蛋白酶活化的T细胞双特异性分子的制作方法

本发明一般涉及新颖的蛋白酶可活化的抗原结合分子，其包含可逆掩蔽该分子的抗原结合的抗独特型结合模块。具体而言，本发明涉及具有掩蔽cd3结合模块直至受到蛋白酶切割的抗独特型结合模块的t细胞结合分子。这容许cd3结合模块不可及或受到“掩蔽”直至它靠近靶组织(诸如肿瘤，例如肿瘤浸润性t细胞)。另外，本发明涉及编码此类蛋白酶活化的t细胞结合分子和独特型特异性多肽的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的蛋白酶活化的t细胞结合分子的方法，以及例如在疾病的治疗中使用它们的方法。发明背景在多种临床背景中常常期望选择性破坏个别靶细胞或特定靶细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且不受损是癌症疗法的首要目的。实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞诸如天然杀伤(nk)细胞或细胞毒性t淋巴细胞(ctl)攻击并破坏肿瘤细胞。在此点上，最近数年对双特异性抗体变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合t细胞受体(tcr)复合物的活化性的，不变的组分。此类抗体对其两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和t细胞之间的暂时相互作用，引起任何细胞毒性t细胞活化和随后的靶细胞裂解。因此，免疫应答重定向于靶细胞，而且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或t细胞的特异性，其对于ctl的正常mhc限制性活化会是相关的。在此背景中，至关重要的是ctl仅在密切靠近靶细胞时活化，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激来引发靶细胞有效裂解的t细胞活化性双特异性分子。已开发出数种双特异性抗体型式并研究了它们对调查中的t细胞介导的免疫疗法的适宜性。这些包括bite(双特异性t细胞衔接物(engager))分子(nagorsenandexpcellres317,1255-1260(2011))，双抗体(holligeretal.,proteng9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双抗体(kipriyanovetal.,jmolbiol293,41-66(1999))，dart(双重亲和力重靶向)分子(mooreetal.,blood117,4542-51(2011))，和triomab(seimetzetal.,cancertreatrev36,458-467(2010))。生成对于治疗合适的双特异性分子的任务提供有待满足的涉及功效，毒性，适用性和生产能力的数项技术挑战。在双特异性分子靶向在非靶组织中也表达的靶细胞(例如癌细胞)上的抗原的情况中，可发生毒性。因此需要在靶细胞存在下解放完全t细胞活化但在正常细胞或组织存在下不然的有效t细胞活化性双特异性分子。发明概述本发明一般涉及在靶细胞存在下选择性活化的t细胞活化性双特异性分子。在一个方面，本发明涉及一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块；(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合模块；和(c)经由蛋白酶可切割接头共价附着至该t细胞双特异性结合分子的掩蔽模块，其中该掩蔽模块能够特异性结合该第一或该第二抗原结合模块的独特型，由此可逆隐蔽该第一或第二抗原结合模块。在一个实施方案中，该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块。在一个实施方案中，该掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块的重链可变区。在一个实施方案中，该掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块的轻链可变区。在一个实施方案中，该掩蔽模块是抗独特型scfv。在一个实施方案中，该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含可逆隐蔽该第二抗原结合模块的第二掩蔽模块。在一个实施方案中，能够切割该蛋白酶可切割接头的蛋白酶由该靶细胞表达。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的恒定区是交换的。在一个实施方案中，该第一抗原结合模块是常规fab分子。在一个实施方案中，该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块。在一个实施方案中，该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块是能够特异性结合靶细胞抗原的fab分子。在一个特定的实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。在一个特定的实施方案中，该第三抗原结合模块并不与该第二抗原结合模块相同。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1或her1。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1，her1或间皮素。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1，her1，her2或间皮素。在一个实施方案中，该第一和该第二抗原结合模块彼此融合，任选经由肽接头。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个特定的实施方案中，该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第二抗原结合模块的fab重链的n端。在一个特定的实施方案中，该第一抗原结合模块的fab轻链和该第二抗原结合模块的fab轻链彼此融合，任选经由肽接头。在一个实施方案中，该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子另外包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个实施方案中，该fc域是igg，具体是igg1或igg4，fc域。在一个实施方案中，该fc域是人fc域。在一个实施方案中，该fc域展现与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个实施方案中，该fc域包含降低对fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸替代。在一个特定的实施方案中，该一处或多处氨基酸替代在选自l234，l235，和p329(kabat编号方式)的组的一个或多个位置处。在一个特定的实施方案中，该fc域的每个亚基包含降低对活化性fc受体的结合和/或效应器功能的三处氨基酸替代，其中所述氨基酸替代是l234a，l235a和p329g。在一个特定的实施方案中，该fc受体是fcγ受体。在一个实施方案中，该效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。在一个实施方案中，该靶细胞是人细胞。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；和(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述各项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；和(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，该掩蔽模块包含包含下述各项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，该蛋白酶可切割接头包含至少一个蛋白酶识别序列。在一个实施方案中，该蛋白酶可切割接头包含一个蛋白酶识别序列。在一个实施方案中，该蛋白酶识别序列选自由下述各项组成的组：(a)rqarvvng(seqidno：36)；(b)vhmplgflgpgrsrgsfp(seqidno：37)；(c)rqarvvngxxxxxvplslysg(seqidno：38)；和(d)rqarvvngvplslysg(seqidno：39)(e)plglwsq(seqidno：40)，其中x是任何氨基酸。在一个实施方案中，该蛋白酶可切割接头包含一个蛋白酶识别序列。在一个实施方案中，该蛋白酶识别序列选自由下述各项组成的组：(a)rqarvvng(seqidno：36)；(b)vhmplgflgpgrsrgsfp(seqidno：37)；(c)rqarvvngxxxxxvplslysg(seqidno：38)；(d)rqarvvngvplslysg(seqidno：39)；(e)plglwsq(seqidno：40)；(f)vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)；(g)fvggtg(seqidno：98)；(h)kkaapvng(seqidno：99)；(i)pmakkvng(seqidno：100)；(j)qarakvng(seqidno：101)；(k)vhmplgflgp(seqidno：102)；(l)qarak(seqidno：103)；(m)vhmplgflgppmakk(seqidno：104)；(n)kkaap(seqidno：105)；和(o)pmakk(seqidno：106)，其中x是任何氨基酸。在一个实施方案中，能够切割该蛋白酶可切割接头的蛋白酶选自由金属蛋白酶，例如mmp(基质金属蛋白酶，matrixmetalloproteinase)1-28和adam(解联蛋白和金属蛋白酶，adisintegrinandmetalloproteinase)2，7-12，15，17-23，28-30和33，丝氨酸蛋白酶，例如尿激酶型纤溶酶原活化剂和matriptase，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶蛋白酶组成的组。在一个具体的实施方案中，该蛋白酶是mmp9或mmp2。在又一个具体的实施方案中，该蛋白酶是matriptase。在一个实施方案中，该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列rqarvvng(seqidno：36)。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含包含与选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46的重链互补决定区(cdr)和seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含包含seqidno：43的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含与选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和包含与选自由seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含与选自由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和包含与选自由seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含选自由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153组成的组的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156的组的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：157的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：158的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含seqidno：47的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含seqidno：157的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：158的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含包含与选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和包含与选自由seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含seqidno：113的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：114的氨基酸序列的轻链可变区。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含wo2006/082515中披露的任一抗体的至少一个重链互补决定区(cdr)，通过援引完整收入本文。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含包含与选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个重链互补决定区(cdr)和包含与选自由seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61组成的组的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：32的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链和包含与seqidno：33的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含包含seqidno：32的氨基酸序列的重链和包含seqidno：33的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，该第一抗原结合模块能够特异性结合cd3且包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，而且该第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her2，其中该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：160的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中该第三抗原结合模块包含包含与seqidno：159的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：2的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：4的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：32的氨基酸序列的至少一个重链；(b)包含seqidno：34的氨基酸序列的至少一个轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：72的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：85的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：73的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：74的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：77的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：82的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：78的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：81的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：76的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：77的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：78的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：79的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：132的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：136的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：81的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：133的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定的实施方案中，本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(a)包含seqidno：137的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：139的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：81的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：138的氨基酸序列的第二轻链。在一个方面，本发明涉及一种用于可逆隐蔽分子的抗cd3抗原结合位点的独特型特异性多肽。在一个实施方案中，该独特型特异性多肽是抗独特型scfv。在一个实施方案中，该独特型特异性多肽经由接头共价附着至该分子。在一个实施方案中，该接头是肽接头。在一个实施方案中，该接头是蛋白酶可切割接头。在一个实施方案中，该肽接头包含至少一个蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，该蛋白酶选自由金属蛋白酶，例如mmp(基质金属蛋白酶)1-28和adam(解联蛋白和金属蛋白酶)2，7-12，15，17-23，28-30和33，丝氨酸蛋白酶，例如尿激酶型纤溶酶原活化剂和matriptase，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶蛋白酶组成的组。在一个具体的实施方案中，该蛋白酶是mmp9或mmp2。在又一个具体的实施方案中，该蛋白酶是matriptase。在一个实施方案中，该独特型特异性多肽经由超过一个接头共价附着至该分子。在一个实施方案中，该独特型特异性多肽经由两个接头共价附着至该分子。在一个实施方案中，包含该抗cd3抗原结合位点的分子是t细胞活化性双特异性分子。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；和(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述各项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；和(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，该独特型特异性多肽包含包含下述各项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。依照本发明的另一个方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段。本发明还涵盖由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明进一步提供包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在另一个方面，提供一种生成本发明的蛋白酶活化的t细胞分子的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达所述蛋白酶活化的t细胞分子的条件下培养本发明的宿主细胞，并b)回收所述蛋白酶活化的t细胞分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的蛋白酶活化的t细胞分子。在另一个方面，提供一种生成本发明的独特型特异性多肽的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达所述独特型特异性多肽的条件下培养本发明的宿主细胞，并b)回收所述独特型特异性多肽。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的独特型特异性多肽。本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子和药学可接受载剂。本发明还涵盖使用本发明的蛋白酶活化的t细胞分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的蛋白酶活化的t细胞分子或药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供依照本发明的蛋白酶活化的t细胞分子或药物组合物，其用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个具体的实施方案中，疾病是癌症。还提供本发明的蛋白酶活化的t细胞分子在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物中的用途；以及一种治疗个体中的疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的依照本发明的蛋白酶活化的t细胞分子。在一个具体的实施方案中，疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选是哺乳动物，特别是人。本发明还提供一种用于诱导靶细胞(特别是肿瘤细胞)裂解的方法，其包括在t细胞(特别是细胞毒性t细胞)存在下使靶细胞与本发明的蛋白酶活化的t细胞分子接触。在另一个方面，本发明还提供一种组合物，其包含本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子和药学可接受载剂。在另一个方面，本发明还提供一种组合物，其包含本文中描述的独特型特异性多肽和药学可接受载剂。在另一个方面，本发明还提供本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或独特型特异性多肽，或本文中描述的组合物，其用作药物。在一个实施方案中，该药物用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展，治疗免疫相关疾病或延迟免疫相关疾病进展，和/或增强或刺激免疫应答或功能。在另一个方面，本发明还提供本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或独特型特异性多肽，其用于在有所需要的个体中治疗疾病。在一个实施方案中，该疾病是增殖性病症，特别是癌症。在另一个方面，本发明还提供一种在个体中治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的包含本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或组合物的组合物。在另一个方面，本发明还提供一种用于诱导靶细胞裂解的方法，其包含在t细胞存在下使靶细胞与本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或组合物接触。在一个实施方案中，用于诱导靶细胞裂解的方法是是体外方法。在一个实施方案中，该靶细胞是癌细胞。在一个实施方案中，该靶细胞表达能够活化该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的蛋白酶。在另一个方面，本发明还提供一种对抗cd3抗原结合分子的独特型特异性的抗独特型cd3抗体或其抗原结合片段，其中该抗独特型cd3抗体或其片段在结合至该抗cd3抗原结合分子时特异性阻断该抗cd3抗原结合分子对cd3的结合。在一个实施方案中，该抗独特型cd3抗体或其抗原结合片段与该抗cd3抗原结合分子经由包含蛋白酶识别位点的肽接头可逆联合。在一个实施方案中，该cd3是小鼠，猴或人cd3。在另一个方面，本发明提供一种降低t细胞活化性双特异性分子的体内毒性的方法，其包括用蛋白酶可切割接头将本文中描述的独特型特异性多肽附着至该t细胞活化性双特异性分子以形成蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子具有与该t细胞活化性双特异性分子相比降低的体内毒性。附图简述图1a-e描绘具有掩蔽模块的不同cd3结合物的示意图。图1a：7859抗idch2527scfv4.15.64mk062matriptase位点cd3fc。图1b：7860抗idch2527scfv4.32.63mk062matriptase位点cd3fc。图1c：7857抗idch2527scfv4.15.64不可切割接头cd3fc。图1d：id7858抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头cd3fc。图1e：7861单价cd3fc。图2显示汇总抗独特型掩蔽模块对cd3结合物(ch2527)的亲和力的表。图3a-d显示图1a和b中描绘的分子的毛细管电泳-sds分析。图3a-b，图1a中描绘的分子在非还原(图3a)和还原条件(图3b)下的毛细管电泳-sds分析。未经处理的(i)和经过处理的分子(iii)的比较显示抗idscfv在于37℃rhmatriptase/st14处理48小时之后的完全切割。一份样品(ii)未经处理但于37℃温育48小时。图3c-d，图1b中描绘的分子在非还原(图3c)和还原条件(图3d)下的毛细管电泳-sds分析。未经处理的(i)和经过处理的分子(iii)的比较显示抗idscfv在于37℃rhmatriptase/st14处理48小时之后的完全切割。一份样品(ii)未经处理但于37℃温育48小时。图4a-c显示cd3结合的抗独特型掩蔽的效果。图4a和b描绘用于显示抗独特型cd3scfv4.15.64(图4a)或抗独特型cd3scfv4.32.63(图4b)的掩蔽效果的jurkatnfat报告物测定法的结果。单价cd3igg在添加jurkatnfat(一种具有nfat启动子，表达人cd3ε的急性淋巴性白血病报告细胞系)之前经由抗人fc抗体(包被在测定板上)交联。jurkat-nfat报告物细胞系(promega)是一种具有nfat启动子，表达人cd3ε的人急性淋巴性白血病报告物细胞系。如果cd3结合物结合cd3ε的话，萤光素酶表达且这可以以添加one-glo底物(promega)后的发光来测量。图4c显示掩蔽的和未掩蔽的单价cd3结合物的cd3ε结合的ec50值的比较。图5a-h描绘具有掩蔽模块的不同t细胞双特异性分子的示意图。图5a：7344抗idch2527scfv4.15.64mk062matriptase位点cd316d5fc。图5b：7676抗idch2527scfv4.15.64不可切割接头cd316d5fc。图5c：7496抗idch2527scfv4.32.63mk062matriptase位点cd316d5fc。图5d：7611抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头cd316d5fc。图5e：具有共同轻链的6298ga916-d-16d5-02sfw(1).folr116d5经典2+1tcb。图5f：具有共同轻链的6100ga916-d-16d5sfw(3a).folr116d5倒转2+1tcb。图5g：id6182dp47gstcbsfchow(9a)。dp47倒转2+1tcb。图5h：7494抗idch2527fab4.15.64mk062matriptase位点cd316d5fc。图6显示用于转染的第一质粒比，其通过大小排阻层析(1(穴):1(节):3(clc))。图7显示用于转染的第二质粒比，其通过大小排阻层析(1(穴):2(节):3(clc))。图8显示图5a(id7344)中描绘的tcb分子的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝非还原的，道b＝还原的，道c＝蛋白质标准。图9显示图5b(id7676)中描绘的tcb分子的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝非还原的，道b＝还原的，道c＝蛋白质标准。图10显示图5c(id7496)中描绘的tcb分子的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝非还原的，道b＝还原的，道c＝蛋白质标准。图11显示图5d(id7611)中描绘的tcb分子的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝非还原的，道b＝还原的，道c＝蛋白质标准。图12a-d显示图5a和c中描绘的分子的毛细管电泳-sds分析。图12a和b显示图5a中描绘的分子(id7344)抗idch2527scfv4.15.64mk062cd316d6fc在非还原(图12a)和还原条件(图12b)下的毛细管电泳。未经处理的(i)和经过处理的分子(iii)的比较显示抗idscfv在于37℃rhmatriptase/st14处理48小时之后的完全切割。一份样品(ii)未经处理但于37℃温育48小时。使用预染色的蛋白质标志物(iv)mark12(invitrogen)来估算正确的分子量。图12c和d显示图5c中描绘的分子(id7496)抗idch2527scfv4.32.63mk062cd316d6fc在非还原(图12c)和还原条件(图12d)下的毛细管电泳。未经处理的(i)和经过处理的分子(iii)的比较显示抗idscfv在于37℃rhmatriptase/st14处理48小时之后的完全切割。一份样品(ii)未经处理但于37℃温育48小时。