c12(图9a)或139d6(图9b)的不同组合证明。作为其功能活性的进一步证据，在混合淋巴细胞反应试验(mlr)中单独或在pd-1/pd-l1阻断和非阻断性拮抗抗体之间的组合中测试抗pd-1抗体。mlr试验涉及将来自一个健康供体的单核细胞与来自第二健康供体的pd-1+记忆cd4t细胞混合。通过用磁珠进行cd14阳性选择，从外周血单个核细胞(pbmc)中分离单核细胞。来自第二供体的pbmc首先用磁珠去除表达cd45ra的细胞，然后使用不同组的磁珠对cd4阳性t细胞进行阳性选择。然后用aqualive/dead染色试剂盒和127c2抗pd-1抗体克隆(显示没有拮抗活性并且不与mk3475、137f2或135c12竞争结合pd-1)和第二抗小鼠pe抗体染色这些记忆cd4t细胞(cd4+cd45ra-)以在活的pd-1+细胞群上分选。在以1：2或1：5的比例混合来自两个不同供体的单核细胞和cd4+t细胞后，将细胞保持未处理或用图10中所示的1μg/ml抗pd-1抗体处理。在细胞培养箱中培养5天后，收集细胞培养物上清液的等分试样并通过elisa分析分泌的ifnγ。将氚标记的胸苷(3h-tdr)加入细胞培养基中，并将细胞再培养18小时。3h-tdr掺入用作细胞增殖的量度。该第二次独立的体外试验证实了我们的抗pd-1抗体的功能活性。在图10a中，由单个和组合的抗pd-1抗体诱导cd4+t细胞的增殖增加高达2倍。在图10b中，观察到当单独测试时，所有抗pd-1抗体的ifnγ产生强烈增加，137f2产生最高水平的诱导。在阻断和非阻断抗pd-1抗体(mk3475和135c12，或137f2和135c12)的组合中，观察到pd-1+记忆cd4t细胞增殖增加和ifnγ产生增加的趋势。鉴于当用pd-1免疫检查点阻断疗法(baruchk，naturemed，2015)治疗时，在阿尔茨海默病小鼠模型中，来自cd4+t细胞的ifnγ产生的增加与病理(pathology)减少和记忆改善相关，因此，用所概括的抗pd-1抗体或抗pd-1抗体的组合进行治疗预期具有相同或改善的治疗益处。如下所述，表位作图显示具有最大效力的非阻断性抗体全部都结合相似的pd-1块片，在本文中称为“p2块片”，其与以下区域重叠：m4氨基酸取代的区域(丝氨酸38至丙氨酸，脯氨酸39至丙氨酸和亮氨酸41至丙氨酸(图3；seqidno.142))和/或m17氨基酸取代的区域(天冬酰胺102至丙氨酸和精氨酸104至亮氨酸(图3；seqidno.155))和/或m18氨基酸取代的区域(天冬氨酸105至丙氨酸(图3；seqidno.156)，和/或m31氨基酸取代的区域(亮氨酸41至丙氨酸和缬氨酸43至亮氨酸(图3；seqidno.206)。为了进一步研究与抗pd-1抗体的拮抗活性有关的pd-1区域，将来自不同物种的溶剂可及的变体氨基酸残基作图于人pd-1结构。基于3rrqpdb的这种结构表示示出了pd-1的面，所述面与图11a中的pd-l1/l2和图11b中的pd-1的相对侧相互作用。猴子和人pd-1之间不相似的残基用红色圆圈表示，啮齿动物pd-1(小鼠和大鼠)中发现的其它变异残基显示为绿色圆圈，来自狗pd-1的其它变异残基显示为橙色。残基46、58、74和116被揭示为n-连接的糖基化位点，并用青色圆圈标记。图11c中显示人、猴、马、狗、小鼠和大鼠pd-1胞外域氨基酸序列的比对，与人pd-1的相应同源性分别为96.6％、79.9％、73.2％、62.4％和66.4％。通过在结构上显示pd-1的这些跨物种变体残基，显然在pd-1上存在两个保守的块片，在图11a和11b中指定为p1和p2。p1块片对应于pd-1和pd-l1/pd-l2配体之间相互作用涉及的中心区域(将图2中用球体标记的残基与图11a中的那些进行比较)。预期该p1块片具有跨物种保守性，因为在进化过程中在pd-1中积累的变体残基仍然需要维持与pd-l1/l2配体的相互作用。用小鼠变体观察到与pd-1/pd-l1相互作用有关的残基的选择取代(例如残基64和68)，并且可归因于pd-1与其pd-l1/l2配体的共同进化；但是，p1内的核心相互作用区域维持保守。进化上保守的p2块片占据与p1块片相似的表面积，但该区域在结构上或功能上都没有先前确定的pd-1的作用。在所研究的物种中p2块片在进化上是保守的这一事实表明pd-1处于功能压力下以保持p2位点。鉴于pd-1胞外域在所研究的四种物种中仅62.4％至79.9％保守，这种保守性更为显著。