使用预染色的蛋白质标志物(iv)mark12(invitrogen)来估算正确的分子量。图13显示由qifikit(dako)进行的folr1表达水平量化。针对folr1的抗体：#ls-c125620-100(lifespanbiosciencesinc)；以20μg/ml使用；小鼠igg1同种型：#554121(bd)。图14a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图14a显示温育48小时之后由浓度为10nm的蛋白酶活化的tcb分子(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子用纯化的rhmatriptase/st14预处理)和人pbmc诱导的对skov3细胞的杀伤(e:t＝7:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图14b显示温育48小时之后在skov3细胞上由10nm的蛋白酶活化的tcb结合(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc的t细胞活化(e:t＝7:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图15a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图15a显示温育48小时之后由浓度为100nm的蛋白酶活化的tcb分子(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc诱导的对mkn-45细胞的杀伤(e:t＝7:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图15b显示温育48小时之后在mkn-45细胞上由100nm的蛋白酶活化的tcb结合(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc的t细胞活化(e:t＝7:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图16显示温育48小时之后由浓度为10nm的蛋白酶活化的tcb分子(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc诱导的对ht29细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。从左至右的柱为7344：抗idch2527scfv4.15.64mk062cd316d6fc；7344：抗idch2527scfv4.15.64mk062cd316d6fc经处理的；7676：抗idch2527scfv4.15.64不可切割cd316d6fc；7496抗idch2527scfv4.32.63mk062cd316d6fc；7496抗idch2527scfv4.32.63mk062cd316d6fc经处理的；7611：id抗ch2527scfv4.32.63不可切割接头cd316d6fc；6298ga916-d-16d5-02sfw(1)；6182dp47gstcbsfchow(9a)。图17显示温育48小时之后由浓度为10nm的蛋白酶活化的tcb分子(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(与用于图14a的pbmc来自不同供体)诱导的对skov3细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。从左至右的柱为7344：抗idch2527scfv4.15.64mk062cd316d6fc；7344：抗idch2527scfv4.15.64mk062cd316d6fc经处理的；7676：抗idch2527scfv4.15.64不可切割cd316d6fc；7496抗idch2527scfv4.32.63mk062cd316d6fc；7496抗idch2527scfv4.32.63mk062cd316d6fc经处理的；7611：id抗ch2527scfv4.32.63不可切割接头cd316d6fc；6298ga916-d-16d5-02sfw(1)；6182dp47gstcbsfchow(9a)。图18a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图18a显示温育48小时之后由蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对hela细胞的剂量依赖性杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图18b显示温育48小时之后在hela细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图19a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图19a显示温育48小时之后由蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对hela细胞的剂量依赖性杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图19b显示温育48小时之后在hela细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图20a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图20a显示温育48小时之后由蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对skov3细胞的剂量依赖性杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图20b显示温育48小时之后在skov3细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图21a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图21a显示温育48小时之后由蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对skov3细胞的剂量依赖性杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图21b显示温育48小时之后在skov3细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，经处理的分子)诱导的人pbmc的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图22a和b显示蛋白酶活化的tcb所致t细胞活化。图22a显示温育48小时之后在ht29细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc(与上文所述实验不同供体)的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图22b显示温育48小时之后在ht29细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)诱导的人pbmc(与图16不同供体)的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图23显示温育48小时之后在hrcepic细胞上由蛋白酶活化的tcb结合(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，经处理的分子)诱导的人pbmc(与上文所述实验不同供体)的剂量依赖性t细胞活化(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。t细胞活化标志物cd25(左边小图)和cd69(右边小图)。cd4+和cd8+t细胞如指示的。图24显示温育48小时之后由浓度为50nm的蛋白酶活化的tcb分子(具有不同抗独特型cd3掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc诱导的对ovcar3细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行10分钟(并非完全切割)。图25显示温育48小时之后由10nm蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.15.64掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对skov3细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc的三名不同供体)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图26显示温育48小时之后由10nm蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对skov3细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc的三名不同供体)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图27显示温育48小时之后由100pm蛋白酶活化的tcb分子(具有抗独特型cd34.32.63掩蔽物，可切割和不可切割接头的tcb，分子经过处理)和人pbmc(自血沉棕黄层分离)诱导的对hela细胞的杀伤(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc的三名不同供体)。rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理于37℃进行24小时。图28描绘抗idga201scfv基质金属蛋白酶位点ga201fc(ga201-抗ga201-scfv)的示意图。图29描绘抗her1抗体ga201的示意图。图30a和b显示图28中描绘的分子在非还原(图30a)和还原条件(图30b)下的毛细管电泳-sds分析。通过蛋白a和大小排阻层析将图28中描绘的分子纯化至均质并提交毛细管电泳-sds分析。图31显示ga201-抗ga201-scfv和ga201结合h322m细胞上表达的her1的facs分析，用于确认抗独特型ga201scfv的掩蔽效果。将ga201-抗ga201-scfv与基质金属蛋白酶mmp-2一起温育过夜并将对h322m细胞的结合与未切割的ga201-抗ga201-scfv，ga201和同种型igg1对照抗体比较。用f(ab’)2-山羊抗人iggfc二抗fitc缀合物检测对h322m细胞上的her1的结合并使用bdfacscantoii通过facs进行分析。使用中值荧光强度(mfi)进行分析。图32显示在mmp2切割之前和之后，掩蔽的和未掩蔽的ga201的her1结合的表面等离振子共振分析。图33a-j描绘具有掩蔽模块的不同t细胞双特异性分子的示意图。图33a：id8364。16d5tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63mmp9-mk062matriptase位点n端融合至cd3。图33b：id8363。16d5tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63组织蛋白酶s/b位点n端融合至cd3。图33c：id8365。16d5tcb，倒转型式，抗idch2527scfv4.32.63mk062matriptase位点n端融合至共同轻链。图33d：id8366。16d5tcb，倒转型式，抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头n端融合至共同轻链。图33e：id8672。抗间皮素rg7787带电荷残基tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63mmp9-mk062matriptase位点n端融合至cd3xfab。图33f：id8673。抗间皮素rg7787带电荷残基tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头n端融合至cd3xfab。图33g：id8674。抗间皮素rg7787带电荷残基tcb，倒转型式，抗idch2527scfv4.32.63mmp9-mk062matriptase位点n端融合至cd3xfab。图33h：8675。抗间皮素rg7787带电荷残基tcb，倒转型式，抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头n端融合至cd3xfab。图33i：id8505。抗间皮素rg7787带电荷残基cd3xfabtcb，倒转型式。图33j：id8676。cd3xfab抗间皮素rg7787带电荷残基tcb，经典型式。图34描绘tcbid8365和tcbid8366的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝蛋白质标准，道b＝于4℃保存的蛋白质，道c＝用rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理的蛋白质，道d＝于37℃温育72小时的蛋白质和道e＝分子3。图35a和b描绘图33a中描绘的tcb(id8364)和图33b中描绘的tcb(id8363)的ce-sds分析。图35a：tcb8364的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝蛋白质标准，道b＝于4℃保存的蛋白质，道c＝用rhmatriptase/st14(r&dsystems)预处理的蛋白质，道d＝于37℃温育72小时的蛋白质和道e＝不可切割接头构建物。图35b：tcb8363的ce-sds分析(最终的经过纯化的制备物)：道a＝蛋白质标准，道b＝于4℃保存的蛋白质，道c＝用重组人组织蛋白酶b(r&dsystems)预处理的蛋白质，道d＝用重组人组织蛋白酶s(r&dsystems)预处理的蛋白质，道e＝于37℃温育72小时的蛋白质和道f＝不可切割接头构建物。图36a和b描绘使用hela和skov-3细胞作为靶细胞的jurkatnfat活化测定法。每个点代表一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。jurkat-nfat报告物细胞系(promega)是一种具有nfat启动子，表达人cd3ε的人急性淋巴性白血病报告物细胞系。如果tcb的cd3结合物结合肿瘤靶且cd3(交联是必须的)结合cd3ε的话，萤光素酶表达可以以添加one-glo底物(promega)后的发光来测量。比较folr1tcb(黑色朝下三角形)和经过预处理的具有n端融合的抗idcd34.32.63scfv和mmp9-matriptasemk062位点的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色实心正方形)。将分子用rhmatriptase/st14(r&dsystems)于37℃处理约20小时。还显示掩蔽的tcb(含有gs不可切割接头，灰色朝上三角形)和非靶向性tcb对照(空心朝下三角形)。点线显示在没有任何tcb的情况下靶细胞和效应细胞的发光。图36a显示使用hela细胞作为靶细胞的jurkatnfat活化测定法。图36b显示使用skov-3细胞作为靶细胞的jurkatnfat活化测定法。图37a-d描绘由folr1tcb和人pbmc介导的肿瘤细胞细胞毒性(效应:靶＝10:1)。每个点代表一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。图37a：hela靶细胞细胞毒性。均含有用mk062matriptase接头连接的抗独特型cd3scfv的两种不同型式的蛋白酶活化的tcb的比较。图37b：skov-3靶细胞细胞毒性。均含有用mk062matriptase接头连接的抗独特型cd3scfv的两种不同型式的蛋白酶活化的tcb的比较。图37c：hela靶细胞细胞毒性。含有抗独特型cd3scfv和具有不同蛋白酶位点的gs接头的经典蛋白酶活化的tcb的比较。含有mmp9-matriptasemk062接头的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色正方形)，folr1tcb(浅灰色朝下三角形)，仅仅含有matriptasemk062(浅灰色菱形)/组织蛋白酶位点(灰色圆圈)或不可切割接头(黑色朝下三角形)的蛋白酶活化的tcb。图37d：skov-3靶细胞细胞毒性。含有抗独特型cd3scfv和具有不同蛋白酶位点的gs接头的经典蛋白酶活化的tcb的比较。含有mmp9-matriptasemk062接头的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色正方形)，folr1tcb(浅灰色朝下三角形)，仅仅含有matriptasemk062(浅灰色菱形)/组织蛋白酶位点(灰色圆圈)或不可切割接头(黑色朝下三角形)的蛋白酶活化的tcb。图38a和b描绘原代人肾上皮皮质细胞(图38a)或人支气管上皮细胞(图38b)与200nm不同tcb和三名不同供体的人pbmc共温育后cd8阳性细胞的cd69的量化。温育48小时后对t细胞进行染色。(e:t＝10:1，效应细胞是人pbmc)。关于cd8+t细胞显示t细胞活化标志物cd69的中值荧光强度。每个点代表三名不同人pbmc供体的一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。使用不配对t检验进行统计分析。图39a和b描绘由mslntcb和人pbmc(效应:靶＝10:1)介导的肿瘤细胞细胞毒性。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。每个点代表一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。图39a：比较ncih596靶细胞细胞毒性。含有用mmp9-mk062matriptase接头连接的抗独特型cd3scfv的蛋白酶活化的mslntcb。蛋白酶活化的tcb(8672，浅灰色圆圈)，mslntcb(深灰色朝下三角形)和含有不可切割接头的蛋白酶活化的tcb(8673，灰色朝上三角形)。图39b：比较aspc-1靶细胞细胞毒性。含有用mmp9-mk062matriptase接头连接的抗独特型cd3scfv的蛋白酶活化的mslntcb。蛋白酶活化的tcb(8672，浅灰色圆圈)，mslntcb(深灰色朝下三角形)和含有不可切割接头的蛋白酶活化的tcb(8673，灰色朝上三角形)。图40描绘用原代肿瘤样品和蛋白酶活化的folr1tcb的jurkat-nfat活化测定法。jurkatnfat报告物细胞在与folr1tcb(6298)和含有mmp9-matriptase切割位点的蛋白酶活化的folr1tcb(8364)共温育后活化。蛋白酶活化的folr1tcb(8363，8408)和对照tcb(8409，7235)并不诱导萤光素酶表达。点线指示与肿瘤共温育的jurkatnfat细胞的基线发光。图41a-c：在人血清中温育后蛋白酶活化的tcb的毛细管电泳。将分子在增湿温箱中(5％co2)于37℃在人igg消减的血清中温育0或14天。所有分子通过亲和层析(蛋白a)进行纯化，然后通过毛细管电泳进行分析。图41a：血清，第0天和第14天时血清中的folr1tcb(6298)的ce-sds分析。图41b：血清，第0天和第14天时血清中的具有mmp9-matriptase接头的蛋白酶活化的folr1tcb(8364)的ce-sds分析。图41c：血清，第0天和第14天时血清中的具有matriptase接头的蛋白酶活化的folr1tcb(8408)和血清中预切割的分子的ce-sds分析。图42a-f描绘具有掩蔽模块的不同t细胞双特异性分子的示意图。图42a：id8955，herceptargtcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63mk062mmp9接头n端融合至vh。图42b：id8957，herceptargtcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头n端融合至vh。图42c：id8959，herceptargtcb，经典型式。图42d：id8997，folr136f2tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63mk062mmp9接头n端融合至vh。图42e：id8998，folr136f2tcb，经典型式，抗idch2527scfv4.32.63不可切割接头n端融合至vh。图42f：id8996，folr136f2tcb，经典型式。图43描绘由人pbmc和100nm或10nmtcb介导的人支气管上皮细胞毒性。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。每个点代表一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。图44描绘由100nmfolr1tcb和人pbmc介导的folr1阴性靶细胞(mkn-45)细胞毒性。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。每个点代表一式三份的均值。标准偏差通过误差棒来指示。发明详述定义除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。如本文中使用的，术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(cdr)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，fab分子通常具有单个抗原结合位点。如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如t细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种：α，δ，ε，γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种：κ和λ。如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上，病毒感染的细胞的表面上，其它患病细胞的表面上，免疫细胞的表面上，游离在血液血清中和/或在胞外基质(ecm)中找到。除非另外指示，本文中称为抗原的蛋白质(例如folr1，her1，her2，cd3，间皮素)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”，未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人蛋白包括但不限于：folr1，her2，和cd3，特别是cd3的ε亚基(对于人序列，参见uniprotno.p07766(版本130)，ncbirefseqno.np_000724.1，seqidno:54；或对于猕猴[食蟹猴(macacafascicularis)]序列，参见uniprotno.q95li5(版本49)，ncbigenbankno.bab71849.1)。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合在来自不同物种的cd3或靶抗原间保守的cd3或靶细胞抗原的表位。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合cd3和folr1，但是不结合folr2或folr3。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合cd3和her1。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合cd3和间皮素。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合cd3和her2。“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在biacore仪上分析)(liljeblad等,glycoj17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10％，如例如通过spr测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以以解离常数(kd)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为k解离和k结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(spr)。“降低的结合”，例如降低的对fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过spr测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。如本文中使用的，“t细胞活化”指t淋巴细胞，特别是细胞毒性t淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子能够诱导t细胞活化。合适的测量t细胞活化的测定法是本文中所述
技术领域：
中已知的。如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。如本文中使用的，术语“第一”和“第二”就抗原结合模块等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的特定次序或取向。“fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“fab重链”)的vh和ch1域以及轻链(“fab轻链”)的vl和cl域组成的蛋白质。“融合”意指组分(例如fab分子和fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合模块之一是单链fab分子，即其中通过肽接头连接fab轻链和fab重链以形成单一肽链的fab分子。在一个具体的此类实施方案中，在单链fab分子中fab轻链的c端连接于fab重链的n端。“交换”fab分子(亦称为“crossfab”)意指其中交换fab重链和轻链的可变区或恒定区的fab分子，即交换fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚，在其中交换fab轻链和fab重链的可变区的交换fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换fab分子的“重链”。相反，在其中交换fab轻链和fab重链的恒定区的交换fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交换fab分子的“重链”。与之相反，“常规”fab分子意指处于它的天然型式的fab分子，即包含由重链可变和恒定区构成的重链(vh-ch1)，和由轻链可变和恒定区构成的轻链(vl-cl)。术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，igg类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从n端至c端，每条重链具有可变区(vh)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(ch1，ch2和ch3)，也称为重链恒定区。类似地，从n端至c端，每条轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(cl)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(iga)，δ(igd)，ε(ige)，γ(igg)或μ(igm)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(igg1)，γ2(igg2)，γ3(igg3)，γ4(igg4)，α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个fab分子和fc域组成。术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于fv，fab，fab’，fab’-sh，f(ab’)2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scfv)，和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见hudson等,natmed9,129-134(2003)。对于scfv片段的综述，参见例如plückthun,于thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburg和moore编,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；亦参见wo93/16185；和美国专利no.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的论述，参见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等,natmed9,129-134(2003)；和hollinger等,procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于hudson等,natmed9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为vh和vl)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(fr)和3个高变区(hvr)。参见例如kindt等,kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,第91页(2007)。单个vh或vl域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的，术语“高变区”或“hvr”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个hvr；三个在vh中(h1，h2，h3)，三个在vl中(l1，l2，l3)。