考虑到与人pd-1相比这四种物种中的所有变体残基给出甚至更低的52.3％序列保守性(图11c，蓝色箭头表示图11a和11b中描绘的结构区域)。无论该功能压力是否归因于用作尚未鉴定的配体的相互作用位点的p2块片，较高阶复合物形成的位点或与pd-1相关的信号传导事件相关的位点仍有待确定。但是，本文所述的抗pd-1抗体包括具有与p2块片重叠结合表位的135c12、139d6、135d1和136b4，为该区域的功能重要性提供了直接证据。鉴于先前在pd-1的功能活性中没有涉及该区域，本文提出在图11b中所示的具有与pd-1上的块片2重叠的结合的由135c12示例的抗体代表了发挥对pd-1的拮抗活性的新的机制和位点。本文还提出，可以与pd-1的该块片2区域相互作用的其它抗体、抗体片段或其它蛋白质结合剂也将以与抗-pd-1抗体不同且互补的方式充当pd-1的拮抗剂，所述抗-pd-1抗体通过阻断pd-1/pd-l1相互作用起作用，如图9、10和17-20所示。作为pd-1上块片2区域的重要性的另一个实例，136b4抗体与pd-1上的不同表位结合，而抗体135c12、139d6和135d1也与块片2重叠。136b4显示出与m17和m18pd-1突变结合的强烈降低的亲和力，m17和m18pd-1突变位于p2块片边缘(m17：天冬酰胺102至丙氨酸和精氨酸104至丙氨酸，m18：天冬氨酸105至丙氨酸)。与135c12、139d6和135d1抗体一起，136b4显示出所有测试的非阻断抗体的最高功能活性。实施例5抗体竞争结合研究为了进一步表征表3中列出的所选抗体的结合表位，进行了一系列抗体竞争研究用于结合细胞表面pd-1。使用maxpar抗体标记试剂盒(fluidigm)化学缀合结合pd-1上不同表位的抗体(mk3475、137f2、135c12和134d2)。在该方法中，部分还原抗体二硫键以使半胱氨酸残基与金属螯合聚合物缀合。然后将这些金属同位素修饰的抗体用于染色细胞以获得表面pd-1的表达水平，并通过质谱流式细胞技术进行分析。为了产生具有高表达水平的pd-1的cd4t细胞，用pha和il-2刺激来自健康供体的外周血单个核细胞并培养5天。细胞染色后，进行设门(gating)以选择活的cd3+/cd4+细胞，并通过质谱流式细胞技术评估每个样品的pd-1的细胞表面水平。在抗体竞争测定中，将2×106个细胞的样品在4℃下与15μg/ml图12中所示的指定的竞争抗体之一一起培养30分钟。然后将其中一种用金属同位素标记的染色抗pd-1抗体(mk3475、137f2、135c12或134d2)以<1μg/ml加入细胞中，再培养20分钟，然后洗涤以除去未结合的抗体，并分析细胞表面pd-1的水平。使用小鼠igg1同种型对照抗体作为阴性对照，并且作为参考，计算相对于用抗pd-1竞争抗体克隆培养的样品的pd-1阳性细胞百分比。阻断pd-1/pd-l1相互作用的类别1抗pd-1抗体全部均具有竞争性(如图12所示，相对于igg1对照，pd-1阳性细胞染色≤29％)，实验中pd-1高细胞用mk3475或137f2染色。考虑到这些抗体中的几种抗体的表位作图具有相同或重叠的结合位点，因此这些结果是预期的。类别1抗体与134d2抗体也具有竞争性或部分竞争性(如图12所示，相对于igg1对照，染色30-59％)。虽然阻断pd-1/pd-l1相互作用，但134d2与主要与m15突变体重叠的表位结合，但在较小程度上与17突变结合。发现类别1抗体与135c12抗体是非竞争性的(相对于igg1对照的pd-1阳性细胞的标记抗体染色结合≥60％，如图12所示)，证实了表位结合研究，其表明这些抗体结合pd-1上的不同位点。使用类别2抗体作为竞争剂，mk3475和137f2标记的抗体结合相对于igg1对照的结合几乎没有减少或没有减少。一个例外是135d1抗体，其阻断标记的137f2的pd-1结合。鉴于135d1表位接近m4突变，似乎在m23突变区域的137f2抗体结合中存在一些硬脂酸铰链(stearichingerance)。135c12和139d6克隆也具有与编码m4突变的pd-1结合的改变，但是鉴于它们不与137f2的结合竞争，这些类别2抗体的结合更多地集中于p2块片区域。135c12抗体与m17、m18、m26、m28和m31突变的结合也发生小变化，这些突变均在p2块片的边缘发现。用作竞争剂的所有类别2抗体阻断标记的135c12的结合，证实它们与pd-1上的重叠表位结合。大多数类别2竞争抗体不与标记的134d2竞争结合pd-1。136b4抗体是类别2抗体的例外，其阻断134d2的结合。这些结果与实施例3中的表位结合研究一致，其中134d2与pd-1的结合被m17突变部分地破坏，但主要是被m13和m15突变破坏。136b4抗体的结合仅被边缘上或p2块片内的m17和m18突变破坏。类别3抗体与mk3475和137f2竞争或部分竞争(定义为相对于igg1对照的30-59％染色，如图12所示)，并且与135c12非竞争性结合pd-1。135e10类别3抗体与标记的134d2竞争，而140a1类别3抗体与标记的134d2是非竞争性的。表位作图显示140a1在m13突变的区域中结合，其不同于134d2的结合表位(m15主要和m17次要)。在评估类别4抗体的功能数据时，只有134d2和136b5具有显著的拮抗活性，导致耗竭功能恢复试验中hiv特异性cd8t细胞的增殖增加(如图12所示，>150％增加的增殖)。这些抗体还在生化试验中阻断pd-1与pd-l1的相互作用，因此很可能通过pd-1/pd-l1阻断作为拮抗剂起作用。由于过量的136b5阻断了具有标记的134d2的pd-1+细胞的染色，这些抗体在相似或重叠的表位处结合pd-1(图12)。与剩余的类别4抗体的竞争性结合数据显示它们结合pd-1上的不同位点，并且该结合通常与135c12抗体不重叠。122f10抗体是例外，其结合136b4的类似或重叠表位，因为这两种抗体在抗体竞争研究中具有相似的结合谱(图12)，并且两者都降低m17突变体pd-1构建体的结合(表11)。在组合来自通过pd-1的溶剂可及残基处的氨基酸取代进行的表位作图研究(实施例3)和抗体竞争研究(图12)的信息时，被不同的抗pd-1抗体克隆结合的pd-1上的区域的一致结构图显示在图13a和13b)中。对于表11中的大多数克隆，这些结合表位用不同颜色的圆形块片表示。图13a显示了pd-1的面，其具有pd-1/pd-l1或pd-1/pd-l2相互作用中涉及的大部分残基。例外是残基89和90，发现它们位于柔性环区域上的图13a的左侧。与pd-1/pd-l1相互作用竞争的一组主要抗体全部都与pd-1的这个面结合，包括克隆137f2、139f11、140a1、140g5和mk3475。应该注意的是，我们在功能试验中鉴定出具有最高拮抗活性的两种抗体(表11)都结合p1块片的中心，如图11a和13a所示，并且以pd-1的124-126残基为中心。137f2和139f11具有显著不同的重链和轻链cdr序列并且基于本申请中讨论的所有抗体克隆的序列比对属于不同家族的事实证实了该发现。抗体克隆134d2和136b5显示在生物化学测定中与pd-1/pd-l1相互作用竞争，尽管它们结合图13b中与m13、m15和m17突变重叠的pd-1区域。基于该映射的表位，这些抗体结合pd-1的残基85和86附近，其是含有残基89和90的pd-1上的环区域的一部分。由于残基89和90涉及与pd-l1的相互作用(图2a)，与该环区域的结合可诱导pd-1的构象变化，其抑制与pd-l1的结合。与这些观察结果一致，抗体竞争研究表明，添加竞争剂类别1抗体导致标记的134d2抗体的结合显著降低(图12)。表3中列出的非阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体全都与远离pd-1/pd-l1相互作用中涉及的残基的表位结合。具有强功能活性的抗体(功能恢复试验中的>150％增强的cd8t细胞增殖，图12)，全部都结合在与图13b中所示的p2块片重叠的表位中。135c12(测试所有突变体)、139d6(测试选择的突变体)和135d1(测试选择的突变体)抗体克隆具有相关的重链和轻链cdr序列并且结合到与m4、m18和m31突变重叠的位点。136b4抗体克隆具有不同的cdr序列，并且观察到与m17和m18突变体pd-1的结合亲和力的大的变化，表明其结合p2块片边缘上的不同表位。135c12抗体与136b4克隆竞争结合但不与134d2或136e10克隆竞争结合。这些抗体竞争性结合研究进一步支持135c12、139d6135c1和136b4与跟p2块片重叠的表位结合。136e10抗体的结合表位定位于m1突变(其完全消除该抗体与pd-1的结合)。实施例6通过抗体药物缀合物的靶向细胞杀伤如本文所讨论的，结合剂如抗体(例如，表3)可以与毒素缀合，以进行靶向杀伤pd-1表达细胞。该策略的治疗益处的例子包括靶向消除主要是pd-1阳性的hiv感染的cd4+t细胞。