hvr一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(cdr)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了vh中cdr1外，cdr一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(hvr)也称为“互补性决定区”(cdr)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由kabat等,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(1983)及由chothia等,jmolbiol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的cdr意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的cdr的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定cdr的确切残基数将随着cdr的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定cdr。表1：cdr定义1cdrkabatchothiaabm2vhcdr131-3526-3226-35vhcdr250-6552-5850-58vhcdr395-10295-10295-102vlcdr124-3426-3224-34vlcdr250-5650-5250-56vlcdr389-9791-9689-971表1中所有cdr定义的编号方式依照由kabat等提出的编号惯例(见下文)。2如表1中使用的具有小写字母“b”的“abm”指由oxfordmolecular的“abm”抗体建模软件定义的cdr。kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“kabat编号”系统归入任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“kabat编号方式”指由kabat等,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照kabat编号系统。序列表的多肽序列并不依照kabat编号系统编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成kabat编号方式。“框架”或“fr”指除高变区(hvr)残基外的可变域残基。可变域的fr一般由4个fr域组成：fr1，fr2，fr3和fr4。因而，hvr和fr序列一般以下列顺序出现在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：iga，igd，ige，igg和igm，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α，δ，ε，γ和μ。本文中术语“fc域”或“fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。虽然igg重链的fc区的边界可以略微变化，但是人igg重链fc区通常定义为自cys226或pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在fc区的c端赖氨酸(lys447)。除非本文中另外指定，fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照eu编号系统，也称为eu索引，如记载于kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991的。如本文中使用的，fc域的“亚基”指形成二聚体fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的c端恒定区的多肽。例如，iggfc域的亚基包含iggch2和iggch3恒定域。“促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个fc域亚基(即fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，(异)二聚化在包含第一fc域亚基的多肽和包含第二fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。术语“效应器功能”指那些可归于抗体fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)，fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如b细胞受体)下调和b细胞活化。如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代，缺失，插入和修饰。可以进行取代，缺失，插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，pcr，基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329g，g329，g329，p329g或pro329gly。如本文中使用的，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。如此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白质”，“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰化，通过已知的保护性/封闭性基团衍生化，蛋白水解切割，或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成，但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成，包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个以上，5个以上，10个以上，20个以上，25个以上，50个以上，75个以上，100个以上，200个以上，500个以上，1,000个以上，或2,000个以上的氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。“分离的”多肽或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明目的而言，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分开，分级，或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如blast，blast-2，align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序align-2来生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(u.s.copyrightoffice)，washingtond.c.，20559，其在美国版权注册no.txu510087下注册。align-2程序可从genentech，inc.，southsanfrancisco，california公开获得，或可从源代码汇编。align-2程序应当汇编用于unix操作系统，包括数字unixv4.0d。所有序列比较参数均由align-2程序设定且不改变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列a对/与/相对给定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列b具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算：分数x/y的100倍其中x是由序列比对程序align-2在所述程序对a和b的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中y是b中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度时，a对b的％氨基酸序列同一性将不等于b对a的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用align-2计算机程序获得。术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)，病毒衍生的rna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，如在肽核酸(pna)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段，例如dna或rna片段。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子，dna或rna。例如，就本发明目的而言，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录本，以及正链和负链形式，和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸，或者可以将占参照序列中总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸插入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别分散在参照序列中的残基间或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如align-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。术语“表达盒”指重组或合成生成的，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒，染色体，线粒体dna，质体dna，病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及其指导表达的dna分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mrna。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如cho细胞，bhk细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，yo骨髓瘤细胞，p3x63小鼠骨髓瘤细胞，per细胞，per.c6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。“激活fc受体”是一种在抗体的fc域衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的fc受体。人激活fc受体包括fcγriiia(cd16a)，fcγri(cd64)，fcγriia(cd32)和fcαri(cd89)。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含fc区的抗体或其衍生物一般经由fc区的n端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的，术语“降低的adcc”定义为通过上文定义的adcc机制，以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低，和/或通过adcc机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。adcc的降低相对于使用相同的标准生产，纯化，配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)，由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的adcc。例如，由在其fc域包含降低adcc的氨基酸替代的抗体所介导的adcc中的降低，是相对于由在fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的adcc而言。测量adcc的合适测定法是本领域中公知的(参见例如pct公开文本no.wo2006/082515或pct公开文本no.wo2012/130831)。药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除，降低，延迟，最小化或预防疾病的不良作用。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬和马)，灵长类(例如人和非人灵长类如猴)，家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，降低疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展率，改善或减轻疾病状态，及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症，使用，剂量，施用，组合疗法，禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的，“独特型特异性多肽”指识别抗原结合模块(例如对cd3特异性的抗原结合模块)的独特型的多肽。独特型特异性多肽能够特异性结合抗原结合模块的可变区并由此降低或阻止抗原结合模块特异性结合它的关联抗原。当与包含抗原结合模块的分子的联合时，独特型特异性多肽能作为该分子的掩蔽模块发挥功能。本文中具体公开的是对抗cd3结合分子的独特型特异性的抗独特型抗体或抗独特型结合性抗体片段。如本文中使用的，“蛋白酶”或“蛋白水解酶”指在识别位点处切割接头且由靶细胞表达的任何蛋白水解酶。此类蛋白酶可以由靶细胞分泌或保持与靶细胞联合，例如在靶细胞表面上。蛋白酶的例子包括但不限于金属蛋白酶，例如mmp(基质金属蛋白酶)1-28和adam(解联蛋白和金属蛋白酶)2，7-12，15，17-23，28-30和33，丝氨酸蛋白酶，例如尿激酶型纤溶酶原活化剂和matriptase，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶家族的成员。如本文中就t细胞活化性双特异性分子而言使用的，“蛋白酶可活化的”指因降低或消除t细胞活化性双特异性分子结合cd3的能力的掩蔽模块而活化t细胞的能力降低的或消除的t细胞活化性双特异性分子。在掩蔽模块通过蛋白水解切割(例如连接掩蔽模块与t细胞活化性双特异性分子的接头的蛋白水解切割)解离后，对cd3的结合恢复且t细胞活化性双特异性分子由此活化。如本文中使用的，“可逆隐蔽”指掩蔽模块或独特型特异性多肽对抗原结合模块或分子的结合，诸如为了阻止抗原结合模块或分子结合它的抗原(例如cd3)。这种隐蔽是可逆的，在于独特型特异性多肽能自抗原结合模块或分子释放，例如通过蛋白酶切割，并由此释放抗原结合模块或分子去结合它的抗原。详细描述在一个方面，本发明涉及一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块；(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合模块；和(c)经由蛋白酶可切割接头共价附着至t细胞双特异性结合分子的掩蔽模块，其中掩蔽模块能够特异性结合第一或第二抗原结合模块的独特型，由此可逆隐蔽第一或第二抗原结合模块。能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块包含独特型。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的掩蔽模块共价附着至第一抗原结合模块。在一个实施方案中，掩蔽模块共价附着至第一抗原结合模块的重链可变区。在一个实施方案中，掩蔽模块共价附着至第一抗原结合模块的轻链可变区。此共价键与掩蔽模块对独特型第一抗原结合位点的特异性结合(其优选是非共价的)是分开的。第一抗原结合模块的独特型包含它的可变区。在一个实施方案中，当第一抗原结合模块结合至cd3时掩蔽模块结合至与cd3接触的氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，掩蔽模块不是第一抗原结合模块的关联抗原或其片段，即掩蔽模块不是cd3或其片段。在一个实施方案中，掩蔽模块是抗独特型抗体或其片段。在一个实施方案中，掩蔽模块是抗独特型scfv。实施例中详细描述了作为抗独特型scfv的掩蔽模块和包含此类掩蔽模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性分子的例示性实施方案。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含可逆隐蔽第二抗原结合模块的第二掩蔽模块。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合靶细胞抗原的fab分子。在一个实施方案中，第一抗原结合模块包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第一抗原结合模块包含包含seqidno：43的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含选自由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156的组的至少一个轻链cdr。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含与seqidno：157的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：158的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含包含与seqidno：32的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链，和包含与seqidno：33的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含包含与seqidno：115的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：116的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在另一个具体的实施方案中，第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合folr1的fab分子，包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合folr1的fab分子，包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合folr1的fab分子，包含选自组成由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合folr1的fab分子，包含包含与seqidno：157的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：158的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合her1的fab分子，包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合her1的fab分子，包含包含与seqidno：115的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：116的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合间皮素的fab分子，包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，(ii)第二抗原结合模块，它是能够特异性结合间皮素的fab分子，包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第二抗原结合模块是常规fab分子。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的恒定区是交换的，且第二抗原结合模块是常规fab分子。在又一个特定的实施方案中，第一和第二抗原结合模块彼此融合，任选经由肽接头。在特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中存在不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块(即，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子提供对cd3的单价结合)。蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子型式蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的各组分可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1a-e和5a-h。别的例示性构造描绘于图33a-k。在特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一些实施方案中，第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。在一个此类实施方案中，第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至第二抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至第二抗原结合模块的fab重链的n端，且第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。任选地，第一抗原结合模块的fab轻链和第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。在另一个此类实施方案中，第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。在一个具体的此类实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中第一和第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至fc域的亚基之一的n端。在其它实施方案中，第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。在一个特定的此类实施方案中，第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至第一抗原结合模块的fab重链的n端，且第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。任选地，第一抗原结合模块的fab轻链和第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至fc域或彼此融合，肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(g4s)n，(sg4)n，(g4s)n或g4(sg4)n肽接头。“n”一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。一种特别适合于将第一和第二抗原结合模块的fab轻链彼此融合的肽接头是(g4s)2。一种适合于连接第一和第二抗原结合模块的fab重链的例示性肽接头是epksc(d)-(g4s)2(seqidno105和106)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，当抗原结合模块融合至fc域亚基的n端时，其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。具有单个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子是有用的，特别是在高亲和力抗原结合模块结合后预期靶细胞抗原内在化的情况中。在此类情况中，存在超过一个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块可能增强靶细胞抗原的内在化，由此降低其利用度。然而，在许多其它情况中，会有利的是具有包含两个或更多个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(见显示于图5a-h的例子)，从而例如优化对靶部位的靶向或允许靶细胞抗原的交联。因而，在某些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子还包含第三抗原结合模块，其为能够特异性结合靶细胞抗原的fab分子。在一个实施方案中，第三抗原结合模块是常规fab分子。在一个实施方案中，第三抗原结合模块能够与第二抗原结合模块特异性结合相同的靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，而第二和第三抗原结合模块能够特异性结合靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中，第二和第三抗原结合模块相同(即，它们包含相同氨基酸序列)。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合folr1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合folr1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合folr1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合folr1，其中第二和第三抗原结合模块包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含包含与seqidno：115的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：116的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her2，其中第二抗原结合模块包含选自由seqidno：142，seqidno：143和seqidno：144组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr，且其中第三抗原结合模块包含选自由seqidno：145，seqidno：146和seqidno：147组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her2，其中第二抗原结合模块包含选自由seqidno：142，seqidno：143和seqidno：144组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr，且其中第三抗原结合模块包含选自由seqidno：145，seqidno：146和seqidno：147组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her2，其中第二抗原结合模块包含包含与seqidno：160的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第三抗原结合模块包含包含与seqidno：159的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合间皮素，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合间皮素，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合间皮素，其中第二和第三抗原结合模块包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自由seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61组成的组的至少一个轻链cdr。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3，且包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自由seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19组成的组的至少一个轻链cdr；且第二和第三抗原结合模块能够特异性结合her1，其中第二和第三抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自由seqidno：59，seqidno：60和seqidno：61组成的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一或第二亚基的n端。在一个更加具体的实施方案中，第二和第三抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至fc域的亚基之一的n端，且第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至第二抗原结合模块的fab重链的n端。任选地，第一抗原结合模块的fab轻链和第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。第二和第三抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至fc域。在一个特定的实施方案中，第二和第三抗原结合模块各自经由免疫球蛋白铰链区融合至fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人igg1铰链区。在一个实施方案中，第二和第三抗原结合模块和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定的实施方案中，免疫球蛋白分子是igg类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白是igg1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是igg4亚类免疫球蛋白。在又一个特定的实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子基本上由以下组成：能够特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子，和能够特异性结合cd3的抗原结合模块，其中抗原结合模块是(任选地经由肽接头)融合至免疫球蛋白重链之一的n端的fab分子，特别是交换fab分子。在一个特定的实施方案中，第一和第三抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至fc域的亚基之一的n端，且第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子基本上由第一，第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至第一抗原结合模块的fab重链的n端，且第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一亚基的n端，且其中第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第二亚基的n端。任选地，第一抗原结合模块的fab轻链和第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含seqidno：44的重链互补决定区(cdr)1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合folr1的fab分子，包含seqidno：14的重链cdr1，seqidno：15的重链cdr2，seqidno：16的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合folr1的fab分子，包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含seqidno：44的重链互补决定区(cdr)1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合folr1的fab分子，其包含seqidno：151的重链cdr1，seqidno：152的重链cdr2，seqidno：153的重链cdr3，seqidno：154的轻链cdr1，seqidno：155的轻链cdr2和seqidno：156的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合folr1的fab分子，包含包含与seqidno：157的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：158的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含seqidno：44的重链互补决定区(cdr)1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合her1的fab分子，包含seqidno：56的重链cdr1，seqidno：57的重链cdr2，seqidno：58的重链cdr3，seqidno：59的轻链cdr1，seqidno：60的轻链cdr2和seqidno：61的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合her1的fab分子，包含包含与seqidno：115的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：116的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含seqidno：44的重链互补决定区(cdr)1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合her2的fab分子，其中第二抗原结合模块包含seqidno：142的重链cdr1，seqidno：143的重链cdr2，seqidno：144的重链cdr3，seqidno：148的轻链cdr1，seqidno：149的轻链cdr2和seqidno：150的轻链cdr3，且其中第三抗原结合模块包含seqidno：145的重链cdr1，seqidno：146的重链cdr2，seqidno：148的重链cdr3，seqidno：148的轻链cdr1，seqidno：149的轻链cdr2和seqidno：150的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合her2的fab分子，其中第二抗原结合模块包含包含与seqidno：160的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，且其中第三抗原结合模块包含包含与seqidno：159的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：161的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含seqidno：44的重链互补决定区(cdr)1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2和seqidno：19的轻链cdr3，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合间皮素的fab分子，包含seqidno：107的重链cdr1，seqidno：108的重链cdr2，seqidno：109的重链cdr3，seqidno：110的轻链cdr1，seqidno：111的轻链cdr2和seqidno：112的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合模块，它是能够特异性结合cd3的fab分子，包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区，其中第一抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，它们各自是能够特异性结合间皮素的fab分子，包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。依照十个上述实施方案任一的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以进一步包含(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，其中第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至第一抗原结合模块的fab重链的n端，且第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第一亚基的n端，且其中第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至fc域的第二亚基的n端。在本发明的一些蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中，第一抗原结合模块的fab轻链和第二抗原结合模块的fab轻链彼此融合，任选经由接头肽。取决于第一和第二抗原结合模块的构造，第一抗原结合模块的fab轻链可以在它的c端融合至第二抗原结合模块的fab轻链的n端，或第二抗原结合模块的fab轻链可以在它的c端融合至第一抗原结合模块的fab轻链的n端。第一和第二抗原结合模块的fab轻链的融合进一步降低不匹配的fab重和轻链的错配，并且还降低表达本发明的一些蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子需要的质粒数。在某些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第一抗原结合模块的fab轻链可变区与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vl(1)-ch1(1)-ch2-ch3(-ch4))，和其中第二抗原结合模块的fab重链与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(2)-ch1(2)-ch2-ch3(-ch4))。在一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含其中第一抗原结合模块的fab重链可变区与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(vh(1)-cl(1))和第二抗原结合模块的fab轻链多肽(vl(2)-cl(2))。在某些实施方案中，多肽共价连接，例如通过二硫键。在备选的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第一抗原结合模块的fab重链可变区与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(1)-cl(1)-ch2-ch3(-ch4))，和其中第二抗原结合模块的fab重链与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(2)-ch1(2)-ch2-ch3(-ch4))。在一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含其中第一抗原结合模块的fab轻链可变区与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(vl(1)-ch1(1))和第二抗原结合模块的fab轻链多肽(vl(2)-cl(2))。在某些实施方案中，多肽共价连接，例如通过二硫键。在一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第一抗原结合模块的fab轻链可变区与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，后者继而与第二抗原结合模块的fab重链共享羧基末端肽键，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vl(1)-ch1(1)-vh(2)-ch1(2)-ch2-ch3(-ch4))。在其它实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第一抗原结合模块的fab重链可变区与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)，后者继而与第二抗原结合模块的fab重链共享羧基末端肽键，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(1)-cl(1)-vh(2)-ch1(2)-ch2-ch3(-ch4))。在仍有其它实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第二抗原结合模块的fab重链与第一抗原结合模块的fab轻链可变区共享羧基末端肽键，后者继而与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(2)-ch1(2)-vl(1)-ch1(1)-ch2-ch3(-ch4))。在其它实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含其中第二抗原结合模块的fab重链与第一抗原结合模块的fab重链可变区共享羧基末端肽键，后者继而与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一抗原结合模块包含交换fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)，后者继而与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(2)-ch1(2)-vh(1)-cl(1)-ch2-ch3(-ch4))。在这些中的一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含其中第一抗原结合模块的fab重链可变区与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的第一抗原结合模块的交换fab轻链多肽(vh(1)-cl(1))，和第二抗原结合模块的fab轻链多肽(vl(2)-cl(2))。在这些中的其它实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含其中第一抗原结合模块的fab轻链可变区与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键的交换fab轻链多肽(vl(1)-ch1(1))，和第二抗原结合模块的fab轻链多肽(vl(2)-cl(2))。在这些中的仍有其它实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含其中第一抗原结合模块的fab轻链可变区与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键，后者继而与第二抗原结合模块的fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(vl(1)-ch1(1)-vl(2)-cl(2))，其中第一抗原结合模块的fab重链可变区与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，后者继而与第二抗原结合模块的fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(vh(1)-cl(1)-vl(2)-cl(2))，其中第二抗原结合模块的fab轻链多肽与第一抗原结合模块的fab轻链可变区共享羧基末端肽键，后者继而与第一抗原结合模块的fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(vl(2)-cl(2)-vl(1)-ch1(1))，或其中第二抗原结合模块的fab轻链多肽与第一抗原结合模块的fab重链可变区共享羧基末端肽键，后者继而与第一抗原结合模块的fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(vl(2)-cl(2)-vh(1)-cl(1))。依照这些实施方案的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以进一步包含(i)fc域亚基多肽(ch2-ch3(-ch4))，或(ii)其中第三抗原结合模块的fab重链与fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(vh(3)-ch1(3)-ch2-ch3(-ch4))和第三抗原结合模块的fab轻链多肽(vl(3)-cl(3))。在某些实施方案中，多肽共价连接，例如通过二硫键。依照任何上述实施方案，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的各组分(例如抗原结合模块，fc域)可直接地或经由本文中描述或本领域已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽接头)融合。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(g4s)n，(sg4)n，(g4s)n或g4(sg4)n肽接头，其中n一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。fc域蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚体，其每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定域。fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含不超过一个fc域。在依照本发明的一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域是iggfc域。在一个具体的实施方案中，fc域是igg1fc域。在另一个实施方案中，fc域是igg4fc域。在一个更加具体的实施方案中，fc域是包含位置s228(kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代s228p的igg4fc域。此氨基酸替代降低igg4抗体的体内fab臂交换(参见stubenrauch等,drugmetabolismanddisposition38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，fc域是人的。促进异二聚化的fc域修饰依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含不同的抗原结合模块，其融合至fc域的两个亚基之一个或另一个，如此fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的产率和纯度，如此在蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在fc域的ch3域中。在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。因而，在一个具体的实施方案中，在蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域的第一亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的ch3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的ch3域内的空腔中，而且在fc域的第二亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的ch3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的ch3域内的隆起。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个特定的实施方案中，在fc域第一亚基的ch3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w)，而在fc域第二亚基的ch3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)。在一个实施方案中，在fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)。在还有又一个实施方案中，在fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c)，而在fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个具体的实施方案中，将能够结合cd3的抗原结合模块融合(任选地经由能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块)至fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚，能够结合cd3的抗原结合模块与fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个能够结合cd3的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。在一个备选的实施方案中，促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostaticsteeringeffect)的修饰，例如如记载于pct公开文本wo2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰fc域赋予蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子对表达fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的t细胞活化特性和长半衰期组合，在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带fc受体的)免疫细胞而非t细胞的活化甚至可能降低蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的功效，原因是例如通过nk细胞对t细胞的潜在破坏。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域展现出与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，fc域(或包含所述fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)展现出与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的对fc受体的结合亲和力，和/或与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，fc域(或包含所述fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)没有实质性结合fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述fc受体是fcγ受体。在一个实施方案中，所述fc受体是人fc受体。在一个实施方案中，所述fc受体是活化性fc受体。在一个特定的实施方案中，所述fc受体是活化性人fcγ受体，更具体地是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最具体地是人fcγriiia。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一项或多项：cdc，adcc，adcp，和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是adcc。在一个实施方案中，所述fc域展现出与天然igg1fc域相比基本相似的对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力。当fc域(或包含所述fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)展现出超过约70％，特别是超过约80％，更特别是超过约90％的天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)对fcrn的结合亲和力时，实现基本相似的对fcrn的结合。在某些实施方案中，fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域包含一处或多处降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低fc域对fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将fc域对fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低fc域对fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将fc域对fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子展现出与包含非工程化fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子相比少于20％，特别是少于10％，更特别是少于5％的对fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，fc受体是fcγ受体。在一些实施方案中，所述fc受体是人fc受体。在一些实施方案中，fc受体是活化性fc受体。在一个特定的实施方案中，fc受体是活化性人fcγ受体，更特别是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最特别是人fcγriiia。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对c1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力没有降低。当fc域(或包含所述fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)展现出非工程化形式的fc域(或包含所述非工程化形式的fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)对fcrn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对fcrn的结合，即保留该fc域对所述受体的结合亲和力。fc域或包含所述fc域的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对nk细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的靶物结合的抗体的交联，降低的树突细胞成熟，或降低的t细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的cdc，降低的adcc，降低的adcp，和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的adcc。在一个实施方案中，所述降低的adcc小于20％的由非工程化fc域(或包含非工程化fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)诱导的adcc。在一个实施方案中，所述降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：e233，l234，l235，n297，p331和p329。在一个更特定的实施方案中，fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：l234，l235和p329。在一些实施方案中，fc域包含氨基酸替代l234a和l235a。在一个此类实施方案中，fc域是igg1fc域，特别是人igg1fc域。在一个实施方案中，fc域包含在位置p329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是p329a或p329g，特别是p329g。在一个实施方案中，fc域包含在位置p329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：e233，l234，l235，n297和p331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是e233p，l234a，l235a，l235e，n297a，n297d或p331s。在具体的实施方案中，所述fc域包含在位置p329，l234和l235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述fc域包含氨基酸突变l234a，l235a和p329g(“p329glala”)。在一个此类实施方案中，fc域是igg1fc域，特别是人igg1fc域。氨基酸替代组合“p329glala”几乎完全消除了人igg1fc域的fcγ受体(以及补体)结合，如记载于pct公开文本no.wo2012/130831，其通过援引完整收入本文。wo2012/130831还描述了制备此类突变体fc域的方法和用于测定其特性(诸如fc受体结合或效应器功能)的方法。igg4抗体展现出与igg1抗体相比降低的对fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的fc域是igg4fc域，特别是人igg4fc域。在一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代s228p。为了进一步降低其对fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置l235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代l235e。在另一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置p329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代p329g。在一个具体的实施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228，l235和p329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代s228p，l235e和p329g。此类igg4fc域突变体及其fcγ受体结合特性记载于pct公开文本no.wo2012/130831，其通过援引完整收入本文。在一个具体的实施方案中，展现出与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的fc域是包含氨基酸替代l234a，l235a和任选地p329g的人igg1fc域，或包含氨基酸替代s228p，l235e和任选地p329g的人igg4fc域。在某些实施方案中，已消除fc域的n-糖基化。在一个此类实施方案中，所述fc域包含在位置n297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(n297a)或天冬氨酸(n297d)替换天冬酰胺的氨基酸替代。在上文和pct公开文本no.wo2012/130831中描述的fc域以外，具有降低的fc受体结合和/或效应器功能的fc域还包括那些具有fc域残基238，265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327的两个或更多个处的替代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利no.7,332,581)。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体fc域。遗传方法可以包括编码dna序列的位点特异性诱变，pcr，基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。