为进行这些研究，在抗体二硫键部分还原后，两个不同的抗pd-1抗体(140g5和136b5)通过可接近的半胱氨酸基团与peg4-vc-pab-pnu-159682(此后称为pnu)化学缀合。通过疏水相互作用色谱和尺寸排阻色谱分析抗体药物缀合物(adc)，发现两个样品含有>95％pnu缀合的抗体。在adc杀伤试验中，从慢性感染hiv-1病毒的患者的pbmc中分离cd4+t细胞。将这些cd4+t细胞与同种型对照抗体、140g5mab、140g5-pnumab缀合物、136b5mab或136b5-pnumab缀合物一起培养。抗体浓度均为10μg/ml，细胞在37℃下在含有5％co2的细胞培养箱中培养5天。在第五天，用抗体染色细胞用于流式细胞术分析，用于监测cd4和pd-1的细胞表面水平以及用于细胞活力的aqua染色和膜联蛋白v染色以鉴定经历凋亡的细胞。如图14所示，用不同抗体或adc处理的所有样品具有相同水平的aqua阳性(图14a)或膜联蛋白v阳性(图14b)或具有低至中等水平的pd-1的表达的cd4+t细胞。但是，在具有高水平pd-1的细胞群中，用抗pd-1adc处理的样品中膜联蛋白v和aqua阳性细胞的量显著增加(图14a和14b中的140g5-pnu和136b5-pnu)。为了提供抗pd-1adc的潜在治疗益处的进一步证据，用不同抗体或adc处理cd4+t细胞5天(同种型对照抗体、140g5mab、140g5-pnumab缀合物、136b5mab或136b5-pnumab缀合物)使用定量病毒过度生长试验评估hiv感染细胞的频率(frequency)。在该试验中，来自hiv感染的患者的抗体或adc处理的细胞未受刺激或用抗cd3/抗cd28抗体刺激，然后在同种异体cd8耗尽的pbmc存在下以不同稀释度培养。用来自每个样品的不同稀释度的cd4+t细胞进行测试允许在用抗体或adc处理5天后评估含有有复制能力的病毒的细胞的频率。在cd4+t细胞和同种异体cd8耗尽的pbmc培养14天后，在p24elisa中测试样品内hivrna的存在，以确定含有有复制能力的病毒的细胞的频率。根据图14中所示的pd-1高细胞的具体消耗，分别观察到膜联蛋白v或aqua阳性的pd-1高细胞百分比增加，表明经历细胞凋亡和细胞死亡的细胞的水平增加(图15a和15b)。在图16所示的病毒过度生长试验中，来自hiv感染供体的cd4+t细胞样品用igg1同位素(isotope)对照抗体、抗pd-1抗体(136b5或140g5)处理5天或未经处理，所有样品都具有相似频率的含有有复制能力的病毒的细胞(16至28个hiv-1rna阳性细胞每百万(rupm))。但是，在用抗pd-1adc(140g5-pnumab缀合物、136b5mab或136b5-pnumab缀合物)处理的样品中，感染细胞的频率显著降低，在可以产生感染性病毒的细胞中对应4-5倍的减少。这些结果已经在几个单独的实验中重现，与5天抗pd-1adc治疗相关的rupm高达10倍的降低。因此，这些研究为抗pd-1adc可以是hiv-1阳性患者感染细胞耗尽的有效疗法的概念提供了原理的体外证据。实施例7小鼠抗pd-1抗体的人源化将选择的抗pd-1克隆的小鼠igg1抗体序列与人免疫球蛋白种系v基因数据库进行比较，以找到与小鼠抗体最相似的重链和轻链框架。使用这些框架序列，设计组合文库并用于构建噬菌体展示文库，其包含待人源化的抗体的重链和轻链cdr环。然后将噬菌体文库用于针对fc融合构建体中的重组人pd-1的淘选实验。噬菌体elisa用于评估结合重组pd-1的人源化抗pd-1输出噬菌体。将来自阳性克隆的fab片段dna导入faseba(快速筛选表达，生物物理-性质和亲和力)文库，并用于产生fab蛋白片段。通过biacore研究确定，评估这些fab片段的表达水平、蛋白质稳定性/生物物理性质和对重组人fc-pd-1蛋白的亲和力。以这种方式将表3的137f2和135c12小鼠抗体克隆人源化，并且得到的具有所需表达、稳定性和亲和性的克隆的vh和vl序列如下所示。用于人和猴fc-pd-1蛋白的137f2和135c12人源化fab克隆的biacore亲和力测量分别显示在表12和13中。这些示例性人源化抗体的可变区氨基酸序列(如所示的重链和轻链)如下所示。a.人源化137f2重链序列1.小鼠vh参考序列2.a35790-vh3.a35796-vh4.a35793-vh5.a35818-vh6.a35795-vh7.a35797-vh8.a35799-vh9.a35805-vh10.137fvh111.137fvh212.137fvh1b13.137fvh1cb.人源化137f2轻链序列1.小鼠vl参考序列2.a35790-vl3.a35796-vl4.a35793-vl5.a35818-vl6.a35795-vl7.a35797-vl8.a35799-vl9.a35805-vl10.137fvl111.137fvl212.137fvl1b13.137fvl1c14.137fvl1dc.人源化135c12重链序列1.小鼠vh参考序列2.a35775-vh3.a35783-vh4.a35774-vh5.a36443-vh6.a35777-vh7.a35789-vh8.a36448-vh9.a36437-vh10.135cvh111.135cvh212.135cvh313.135cvh1b14.135cvh1c15.1135cvh1dd.人源化135c12轻链序列1.小鼠vl参考序列2.a35775-vl3.a35783-vl4.35774-vl5.a36443-vl6.a35777-vl6.a35789-vl8.a36448-vl9.a36437-vl10.135cvl111.135cvl212.135ccvl313.135cvl1b14.135cvl1c所示人源化抗体的biacore结合亲和力测量结果列于下表12和13中。表12与137f2相关的人源化抗pd-1fab克隆对人和猴pd-1的biacore结合亲和力测量表13与135c12相关的人源化抗pd-1fab克隆对人和猴pd-1的biacore结合亲和力测量实施例8使用抗pd1抗体及其组合刺激t细胞来自慢性感染的hiv供体的pbmc的抗原特异性刺激的结果导致hiv特异性cd8+t细胞的增殖，如图17-19所示。由于病毒血症供体中cd8+t细胞的耗尽状态，抗pd-1抗体的添加使抗原特异性增殖增强高达约200％(p值<0.0001)。在cfse功能耗竭试验中，评估编码源自小鼠阻断抗pd-1抗体137f2和小鼠非阻断性抗pd-1抗体135c12的cdr的人源化抗pd-1抗体对于其减轻抗原特异性cd8t细胞中功能耗竭的能力。在多个试验中测试了具有人抗体框架区变异的137f2和135c12克隆的几种人源化抗体，并且与mk3475及137f2和135c12的小鼠/人嵌合抗体(来自的小鼠的vl和vh的部分和igg4的人恒定区)相比，所有这些抗体都表现出促进cd8+t细胞增殖的类似活性。由于病毒血症供体中cd8t细胞的耗尽状态，抗pd-1抗体的添加使抗原特异性增殖增强高达约200％(p值<0.0001)(图17)。在cfse功能耗竭试验中，评估编码源自小鼠阻断抗pd-1抗体(即，阻断pd-1/pd-l1相互作用)137f2的cdr的人源化抗pd-1抗体(即，人源化抗体a35795(包括seqidno.143)和155)、a35796(包括seqidno.140和152)和a35797(包括seqidno.144和156)，和小鼠-人嵌合体137f2(包括seqidno.8、31、54、77、100和123))和源自小鼠非阻断性抗pd-1抗体135c12的cdr的人源化pd-1抗体(即，人源化抗体a35774(包括seqidno.166和180)、a35783(包括seqidno.165和179)、a35789(包括seqidno.169和183)、a36443(包括seqidno.167和181)、135ch2l2(包括seqidno.173和187)、135ch1cl1c(包括seqidno.176和190)、135ch1cl1b(包括seqidno.176和189)，和小鼠-人嵌合体135c12(包括seqidno.17、40、63、86、109和132))对于其减轻抗原特异性cd8+t细胞中功能耗竭的能力。在多个试验中测试了几种人抗体框架区中具有变异的137f2(阻断)和135c12(非阻断)克隆的人源化抗体。与mk3475及137f2和135c12的小鼠/人嵌合抗体相比，所有这些抗体都表现出促进cd8+t细胞增殖的类似活性。图18显示阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体(mk3475或a35795)与非阻断性抗pd-1抗体(a35774)的组合的结果导致相对于单独使用任一抗体在增殖方面统计学显著增加(p值<0.0001)。图18中显示的数据是mk3475与a35774组合的三个实验及a35795与a35774组合的四个实验的平均值。