可以容易地测定对fc受体的结合，例如通过elisa或通过使用标准仪器诸如biacore仪(gehealthcare)的表面等离振子共振(spr)进行，并且fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定fc受体的细胞系，如表达fcγiiia受体的人nk细胞来估测fc域或包含fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对fc受体的结合亲和力。可通过本领域中已知的方法来测量fc域或包含fc域的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的效应器功能。本文中描述了用于测量adcc的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利no.5,500,362；hellstrom等，procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemann等,jexpmed166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.mountainview,ca)；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的adcc活性，例如在动物模型中，诸如披露于clynes等,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)的。在一些实施方案中，fc域对补体成分(特别是对c1q)的结合是降低的。因而，在其中fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的cdc。可实施c1q结合测定法来测定蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子是否能够结合c1q并因此具有cdc活性。参见例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可实施cdc测定法(参见例如gazzano-santoro等,jimmunolmethods202,163(1996)；cragg等,blood101,1045-1052(2003)；以及cragg和glennie,blood103,2738-2743(2004))。抗原结合模块本发明的抗原结合分子是双特异性的，即它包含至少两种能够特异性结合两种不同抗原性决定簇的抗原结合模块。依照本发明，所述抗原结合模块是fab分子(即由各自包含可变区和恒定区的重链和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中，所述fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述fab分子是人源化的。在再一个实施方案中，所述fab分子包含人重链和轻链恒定区。至少一个抗原结合模块是交换fab分子。此类修饰防止来自不同fab分子的重链和轻链的错误配对，由此改进了重组生产中本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的产率和纯度。在可用于本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一种具体的交换fab分子中，fab轻链和fab重链的恒定区是交换的。在可用于本发明蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的另一种交换fab分子中，fab轻链和fab重链的可变区是交换的。在依照本发明的一个具体的实施方案中，所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子能够同时结合靶细胞抗原(特别是肿瘤细胞抗原)和cd3。在一个实施方案中，所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子能够通过同时结合靶细胞抗原和cd3来交联t细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，此类同时结合导致靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致t细胞的活化。在其它实施方案中，此类同时结合导致t淋巴细胞(特别是细胞毒性t淋巴细胞)的细胞应答，其选自下组：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性，和活化标志物的表达。在一个实施方案中，在没有同时结合靶细胞抗原的情况下蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子对cd3的结合不导致t细胞活化。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子能够将t细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个具体的实施方案中，所述重定向不依赖于靶细胞的mhc介导的肽抗原呈递和/或t细胞的特异性。具体地，依照本发明任何实施方案的t细胞是细胞毒性t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞是cd4+或cd8+t细胞，特别是cd8+t细胞。cd3结合模块本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个能够结合cd3的抗原结合模块(在本文中也称作“cd3抗原结合模块”或“第一抗原结合模块”)。在一个特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子提供对cd3的单价结合。cd3抗原结合是交换fab分子，即其中fab重和轻链的可变或恒定区任一是交换的fab分子。在蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中包含超过一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块的实施方案中，能够特异性结合cd3的抗原结合模块优选是交换fab分子且能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块是常规fab分子。在一个特定的实施方案中，cd3是人cd3或食蟹猴cd3，最特别是人cd3。在一个特定的实施方案中，cd3抗原结合模块是对人和食蟹猴cd3交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合cd3的ε亚基。cd3抗原结合模块包含选自由seqidno：11，seqidno：12和seqidno：13组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18，seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，cd3抗原结合模块包含seqidno：11的重链cdr1，seqidno：12的重链cdr2，seqidno：13的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2，和seqidno：19的轻链cdr3。在一个实施方案中，cd3抗原结合模块包含seqidno：44的重链cdr1，seqidno：45的重链cdr2，seqidno：46的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2，和seqidno：19的轻链cdr3。在一个实施方案中，cd3抗原结合模块包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。在一个实施方案中，cd3抗原结合模块包含包含seqidno：43的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，cd3抗原结合模块包含seqidno：43的重链可变区序列和seqidno：55的轻链可变区序列。靶细胞抗原结合模块本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块(在本文中也称作“靶细胞抗原结合模块”或“第二”或“第三”抗原结合模块)。在某些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含两个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块。在一个特定的此类实施方案中，这些抗原结合模块每个特异性结合相同抗原性决定簇。在一个甚至更加特定的实施方案中，这些抗原结合模块全部相同。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含能够特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含不超过两个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块。在一个优选的实施方案中，靶细胞抗原结合模块是结合特定抗原性决定簇且能够将蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子引导至靶部位(例如携带抗原性决定簇的特定类型的肿瘤细胞)的fab分子，特别是常规fab分子。在某些实施方案中，靶细胞抗原结合模块特异性结合细胞表面抗原。在一个特定的实施方案中，靶细胞抗原结合模块特异性结合靶细胞的表面上的叶酸受体1(folr1)。在另一个特定的此类实施方案中，靶细胞抗原结合模块特异性结合表皮生长因子受体(egfr)，具体是人egfr，例如her1。在另一个特定的此类实施方案中，靶细胞抗原结合模块特异性结合her2。在另一个特定的此类实施方案中，靶细胞抗原结合模块特异性结合间皮素，具体是人间皮素。在某些实施方案中，靶细胞抗原结合模块针对与病理学状况有关的抗原，诸如在肿瘤细胞或病毒感染细胞上呈现的抗原。合适的抗原是细胞表面抗原，例如但不限于细胞表面受体。在特定的实施方案中，抗原是人抗原。在一个具体的实施方案中，靶细胞抗原选自叶酸受体1(folr1)和表皮生长因子受体(egfr)，具体是人egfr，例如her1。在又一个具体的实施方案中，靶细胞抗原是her2。在又一个具体的实施方案中，靶细胞抗原是间皮素。在一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块。在一个实施方案中，对her1特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：56，seqidno：57和seqidno：58组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：59，seqidno：60，和seqidno：61的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，对her1特异性的抗原结合模块包含seqidno：56的重链cdr1，seqidno：57的重链cdr2，seqidno：58的重链cdr3，seqidno：59的轻链cdr1，seqidno：60的轻链cdr2，和seqidno：61的轻链cdr3。在一个实施方案中，对her1特异性的抗原结合模块包含pct申请公开号wo2006/082515中披露的抗her1抗体的重链和轻链cdr序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：32至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：33至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：34至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列中的至少一项。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：32的多肽序列，seqidno：33的多肽序列，和seqidno：34的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含与seqidno：41或42至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：41或42的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型her1scfv，其包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：35至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其具有包含与seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列的蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：97的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：86的多肽序列。在一些实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块。在一个实施方案中，对her2特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：142，seqidno：143和seqidno：144组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149，和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr。在又一个实施方案中，对her2特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：145，seqidno：146和seqidno：147组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：148，seqidno：149，和seqidno：150的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，对her2特异性的抗原结合模块包含seqidno：142的重链cdr1，seqidno：143的重链cdr2，seqidno：144的重链cdr3，seqidno：148的轻链cdr1，seqidno：149的轻链cdr2，和seqidno：150的轻链cdr3。在又一个实施方案中，对her2特异性的抗原结合模块包含seqidno：145的重链cdr1，seqidno：146的重链cdr2，seqidno：147的重链cdr3，seqidno：148的轻链cdr1，seqidno：149的轻链cdr2，和seqidno：150的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含与seqidno：41或42至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：41或42的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型her2scfv，其包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：35至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其具有包含与seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列的蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：97的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对her2特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：86的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：132至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：136至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：81至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：133至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：132的多肽序列，seqidno：136的多肽序列，seqidno：81的多肽序列和seqidno：133的多肽序列。在特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块。在一个实施方案中，folr1是人folr1。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对人folr1特异性的且不结合人folr2或人folr3的抗原结合模块。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含seqidno：14的重链cdr1，seqidno：15的重链cdr2，seqidno：16的重链cdr3，seqidno：17的轻链cdr1，seqidno：18的轻链cdr2，和seqidno：19的轻链cdr3。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno：47至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：55至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含包含seqidno：47的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含seqidno：151的重链cdr1，seqidno：152的重链cdr2，seqidno：153的重链cdr3，seqidno：154的轻链cdr1，seqidno：155的轻链cdr2，和seqidno：156的轻链cdr3。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno：157至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：158至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含包含seqidno：157的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：158的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：2至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：1至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：2的多肽序列和seqidno：1的多肽序列。在一个实施方案中包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：20的重链cdr1的多肽序列，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含与seqidno：41或42至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：41或42的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其具有包含与seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列的蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：97的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对folr1特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：86的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：1至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：3至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：72至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：1至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：3至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：72至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：1至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：3至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：85至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：1至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：3至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：73至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：74至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：1的多肽序列，seqidno：3的多肽序列和seqidno：72的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：1的多肽序列，seqidno：3的多肽序列和seqidno：85的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：1的多肽序列，seqidno：3的多肽序列，seqidno：73的多肽序列和seqidno：74的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：137至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：139至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：81至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：138至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：137的多肽序列，seqidno：139的多肽序列，seqidno：81的多肽序列和seqidno：138的多肽序列。在特定的实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块。在一个实施方案中，间皮素是人间皮素。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个对人间皮素特异性的抗原结合模块。在一个实施方案中，对间皮素特异性的抗原结合模块包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。在一个实施方案中，对间皮素特异性的抗原结合模块包含seqidno：107的重链cdr1，seqidno：108的重链cdr2，seqidno：109的重链cdr3，seqidno：110的轻链cdr1，seqidno：111的轻链cdr2，和seqidno：112的轻链cdr3。在又一个实施方案中，对间皮素特异性的抗原结合模块包含与seqidno：113至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：114至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，对间皮素特异性的抗原结合模块包含包含seqidno：113的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：114的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3。在一个实施方案中，包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含抗独特型cd3scfv，其包含与seqidno：41或42至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：41或42的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其具有包含与seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列的蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：97的多肽序列。在一个实施方案中，包含至少一个对间皮素特异性的抗原结合模块的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子进一步包含接头，其包含与seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：86的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：77至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：78至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：81至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：82至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：76至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：77至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：78至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：79至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：77的多肽序列，seqidno：78的多肽序列，seqidno：81的多肽序列和seqidno：82的多肽序列。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：76的多肽序列，seqidno：77的多肽序列，seqidno：78的多肽序列和seqidno：79的多肽序列。在一个实施方案中，提供的是t细胞活化性双特异性分子，其包含与seqidno：76至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：77至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：78至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：81至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，t细胞活化性双特异性分子包含与seqidno：77至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：78至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：81至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列和与seqidno：84至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：76的多肽序列，seqidno：77的多肽序列，seqidno：78的多肽序列和seqidno：81的多肽序列。在一个实施方案中，t细胞活化性双特异性分子包含seqidno：77的多肽序列，seqidno：78的多肽序列，seqidno：81的多肽序列和seqidno：84的多肽序列。掩蔽模块本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个掩蔽模块。其他人试图通过用受到结合模块识别的抗原的片段给结合模块加帽来掩蔽抗体的结合(例如wo2013128194)。这种办法具有数项限制。例如，使用抗原容许在降低结合模块的亲和力方面灵活性较少。这是因为亲和力不得不高得足以受到抗原掩蔽物的可靠掩蔽。还有，解离的抗原可潜在地在体内与它的关联受体结合并相互作用，并对表达此类受体的细胞引起不想要的信号。与之对比，本文中描述的办法使用抗独特型抗体或其片段作为掩蔽物。设计有效掩蔽模块的两项抵触的考虑是1.掩蔽的有效性和2.掩蔽的可逆性。如果亲和力太低，那么掩蔽会是无效的。然而，如果亲和力太高，那么掩蔽过程可能不是容易可逆的。是高亲和力抗独特型掩蔽还是低亲和力抗独特型掩蔽会运作更好是不可预测的。如本文中描述的，更高亲和力掩蔽模块在掩蔽抗原结合位点方面性能总体更好，而且同时为了活化分子能有效去除。在一个实施方案中，抗独特型掩蔽具有1-8nm的kd。在一个实施方案中，抗独特型掩蔽于37℃具有2nm的kd。在一个具体的实施方案中，掩蔽模块识别能够特异性结合cd3(例如人cd3)的第一抗原结合模块的独特型。在一个具体的实施方案中，掩蔽模块识别能够结合靶细胞抗原的第二抗原结合模块的独特型。在一个实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，掩蔽模块包含seqidno：20的重链cdr1，seqidno：21的重链cdr2，seqidno：22的重链cdr3，seqidno：23的轻链cdr1，seqidno：24的轻链cdr2，和seqidno：25的轻链cdr3。