图19显示阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体(mk3475)和非阻断性抗pd-1抗体(135ch1cl1c(包括seqidno.176和190)或135ch1cl1b(包括seqidno.176和189)的其它组合的效果。如其中所示，阻断性抗体mk3475和非阻断性抗pd-1抗体(135ch1cl1c或135ch1cl1b)的组合相对于单独的任一抗体导致增殖的统计学显著增加(如所示p值为0.018或者<0.0001)。图19中显示的数据是每种组合的两次实验的平均值。实施例9用阻断和非阻断抗pd-1抗体的组合处理活化jurkatpd-1报告细胞在这些实验中，用瞬时转染的293t细胞系刺激jurkatpd-1nfat报告细胞系，所述293t细胞系共表达tcr活化剂和pd-l1蛋白。在不存在抗pd-1抗体的情况下，pd-l1/pd-1相互作用抑制jurkat细胞刺激，导致nfat活化减少和荧光素酶产生的水平降低。添加阻断性抗pd-1抗体(例如，mk3475)导致nfat活化增强、更多的荧光素酶产生和添加荧光素酶底物时产生的化学发光光量增加。在具有大量过量的pd-1和pd-l1的这些极端试验条件下，非阻断性抗pd-1抗体(由图20a中的a35774和图20b中的135ch1cl1c示例，相对于阻断性抗pd-1抗体具有降低的活性)。但是，阻断和非阻断性抗pd-1抗体的组合导致t细胞活化进一步增加至超过单独使用mk3475可达到的水平。在所测试的每种抗体的低浓度和高浓度下均观察到阻断和非阻断性抗pd-1抗体的这种增强的nfat活化。显示的数据是对于阻断性抗体mk3475+非阻断性a35774(图20a)或阻断性抗体mk3475+非阻断性抗体135h1cl1c(图20b)的组合显示的nfat活化的统计学显著增加的三次重复的平均值。实施例10用抗pd-1抗体处理使细胞表面pd-1内化将来自具有高基础水平pd-1的记忆t细胞的慢性感染的hiv供体的pbmc与阻断、非阻断，或阻断和非阻断性抗pd-1抗体的组合一起培养以确定对pd-1内化(internalization)的影响(图21)。通过流式细胞术在记忆cd4+t细胞(图21，图a、c和e)和cd8+t细胞(图21，图b、d和f)上监测pd-1的细胞表面水平，以确定抗pd-1抗体是否在48至72小时内诱导细胞表面pd-1内化。使用抗体组合a35795(包括seqidno.143和155)和a35774(包括seqidno.166和180)(图21，图a、b)；mk3475和a35774(包括seqidno.166和180)(图21，图c、d)；以及a35795(包括seqidno.143和155)和135ch1cl1c(包括seqidno.176和190)(图21，图e、f)，显示三次单独的实验。在所有情况下，观察到阻断(例如a35795或mk3475)和非阻断(例如a35774(包括seqidno.166和180)或135ch1cl1c(包括seqidno.176和190))抗pd-1抗体的组合诱导pd-1受体更快速和/或更显著的内化。在每次实验中，将pbmc与人igg4同位素对照抗体一起培养，该对照抗体作为未处理的t细胞的参照，该t细胞在整个细胞培养物培养中保持升高水平的pd-1。从机制上讲，pd-1的内化可以有助于抗pd-1抗体的拮抗功能活性(单独的或组合的阻断和非阻断性抗体)，因为pd-1的细胞表面表达降低可以通过pd-1/pd-l1相互作用限制t细胞的负调控。实施例11抗pd-1抗体处理后ifn-γ的产生将来自具有高基础水平pd-1的记忆t细胞的慢性感染的hiv供体的pbmc与阻断、非阻断，或阻断和非阻断性抗pd-1抗体的组合一起培养。然后将pbmc/抗体混合物铺置(layer)于293t细胞上，该293t细胞经瞬时转染以表达抗cd3tcr活化剂或共表达抗cd3tcr活化剂和pd-l1。在存在或不存在pd-l1的情况下用tcr活化细胞刺激pbmc24小时后，收集上清液并通过elisa分析ifn-γ产生。当用抗cd3tcr活化细胞刺激时，在所有抗体处理的样品中检测到相似水平的ifn-γ(图22a)。相反，在igg4同位素对照处理的样品中检测到较低水平的ifn-γ，并且在用抗pd-1抗体处理的样品中存在ifn-γ产生增强。在用阻断性(mk3475)和非阻断性(a35774)抗pd-1抗体处理的样品中观察到最高水平的细胞因子产生(*p<0.05)。