在一个实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含与seqidno：41至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含seqidno：41的多肽序列。在一个优选的实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，掩蔽模块包含seqidno：26的重链cdr1，seqidno：27的重链cdr2，seqidno：28的重链cdr3，seqidno：29的轻链cdr1，seqidno：30的轻链cdr2，和seqidno：31的轻链cdr3。在一个实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含与seqidno：42至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个优选的实施方案中，掩蔽模块掩蔽cd3结合模块且包含seqidno：42的多肽序列。在一个实施方案中，掩蔽模块掩蔽her1结合模块且包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3中的至少一个。在一个实施方案中，抗独特型scfv包含seqidno：48的重链cdr1，seqidno：49的重链cdr2，seqidno：50的重链cdr3，seqidno：51的轻链cdr1，seqidno：52的轻链cdr2，和seqidno：53的轻链cdr3。在一个方面，本发明涉及一种用于可逆隐蔽分子的抗原结合的独特型特异性多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于可逆隐蔽分子的抗cd3抗原结合位点的独特型特异性多肽。此类用于可逆隐蔽抗cd3抗原结合位点的独特型特异性多肽必须能够特异性结合抗cd3抗原结合位点的独特型并由此降低或消除抗cd3抗原结合位点对cd3的结合。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于可逆隐蔽分子的抗her1抗原结合位点的独特型特异性多肽。在一个实施方案中，独特型特异性多肽是抗独特型scfv。在一个实施方案中，独特型特异性多肽经由接头共价附着至分子。在一个实施方案中，独特型特异性多肽经由超过一个接头共价附着至分子。在一个实施方案中，独特型特异性多肽经由两个接头共价附着至分子。在一个实施方案中，接头是肽接头。在一个实施方案中，接头是蛋白酶可切割接头。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，或10的序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7，8，9，10，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95或96的序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：7的多肽序列。在一个实施方案中，接头包含seqidno：86的多肽序列。在一个实施方案中，肽接头包含至少一个蛋白酶识别位点。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含seqidno：36，37，38，39，40，97，98，99，100，101，102，103，104，105或106的多肽序列。在一个优选的实施方案中，蛋白酶识别位点包含蛋白酶识别序列rqarvvng(seqidno：36)。在又一个实施方案中，接头包含超过一个蛋白酶识别位点。在一个优选的实施方案中，蛋白酶识别位点包含蛋白酶识别序列vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)。在一个实施方案中，蛋白酶选自由金属蛋白酶，例如mmp(基质金属蛋白酶)1-28和adam(解联蛋白和金属蛋白酶)2，7-12，15，17-23，28-30和33，丝氨酸蛋白酶，例如尿激酶型纤溶酶原活化剂和matriptase，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶蛋白酶组成的组。在一个具体的实施方案中，蛋白酶是mmp9或mmp2。在又一个具体的实施方案中，蛋白酶是matriptase。在一个实施方案中，包含抗cd3抗原结合位点的分子是t细胞活化性双特异性分子。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的重链可变区：dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；和pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的轻链可变区：rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述各项的重链可变区：dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的重链可变区：sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；和gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的轻链可变区：rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述各项的重链可变区：sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的重链可变区：seqidno：48的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；seqidno：49的cdrh2氨基酸序列；和seqidno：50的cdrh3氨基酸序列。在一个实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述至少一项的轻链可变区：seqidno：51的轻链互补决定区(cdrl)1氨基酸序列；seqidno：52的cdrl2氨基酸序列；和seqidno：53的cdrl3氨基酸序列。在一个实施方案中，独特型特异性多肽包含包含下述各项的重链可变区：seqidno：48的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；seqidno：49的cdrh2氨基酸序列；和seqidno：50的cdrh3氨基酸序列，和包含下述各项的轻链可变区：seqidno：51的轻链互补决定区(cdrl)1氨基酸序列；seqidno：52的cdrl2氨基酸序列；和seqidno：53的cdrl3氨基酸序列。多核苷酸本发明还提供分离的多核苷酸，其编码如本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段。在一些实施方案中，所述片段是抗原结合片段。本发明的多核苷酸包括那些与seqidno62-71或seqidno所列序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的，包括其功能性片段或变体。本发明的多核苷酸进一步包括那些与seqidno117-131所列序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的，包括其功能性片段或变体。本发明的多核苷酸进一步包括那些与seqidno162-170所列序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的，包括其功能性片段或变体。可以将编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的多核苷酸以编码完整蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的单一多核苷酸表达，或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。例如，抗原结合模块的轻链部分可以与蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中包含抗原结合模块重链部分，fc域亚基和任选地(部分的)另一个抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成抗原结合模块。在另一个例子中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中包含两个fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个抗原结合模块的部分可以与蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中包含两个fc域亚基中另一个和任选地(部分的)抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，fc域亚基会联合以形成fc域。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码依照本文中描述的发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的全部。在其它实施方案中，所述分离的多核苷酸编码依照本文中描述的发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子中包含的多肽。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，47，或55中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno，2，3，4，5，6，7，8，9，10，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，47，55，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，47，55，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，132，133，134，135，136，137，138，139，140或141中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，或71中所示核苷酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130或131中所示核苷酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，162，163，164，165，166，167，168，169或170中所示核苷酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，或71中所示核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130或131中所示核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含seqidno62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，162，163，164，165，166，167，168，169或170中所示核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与seqidno43，47，或55中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变区序列的序列。本发明涵盖编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno43，47，或55的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与seqidno43，47，55，113，114，115或116中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变区序列的序列。本发明涵盖编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno43，47，55，113，114，115或116的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与seqidno43，47，55，113，114，115，116，157，158，159，160或161中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变区序列的序列。本发明涵盖编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno43，47，55，113，114，115，116，157，158，159，160或161的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是rna，例如以信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链或双链的。本发明进一步提供编码如本文中描述的独特型特异性多肽或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，所述片段是独特型结合性，即抗独特型特异性抗体或其片段。在一个实施方案中，所述独特型特异性多肽是抗独特型scfv。本发明还涵盖编码本发明的独特型特异性多肽或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，48，49，50，51，52，和53中的一个或多个的多肽序列的序列。本发明还涵盖编码本发明的独特型特异性多肽或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码seqidno20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，48，49，50，51，52，和53中的一个或多个的多肽序列及保守氨基酸替代的序列。可以将编码本发明的独特型特异性多肽的多核苷酸以编码完整独特型特异性多肽的单一多核苷酸表达，或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性独特型特异性多肽，例如掩蔽模块。例如，在一个实施方案中，所述独特型特异性多肽是抗独特型scfv(单链可变片段)，其中所述抗独特型scfv的轻链可变部分与抗独特型scfv中包含抗独特型scfv重链可变部分的部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成抗独特型scfv。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码依照本文中描述的发明的独特型特异性多肽。在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是rna，例如以信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链或双链的。重组方法可以获得本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，例如通过固相肽合成(例如merrifield固相合成)或重组生成进行。对于重组生成，分离一种或多种编码所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于maniatis等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y(1989)的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(tag，tga或taa)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mrna的转录并且如果两个dna片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力，则两个dna片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导dna的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，以及内含子-a)，猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和家兔β球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或ires，亦称为cite序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(ltr)或腺伴随病毒(aav)反向末端重复(itr)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，那么可以将编码信号序列的dna置于编码本发明蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽n端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的短蛋白序列的dna纳入蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(cho)，昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)，和li等,natbiotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利no.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(293或293t细胞，如例如记载于graham等,jgenvirol36,59(1977))，幼仓鼠肾细胞(bhk)，小鼠塞托利(sertoli)细胞(tm4细胞，如例如记载于mather,biolreprod23,243-251(1980)的)，猴肾细胞(cv1)，非洲绿猴肾细胞(vero-76)，人宫颈癌细胞(hela)，猕猴肾细胞(mdck)，buffalo大鼠肝细胞(brl3a)，人肺细胞(w138)，人肝细胞(hepg2)，小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562)，tri细胞(如例如记载于mather等,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)的)，mrc5细胞和fs4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如yo，ns0，p3x63和sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.c.lo编,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞，人胚肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0，ns0，sp20细胞)。本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的方法，其中所述方法包括在适合于所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子表达的条件下培养包含编码蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的组分彼此遗传融合。蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。在某些实施方案中，所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一个或多个抗原结合模块至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如harlow和lane,“antibodies,alaboratorymanual”,coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利no.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如mccafferty的美国专利no.5,969,108)。可以将抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区的任何动物种类用于本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区可以是鼠，灵长类或人起源的。如果蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如winter的美国专利no.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如almagro和fransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如riechmann等,nature332,323-329(1988)；queen等,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；jones等,nature321,522-525(1986)；morrison等,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrison和oi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等,methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；dall’acqua等,methods36,43-60(2005)(描述“fr改组”)；和osbourn等,methods36,61-68(2005)以及klimka等,brjcancer83,252-260(2000)(描述了fr改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)以及lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如hoogenboom等，于methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等编,humanpress,totowa,nj,2001)；和mccafferty等,nature348,552-554；clackson等,nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链fv(scfv)片段或作为fab片段。在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本no.2004/0132066的方法进行，据此通过援引收录其完整内容。可以经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在biacoret100系统上分析)(liljeblad等,glycoj17,323-329(2000))和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域，例如与v9抗体竞争对cd3的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols,”于methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如cd3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体(例如us6,054,297中记载的v9抗体)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一经标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，所述技术如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷，疏水性，亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以使用连续的蛋白a或g亲和层析和大小排阻层析来分离蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的纯度，包括凝胶电泳，高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的重链融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性sds-page证明的(见例如图8-12)。在约mr25,000,mr50,000和mr75,000处解析出三条条带，其对应于预测的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的分子量。测定法通过本领域中已知的各种测定法，可以鉴定，筛选或表征本文中提供的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的物理/化学特性和/或生物学活性。亲和力测定法可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如biacore仪(gehealthcare)通过表面等离振子共振(spr)测定蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子对fc受体或靶抗原的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(facs)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用t100仪(gehealthcare)于25℃测量kd。为了分析fc部分与fc受体之间的相互作用，通过固定化于cm5芯片上的抗五his抗体(qiagen)来捕捉带his标签的重组fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(cm5,gehealthcare)依照供应商说明书用n-乙基-n’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化。将抗五his抗体用10mm醋酸钠ph5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(ru)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nm捕捉fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为500nm至4000nm)在hbs-ep(gehealthcare,10mmhepes,150mmnacl,3mmedta,0.05％表面活性剂p20,ph7.4)中于25℃以约30μl/分钟的流速注射120秒。为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化cm5传感器芯片表面上的抗人fab特异性抗体(gehealthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五-his抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000ru。双特异性构建体在300nm捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nm的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。使用稳定态响应通过langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数kd。使用简单的1对1langmuir结合模型(t100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(kd)计算为比率k解离/k结合。参见例如chen等,jmolbiol293,865-881(1999)。活性测定法可以通过各种测定法来测量本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的生物学活性，如实施例中描述的。生物学活性可例如包括诱导t细胞的增殖，诱导t细胞中的信号传导，诱导t细胞中活化标志物的表达，诱导通过t细胞的细胞因子分泌，诱导靶细胞如肿瘤细胞的裂解，和诱导肿瘤消退和/或改善存活。组合物，配制剂和施用路径在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的药物组合物，例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。