在另一项实验中，将来自具有高基础水平的pd-1的记忆t细胞的慢性感染的hiv供体的pbmc与阻断、非阻断(a35774)、阻断(mk3475)，或阻断和非阻断性抗pd-1抗体的组合(a35774和mk3475(图22b))一起培养。然后将pbmc/抗体混合物铺置于293t细胞上，该293t细胞经瞬时转染以共表达抗cd3tcr活化剂和pd-l1蛋白。加入golgiplugtm蛋白质转运抑制剂，将细胞培养约18小时，以使细胞内的细胞因子积累。通过流式细胞术评估每种抗体处理条件的il-γ产生细胞的百分比(图22b)。抗-pd-1处理后pd-1阳性细胞中ifn-γ的产生增加，阻断(mk3475)和非阻断(a35774)抗体的组合导致细胞因子产生进一步增加(pd-1+cd8t细胞显示的数据)。实施例12结晶学将重组表达的纯化的人pd-1蛋白(受体胞外域的残基33至150(“hpd1”))与人源化a35774抗体的fab片段一起培养，并通过尺寸排阻色谱法纯化复合物。产生hpd-1/faba35774(包括seqidno.166和180)复合物的蛋白质晶体，并通过x射线晶体学解析结构。图23a中的共晶体结构显示与hpd-1相互作用的a35774的重链和轻链cdr环(包括seqidno.166和180，cdr由seqidno.17、40、63、86、109和132表示)。数据表明，用作a35774的pd-1上的结合表位的主要残基包括vhcdr环的f37、p39、a40、l41、v43、l138、r139和r143以及vlcdr环的p34、e136、s137和r139。这些结构研究与用小鼠135c12抗体进行的表位作图一致，该小鼠135c12抗体具有与实施例3和5中所述的a35774相同的重链和轻链cdr。在用编码氨基酸取代的pd-1进行的那些抗体结合实验中，在135c12抗体和pd-1突变体m4(包括取代s36a/p37a/l41a)、具有取代r139a/e141a的m26；具有取代l141a/v143l的pd-1突变体m31之间观察到结合的变化。导致135c12的结合亲和力小的改变的其它pd-1突变(m17、m18和m28中存在的那些)非常接近pd-1上的a35774fab的结合位点且这些氨基酸取代可以在pd-1中引入局部构象变化，该变化在这些测试中降低了抗体结合亲和力。共同结晶学、表位作图和竞争性抗体结合研究一起提供了结论性(conclusive)证据，即与p2块片区重叠的抗体结合可具有不同于通过pd-1/pd-l1阻断起作用的抗体的拮抗功能活性。图23b中提供了a35774所例示的抗体不阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用的另外证据，其中在我们的hpd-1/faba35774共晶体结构与具有pd-l1的pd-1的4zqk共晶体结构之间产生模型。该模型显示a35774fab和pd-l1蛋白与人pd-1的非重叠结合(图23b)。实施例13体内功效研究在pd-1hugemm小鼠中进行体内功效研究，以评估非阻断性抗pd-1抗体135ch1cl1c(包括seqidno.176和190))相比于keytruda(mk3475)的治疗潜力，每种抗体每两周10mg/kg单独给药(图24)。另外的治疗处理包括以每两周每种抗体5mg/kg共同给药135ch1cl1c和keytruda。对hugemm小鼠进行基因工程改造以表达嵌合的人/小鼠pd-1蛋白，其中大部分受体胞外域编码人pd-1蛋白(来自残基26至146的人pd-1序列)。在体内研究之前，流式细胞术测试证实135ch1cl1c和keytruda抗pd-1抗体特异性结合刺激的t细胞表面上的hugemm人/小鼠嵌合pd-1。在准备研究时，将来自结肠腺癌的mc38细胞皮下接种到许多pd-1hugemm小鼠中用于肿瘤生成。当肿瘤达到约95mm3±50的体积时，将总共40只小鼠随机分成4组，平均肿瘤大小为84mm3，并在研究第0天开始给药(媒介、135ch1cl1c、keytruda和135ch1cl1c+keytruda)。每两周施用治疗性抗pd-1抗体，每周两次测量肿瘤大小和小鼠体重。相对于未处理的pbs缓冲媒介对照小鼠监测肿瘤生长抑制，并将功效与keytruda的效力进行比较。非阻断性抗pd-1抗体135ch1cl1c在与keytruda相当的水平诱导肿瘤生长减少。