还提供以适于体内施用的形式生成本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，并(b)将所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子制剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利，变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由remington’spharmaceuticalsciences,18thed.mackprintingcompany,1990例示的，其通过援引收入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足fda生物标准部门(fdaofficeofbiologicalstandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性，热原性(pyrogenicity)，一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂，缓冲剂，分散介质，涂料材料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗细菌剂，抗真菌剂)，等张剂，吸收延缓剂，盐，防腐剂，抗氧化剂，蛋白质，药物，药物稳定剂，聚合物，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂(disintegrationagent)，润滑剂，甜味剂，芳香剂，染料，此类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如remington’spharmaceuticalsciences,18thed.mackprintingcompany,1990,pp.1289-1329，通过援引收入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体，液体还是气雾剂形式施用，以及其对于此类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，损伤内，颅内，关节内，前列腺内，脾内，肾内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，肿瘤内，肌内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，表面(topically)，局部(locally)，通过吸入(例如气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，直接浸洗靶细胞的局部灌注，经由导管，经由灌洗，以乳剂，以液体组合物(例如脂质体)，或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如remington’spharmaceuticalsciences,18thed.mackprintingcompany,1990，通过援引收入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下，皮内，损伤内，静脉内，动脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(hanks)氏溶液，林格(ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液，悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸，柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethoniumchloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkoniumchloride)；氯化苄乙铵(benzethoniumchloride)；酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(peg)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体，清蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。此类技术披露于remington’spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝，明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。在先前描述的组合物外，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用此类长效配制剂。如此，例如所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。可以通过常规的混合，溶解，乳化，包囊，包载或冻干过程来制备包含本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。可以将蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以游离酸或碱，中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidadditionsalt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁；或有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。治疗方法和组合物可以将本文中提供的任一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子用在治疗方法中。本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制，给药和施用本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症，治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的起因，药剂的投递部位，施用方法，施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。在一个方面，提供用作药物的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中，本发明提供如本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中，本发明提供蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，该方法包括对该个体施用有效量的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中，所述药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中，所述药物用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括对该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在存在t细胞，特别是细胞毒性t细胞的情况下使靶细胞与本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子接触。在一个别的方面，提供一种用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。在某些实施方案中，所述待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌，脑癌，头和颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血液癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌和肾癌。其它可使用本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物：腹部，骨，乳房，消化系统，肝，胰，腹膜，内分泌腺(肾上腺，副甲状腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼，头和颈，神经系统(中枢和外周)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾，胸区，和泌尿生殖系统。还包括癌前状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自下组：肾细胞癌，皮肤癌，肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，脑癌，头和颈癌。熟练技术人员容易地认可在许多情况下，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此，在一些实施方案中，提供生理学变化的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者，患者或个体通常为哺乳动物，更特定地为人。在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子以治疗疾病。为了预防或治疗疾病，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，施用路径，患者的体重，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的类型，疾病的严重程度和进程，施用蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子是为了预防还是治疗目的，先前或同时的治疗干预，患者的临床史和对蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的响应，以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用，推注施用，和脉冲输注。所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重，约5微克/kg体重，约10微克/kg体重，约50微克/kg体重，约100微克/kg体重，约200微克/kg体重，约350微克/kg体重，约500微克/kg体重，约1毫克/kg体重，约5毫克/kg体重，约10毫克/kg体重，约50毫克/kg体重，约100毫克/kg体重，约200毫克/kg体重，约350毫克/kg体重，约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用此类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20，或例如约6剂的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的ic50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。使用本领域中公知的技术，还能从体内数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。可以个别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过hplc测量血浆中的水平。在局部施用或选择性摄取的情况中，蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。本文中描述的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定ld50(对50％的群体致命的剂量)和ed50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表示为ld50/ed50比。优选展现出较大治疗指数的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。在一个实施方案中，依照本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ed50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式，利用的施用路径，受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂，施用路径和剂量(参见例如fingl等,1975，于：thepharmacologicalbasisoftherapeutics,ch.1,p.1,通过援引完整收入本文)。用本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止，中断或调整施用(由于毒性，器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗的状况的严重程度，施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄，体重和应答而变化。其它药剂和治疗本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调控剂，细胞抑制剂，细胞粘着的抑制剂，细胞毒剂，细胞凋亡的激活剂，或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏物，抗代谢物，拓扑异构酶抑制剂，dna嵌入剂，烷化剂，激素疗法，激酶抑制剂，受体拮抗剂，肿瘤细胞凋亡的激活剂，或抗血管生成剂。此类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于使用的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的量，病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径，或以本文中描述的剂量的约1至99％，或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前，同时和/或之后发生。本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子还可以与放射疗法组合使用。制品在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗，预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，iv溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗，预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，林格(ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。例示性实施方案1.一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块；(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合模块；和(c)经由蛋白酶可切割接头共价附着至该t细胞双特异性结合分子的掩蔽模块，其中该掩蔽模块能够特异性结合该第一或该第二抗原结合模块的独特型，由此可逆隐蔽该第一或该第二抗原结合模块。2.实施方案1的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块且可逆隐蔽该第一抗原结合模块。3.实施方案1或2的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块的重链可变区。4.实施方案1或2的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块共价附着至该第一抗原结合模块的轻链可变区。5.实施方案1至4任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块是抗独特型scfv。6.实施方案2至5任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子包含可逆隐蔽该第二抗原结合模块的第二掩蔽模块。7.实施方案1至6任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶由该靶细胞表达。8.实施方案1至7任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的。9.实施方案1至8任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块是交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的恒定区是交换的。10.实施方案1至9任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块是常规fab分子。11.实施方案1至10任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块。12.实施方案1至11任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含第三抗原结合模块，它是能够特异性结合靶细胞抗原的fab分子。13.实施方案12的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。14.实施方案1至13任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1或her1。15.实施方案1至13任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合选自由folr1，her1和间皮素组成的组的靶细胞抗原。16.实施方案1至13任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合选自由folr1，her1，her2和间皮素组成的组的靶细胞抗原。17.实施方案1至16任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一和该第二抗原结合模块彼此融合，任选经由肽接头。18.实施方案1至17任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端。19.实施方案1至17任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第二抗原结合模块的fab重链的n端。20.实施方案1至19任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块的fab轻链和该第二抗原结合模块的fab轻链彼此融合，任选经由肽接头。21.实施方案1至20任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其另外包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。22.实施方案21的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc域是igg，具体是igg1或igg4，fc域。23.实施方案21或22的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc域是人fc域。24.实施方案21至23任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc域展现与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。25.实施方案24的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc域包含降低对fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸替代。26.实施方案25的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该一处或多处氨基酸替代在选自l234，l235，和p329(kabat编号方式)的组的一个或多个位置处。27.实施方案26的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc域的每个亚基包含降低对活化性fc受体的结合和/或效应器功能的三处氨基酸替代，其中所述氨基酸替代是l234a，l235a和p329g。28.实施方案24至27任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该fc受体是fcγ受体。29.实施方案24至28任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。30.实施方案1至29任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；和(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列。31.实施方案1至30任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。32.实施方案1至31任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述各项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。33.实施方案1至29任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；和(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列。34.实施方案1至29和33任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。35.实施方案1至29和33至34任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述各项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。36.实施方案1至35任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)dyyin(seqidno：48)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)vinpdsggtdynqnfkg(seqidno：49)的cdrh2氨基酸序列；和(c)rdsygfdy(seqidno：50)的cdrh3氨基酸序列。37.实施方案1至36任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)kaslsvtndva(seqidno：51)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)yasnrna(seqidno：52)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qqdytsppt(seqidno：53)的cdrl3氨基酸序列。38.实施方案1至37任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该掩蔽模块包含包含下述各项的重链可变区：a)dyyin(seqidno：48)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；b)vinpdsggtdynqnfkg(seqidno：49)的cdrh2氨基酸序列；和c)rdsygfdy(seqidno：50)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：d)kaslsvtndva(seqidno：51)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；e)yasnrna(seqidno：52)的cdrl2氨基酸序列；和f)qqdytsppt(seqidno：53)的cdrl3氨基酸序列。39.实施方案1至38任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可切割接头包含至少一个蛋白酶识别序列。40.实施方案39的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列。41.实施方案40的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶识别序列选自由下述各项组成的组：(a)rqarvvng(seqidno：36)；(b)vhmplgflgpgrsrgsfp(seqidno：37)；(c)rqarvvngxxxxxvplslysg(seqidno：38)；和(d)rqarvvngvplslysg(seqidno：39)(e)plglwsq(seqidno：40)，其中x是任何氨基酸。42.实施方案40的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶识别序列选自由下述各项组成的组：(a)rqarvvng(seqidno：36)；(b)vhmplgflgpgrsrgsfp(seqidno：37)；(c)rqarvvngxxxxxvplslysg(seqidno：38)；(d)rqarvvngvplslysg(seqidno：39)；(e)plglwsq(seqidno：40)；(f)vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)；(g)fvggtg(seqidno：98)；(h)kkaapvng(seqidno：99)；(i)pmakkvng(seqidno：100)；(j)qarakvng(seqidno：101)；(k)vhmplgflgp(seqidno：102)；(l)qarak(seqidno：103)；(m)vhmplgflgppmakk(seqidno：104)；(n)kkaap(seqidno：105)；和(o)pmakk(seqidno：106)，其中x是任何氨基酸。43.实施方案39或40的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列rqarvvng(seqidno：36)。44.实施方案39或40的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)。45.实施方案39或40的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列rqarvvng(seqidno：36)或蛋白酶识别序列vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)。46.实施方案1至45任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶选自由金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶蛋白酶组成的组。47.实施方案46的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(mmp)，优选mmp9或mmp2。48.实施方案46的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该丝氨酸蛋白酶是matriptase。49.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块包含选自由seqidno：44，seqidno：45和seqidno：46组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。50.实施方案1至49任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块能够特异性结合cd3且包含包含下述各项的重链可变区：a)tyamn(seqidno：44)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；b)rirskynnyatyyadsvkg(seqidno：45)的cdrh2氨基酸序列；和c)hgnfgnsyvswfay(seqidno：46)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：d)gsstgavttsnyan(seqidno：17)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；e)gtnkrap(seqidno：18)的cdrl2氨基酸序列；和f)alwysnlwv(seqidno：19)的cdrl3氨基酸序列。51.实施方案1至50任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块包含包含与seqidno：43的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。52.实施方案1至50任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第一抗原结合模块能够特异性结合cd3且包含包含seqidno：43的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。53.实施方案1至52任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含选自由seqidno：14，seqidno：15和seqidno：16组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：17，seqidno：18和seqidno：19的组的至少一个轻链cdr。54.实施方案1至53任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含下述各项的重链可变区：a)nawms(seqidno：14)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；b)riksktdggttdyaapvkg(seqidno：15)的cdrh2氨基酸序列；和c)pwewswydy(seqidno：16)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：d)gsstgavttsnyan(seqidno：17)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；e)gtnkrap(seqidno：18)的cdrl2氨基酸序列；和f)alwysnlwv(seqidno：19)的cdrl3氨基酸序列。55.实施方案1至54任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：55的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。56.实施方案1至54任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含seqidno：47的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。57.