135ch1cl1c和keytruda的共同施用还诱导肿瘤生长的减少，其至少与单独以10mg/kg施用的keytruda一样有效。但是，在研究期间的所有处理后时间点，用135ch1cl1c和keytruda的组合处理的小鼠相对于keytruda阳性对照呈现出改善的反应和更低的平均肿瘤体积的趋势。重要的是，135ch1cl1c和keytruda的组合在研究的第4天(p值为0.0676，接近统计极限)、第7天(p值为0.0266)、第11天(p值为0.0067)、第14天(p值为0.0037)和第17天(p值为0.0021)(使用配对wilcox检验进行统计分析)显示相对于媒介对照的肿瘤体积的统计学显著降低。相比之下，单独施用keytruda仅在第11天(p值为0.0205)、第14天(p值为0.0145)、第17天(p值为0.0145)显示相对于媒介对照的肿瘤体积的统计学显著降低。单独施用135ch1cl1c在研究的第11天(p值为0.0266)、第14天(p值为0.0062)和第17天(p值为0.0044)显示相对于媒介对照的肿瘤体积的统计学显著降低(图24a)。根据mc38肿瘤体积相对于媒介对照的平均抑制百分比数据的解释也显示135ch1cl1c和keytruda组合相对于keytruda或135ch1cl1c单独使用的强烈抗肿瘤活性趋势和改善的抗肿瘤活性(图24b)。该分析支持体外证据，即阻断(例如，keytruda或mk3475)和非阻断(135ch1cl1c)抗-pd-1的组合导致增强的t细胞功能活性(例如增殖(实施例2和8)和细胞因子产生(实施例11))。另一个观察结果是相对于单独的keytruda，135ch1cl1c和keytruda组合在早得多的时间点开始发挥抗肿瘤作用(例如，研究的第4或7天)，尽管事实上每一组研究给予等量的抗体总量(keytruda：10mg/kg以及135ch1cl1c和keytruda：每种5mg/kg)。最后，根据在抗体治疗期间经历m38肿瘤完全缓解的小鼠的百分比，解释体内肿瘤模型数据(图24c)。与135ch1cl1c和keytruda组合观察到的肿瘤抑制百分比一致，该研究的这一部分(135ch1cl1c和keytruda的组合)在植入肿瘤完全缓解的小鼠(135ch1cl1c和keytruda组合的四只小鼠与keytruda或135ch1cl1c的两只小鼠单个/单独给药)中表现出2倍的增加。总之，这种体内数据证实了与p2块片重叠的且非阻断pd-1/pd-l1相互作用的pd-1表位的结合活化了肿瘤特异性免疫应答，该应答不同于抗pd-1抗体且与抗pd-1抗体合作，所述抗pd-1抗体通过pd-1/pd-l1阻断起作用。尽管根据优选的实施方式已经描述了某些实施方式，但是应理解，本领域技术人员容易想到变型和改进。因此，期望所附的权利要求覆盖所有在所附权利要求范围内的这种等同变型。参考文献1.chuntwetal.nature387：183-188，19972.chuntwetal.procnatlacadsciusa94：13193-13197，19973.finzidetal.science278：1295-1300，19974.chomontnetal.natmed15：893-900，20095.silicianojdetal.natmed9：727-728，2036.perreaumetal.jexpmed210：143-156，20137.ronglandperelsonajtheoretbio/260：308-331，20098.sigalaetal.nature477：95-98，20119.katlamacetal.lancet381：2109-2117，201310.hansensgetal.nature503：100-106，201311.kleinfetal.nature492：518.522，201212.barouchdhetal.nature503：224-228，201313.trautmannletal.natmed12：1198-1202，200614.daycletal.nature443：350-354，200615.archinnmetal.nature487：482-485，201216.sieverselandsenterpdannurevmed.64：15-29，201317.zolotrsetal.natrevdrugdiscov4：259-260，2013当前第1页12当前第1页12