实施方案1至52任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含选自由seqidno：151，seqidno：152和seqidno：153组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：154，seqidno：155和seqidno：156的组的至少一个轻链cdr。58.实施方案1至52或57任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含下述各项的重链可变区：a)syymh(seqidno：151)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；b)iinpsggstsyaqkfqg(seqidno：152)的cdrh2氨基酸序列；和c)sfftgfhldy(seqidno：153)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：d)rasqsvsssyla(seqidno：154)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；e)gassrat(seqidno：155)的cdrl2氨基酸序列；和f)qqytnehyyt(seqidno：156)的cdrl3氨基酸序列。59.实施方案1至52，57或58任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：157的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：158的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。60.实施方案1至52或57至59任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合folr1且包含包含seqidno：157的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：158的氨基酸序列的轻链可变区。61.实施方案1至52任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含选自由seqidno：107，seqidno：108和seqidno：109组成的组的至少一个重链互补决定区(cdr)和选自seqidno：110，seqidno：111和seqidno：112的组的至少一个轻链cdr。62.实施方案1至52或61任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含包含下述各项的重链可变区：a)gytmn(seqidno：107)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；b)litpyngassynqkfrg(seqidno：108)的cdrh2氨基酸序列；和c)ggydgrgfdy(seqidno：109)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：d)sasssvsymh(seqidno：110)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；e)dtsklas(seqidno：111)的cdrl2氨基酸序列；和f)qqwskhplt(seqidno：112)的cdrl3氨基酸序列。63.实施方案1至52，61或62任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno：114的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。64.实施方案1至52或61至63任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合间皮素且包含包含seqidno：113的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：114的氨基酸序列的轻链可变区。65.实施方案1至52任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块包含包含与seqidno：32的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链和包含与seqidno：33的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。66.实施方案1至52或65任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该第二抗原结合模块能够特异性结合her1且包含包含seqidno：115的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：116的氨基酸序列的轻链可变区。67.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：2的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。68.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：4的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。69.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含a)包含seqidno：32的氨基酸序列的至少一条重链；b)包含seqidno：34的氨基酸序列的至少一条轻链。70.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：72的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。71.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：85的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；和(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的轻链。72.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：73的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：3的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：1的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：74的氨基酸序列的第二轻链。73.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：77的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：82的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：78的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：81的氨基酸序列的第二轻链。74.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：76的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：77的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：78的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：79的氨基酸序列的第二轻链。75.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：132的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：136的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：81的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：133的氨基酸序列的第二轻链。76.实施方案1至48任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其包含(a)包含seqidno：137的氨基酸序列的第一重链；(b)包含seqidno：139的氨基酸序列的第二重链；(c)包含seqidno：81的氨基酸序列的第一轻链；和(d)包含seqidno：138的氨基酸序列的第二轻链。77.一种用于可逆隐蔽分子的抗cd3抗原结合位点的独特型特异性多肽。78.实施方案77的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽是抗独特型scfv。79.实施方案77或78的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽经由接头共价附着至该分子。80.实施方案79的独特型特异性多肽，其中该接头是肽接头。81.实施方案79或80的独特型特异性多肽，其中该接头是蛋白酶可切割接头。82.实施方案79至81任一项的独特型特异性多肽，其中该肽接头包含至少一个蛋白酶识别位点。83.实施方案82的独特型特异性多肽，其中该蛋白酶选自由金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶蛋白酶组成的组。84.实施方案83的独特型特异性多肽，其中该金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(mmp)，优选mmp9或mmp2。85.实施方案83的独特型特异性多肽，其中该丝氨酸蛋白酶是matriptase。86.实施方案82的独特型特异性多肽，其中该蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列rqarvvng(seqidno：36)或蛋白酶识别序列vhmplgflgprqarvvng(seqidno：97)。87.实施方案77至86任一项的独特型特异性多肽，其中该分子是t细胞活化性双特异性分子。88.实施方案77至87任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；和(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列。89.实施方案77至88任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述至少一项的轻链可变区：(a)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(b)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(c)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。90.实施方案77至87任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述各项的重链可变区：(a)dysih(seqidno：20)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)wintetgepayaddfkg(seqidno：21)的cdrh2氨基酸序列；(c)pydydvldy(seqidno：22)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasksvstsnysyih(seqidno：23)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)yvsyles(seqidno：24)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhsrefpwt(seqidno：25)的cdrl3氨基酸序列。91.实施方案77至87任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述至少一项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；和(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列。92.实施方案77至87和91任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述至少一项的轻链可变区：(d)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。93.实施方案77至87任一项的独特型特异性多肽，其包含包含下述各项的重链可变区：(a)sygvs(seqidno：26)的重链互补决定区(cdrh)1氨基酸序列；(b)iiwgdgstnyhsalis(seqidno：27)的cdrh2氨基酸序列；(c)gittvvddyyamdy(seqidno：28)的cdrh3氨基酸序列；和包含下述各项的轻链可变区：(d)rasenidsyla(seqidno：29)的轻链(cdrl)1氨基酸序列；(e)aatflad(seqidno：30)的cdrl2氨基酸序列；和(f)qhyystpyt(seqidno：31)的cdrl3氨基酸序列。94.实施方案77至93任一项的独特型特异性多肽，其中该抗cd3抗原结合位点包含包含seqidno：43的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno：55的氨基酸序列的轻链可变区。95.一种分离的多核苷酸，其编码实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性抗原结合分子或实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽。96.一种多肽，其由实施方案95的多核苷酸编码。97.一种载体，，特别是表达载体，其包含实施方案95的多核苷酸。98.一种宿主细胞，其包含实施方案95的多核苷酸或实施方案97的载体。99.一种生成蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子条件下培养实施方案98的宿主细胞，并b)回收该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子。100.一种蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其通过实施方案99的方法生成。101.一种生成独特型特异性多肽的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达该独特型特异性多肽的条件下培养实施方案98的宿主细胞，并b)回收该独特型特异性多肽。102.一种独特型特异性多肽，其通过实施方案101的方法生成。103.一种药物组合物，其包含实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子和药学可接受载剂。104.一种药物组合物，其包含实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽和药学可接受载剂。105.实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽或实施方案103的组合物，其用作药物。106.依照实施方案105的用途的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该药物用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展，治疗免疫相关疾病或延迟免疫相关疾病进展，或增强或刺激免疫应答或功能。107.实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽，其用于在有所需要的个体中治疗疾病。108.实施方案107的用于在有所需要的个体中治疗疾病的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或该独特型特异性多肽，其中该疾病是癌症。109.实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽用于制造药物的用途。110.实施方案109的用途，其中该疾病是癌症。111.一种在个体中治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的包含实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或实施方案103的组合物的组合物。112.一种用于诱导靶细胞裂解的方法，其包括在t细胞存在下使靶细胞与实施方案1至76任一项的蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子或实施方案103的组合物接触。113.实施方案112的方法，其中该靶细胞是癌细胞。114.实施方案112或113的方法，其中该靶细胞表达能够活化该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的蛋白酶。115.一种对抗cd3抗原结合分子的独特型特异性的抗独特型cd3抗体或其抗原结合片段，其中该抗独特型cd3抗体或其片段在结合至该抗cd3抗原结合分子时特异性阻断该抗cd3抗原结合分子对cd3的结合。116.实施方案115的抗独特型cd3抗体或其抗原结合片段，其中该抗独特型cd3抗体或其片段与该抗cd3抗原结合分子经由包含蛋白酶识别位点的肽接头可逆联合。117.实施方案115或116的抗独特型cd3抗体或其抗原结合片段，其中该cd3是小鼠，猴或人cd3。118.一种降低t细胞活化性双特异性分子的体内毒性的方法，其包括用蛋白酶可切割接头将实施方案77至94任一项的独特型特异性多肽附着至t细胞活化性双特异性分子以形成蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子，其中该蛋白酶可活化的t细胞活化性双特异性分子的体内毒性与该t细胞活化性双特异性分子的毒性相比降低。119.如本文中之前描述的发明。实施例下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其它实施方案。实施例1具有抗独特型scfv的单价抗cd3igg分子的合成。本文中描述的是用n端连接的抗独特型cd3scfv掩蔽的cd3结合物。这些构建物包括受到肿瘤特异性蛋白酶识别的蛋白酶识别位点。在蛋白酶表达性肿瘤细胞存在下，连接掩蔽模块的接头会受到切割，而且由此恢复cd3结合物的cd3结合。生成具有各种抗独特型scfv的数种单价抗cd3igg分子并与它们各自id编号一起示意性描绘于图1a-e。制备下面的分子：身份编号7859：单价cd3igg，(抗独特型scfv4.15.64-mk062matriptase位点-cd3-n端融合至cd3fab-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.15.64和蛋白酶可切割接头。身份编号7860：单价cd3igg，(抗独特型scfv4.32.63-mk062matriptase位点-cd3-n端融合至cd3fab-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和蛋白酶可切割接头。身份编号7857：单价cd3igg，(抗独特型scfv4.15.64-非可切割接头-cd3-n端融合至cd3fab-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.15.64和蛋白酶可切割接头。身份编号7858：单价cd3igg，(抗独特型scfv4.32.63-非可切割接头-cd3-n端融合至cd3fab-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和蛋白酶可切割接头。身份编号7861：单价cd3igg，(cd3fab-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.15.64/4.32.63和蛋白酶接头。通过race-pcr(cdna末端的快速扩增)自杂交瘤细胞的rna获得抗独特型(id)结合物序列。通过给小鼠免疫接种ch2527(vl_7-46(13)/vh_3-23(12))fab片段获得杂交瘤细胞。自invitrogen定购单链fv(scfv)序列合成，包括克隆必需的限制性位点。对六种不同抗独特型ch2527结合物比较它们的亲和力(图2，25℃/37℃biacore分析(agm.)的结果(分析物：mak<cea/cd3>rh))，而且作为cd3fab-fc的重链处的n端融合物克隆它们中的两种。与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的cd3vh链同框亚克隆抗id单链fvdna序列。蛋白质表达受mpsv启动子驱动且合成的polya信号序列存在于cds的3’端。另外，每一种载体含有ebvorip序列。通过使用聚乙烯亚胺(pei)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的hek293-ebna细胞来生成分子。以1:1:2比率(“fc穴(ch2-ch3)”:“共同轻链(clc)”:“载体重链节(scfv-vh-ch1-ch2-ch3)”)用相应的表达载体转染细胞。对于转染，在含有6mml-谷氨酰胺和250mg/lg418的无血清excell培养基中培养hek293ebna细胞。对于600ml旋转管烧瓶(最大工作体积400ml)中的生成，转染前24小时在没有g418的情况下接种800x106个hek293ebna细胞。对于转染，将800x106个细胞以210xg离心5分钟并用40ml预温热的含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基替换上清液。混合表达载体与40ml含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基至400μgdna的总量。添加1080μlpei溶液(2.7μg/ml)后，将混合物漩涡震荡15秒并随后于室温温育10分钟。之后，混合细胞与dna/pei溶液，转移至600ml旋转管烧瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加320mlexcell+6mml-谷氨酰胺+5g/lpepsoy+1.0mmvpa+3g/l葡萄糖培养基并将细胞培养24小时，之后补加7％补料7。培养6-7天后，收集上清液用于通过以210xg离心20-30分钟(sigma8k离心机)来纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并添加终浓度0.01％w/v的叠氮化钠。将溶液保存于4℃直至纯化。通过使用蛋白a亲和层析的亲和层析，继以一个至两个大小排阻层析步骤，自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用25ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph7.5平衡的hitrap蛋白aff柱(cv＝5ml，gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph7.5清洗来去除未结合的蛋白质并在20个柱体积(梯度0％-100％)的20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph2.5中洗脱靶蛋白质。通过添加1/10的2mtrisph10.5来中和蛋白质溶液。用ultra-15ultracel30k(merckmilliporeltd.)将靶蛋白质浓缩至最大4ml的体积，之后加载到用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0，0.01％tween20平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。对于大小排阻层析后的分析，通过在还原剂缺失下的sds-page及考马斯(instantbluetm，expedeon)染色来分析单一级分中分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用预制凝胶系统(4-12％bis-tris，invitrogen或3-8％tris-乙酸盐，invitrogen)。通过测量280nm处的光密度(od)，除以基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的ce-sds分析来分析最终的纯化步骤后分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用caliperlabchipgxii系统(caliperlifescience)。于25℃在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中使用tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析分子的聚集体含量。所有分子的最终质量均较好，单体含量≥92％。表2：蛋白酶活化的单价cd3igg分子的生成和纯化的汇总实施例2蛋白酶活化的igg的切割和稳定性。蛋白酶活化的igg分子的毛细管电泳。未经处理的样品和经过处理的样品的比较显示抗idscfv在用rhmatriptase/st14(r&dsystems)处理后完全切割掉，通过sds-page分析中的大小位移指示(图3)。对于37℃温育48小时的样品的分析确认分子在配制缓冲液中的稳定性(图3a-d)。实施例3抗独特型scfv对cd3igg的掩蔽效果。通过jurkat-nfat报告物测定法显示抗独特型cd3scfv的n端融合掩蔽cd3结合物的效率。如果nfat启动子通过cd3ε结合而激活的话，jurkat-nfat报告细胞(一种具有nfat启动子调节的萤光素酶表达的人急性淋巴性白血病报告细胞系，gloresponsejurkatnfat-re-luc2p，promega#cs176501)表达活性萤火虫萤光素酶。添加萤光素酶底物后发光信号的强度与cd3激活和信号传导的强度成比例。完全未掩蔽的单价cd3分子充当阳性对照。用rhmatriptase/st14(r&dsystems)于37℃进行处理48小时。平行地，在白色壁，透明底96孔(平)板(greinerbio-one)中8μg/ml抗人fc抗体(biolegends)在0.025μl/孔pbs中于4℃包被48小时。通过移液来去除pbs，之后以200nm-2.56pm的指示浓度范围添加单价igg。将板于4℃温育约30分钟。随后，收获jurkat-nfat报告细胞并使用vicell评估存活力。在没有潮霉素的jurkat培养基(rpmi1640，2g/l葡萄糖，2g/lnahco3，10％fcs，25mmhepes，2mml-glutamin，1xneaa，1x丙酮酸钠)上重悬浮细胞并将100μl/孔(25.000个细胞/孔)添加至交联的单价cd3igg。将细胞在增湿温箱中于37℃温育3小时。自温箱取出板达约10分钟以适应室温，之后读出发光。将100μl/孔one-glo溶液(1:1one-glo和测定培养基体积每孔)添加至孔并在黑暗中于室温温育10分钟。使用wallacvictor3elisa读数仪(perkinelmer2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。7857(4.15.64掩蔽物及不可切割接头)和7859(未处理的)显示与未掩蔽的(7861)和预处理的分子(7859经处理的)相比显著降低的cd3ε结合(图4a)。包括7760作为对照以显示n端连接自身并不阻断cd3结合。7858(4.32.63掩蔽物及不可切割接头)和7860(未处理的)显示与未掩蔽的(7861)和预处理的分子(7860经处理的)相比显著降低的cd3ε结合(图4b)。与抗独特型cd3结合物的亲和力一致，4.32.63掩蔽物比4.15.64有效得多。就ec50值而言(图4c)，4.32.63掩蔽cd3结合物结合比未掩蔽的cd3结合物7861少54倍。对于4.15.64掩蔽物，它的结合只比7861少16倍。取决于肿瘤靶和靶结合物，可以评估最好的掩蔽物。实施例4具有抗cd3scfv的抗folr1/抗cd3t细胞双特异性(tcb)分子的制备。生成具有各种抗独特型scfv的数种t细胞双特异性(tcb)分子并与它们各自id编号一起示意性描绘于图5a-h。制备下面的分子：id7344：folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.15.64-mk062matriptase位点-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.15.64和蛋白酶接头(图5a，seqidno1，2和3)。id7496：folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.32.63-mk062matriptase位点-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和蛋白酶接头(图5c，seqidno1，3和4)。id7676：folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.15.64-不可切割gs接头-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.15.64和蛋白酶接头(图5b，seqidno1，3和6)。id7611：folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.32.63-不可切割gs接头-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和蛋白酶接头(图5d，seqidno1，3和5)。通过race-pcr(cdna末端的快速扩增)自杂交瘤细胞的rna获得抗独特型(id)结合物序列。通过给小鼠免疫接种获得杂交瘤细胞。在invitrogen定购单链fv(scfv)序列合成，包括克隆必需的限制性位点。对六种不同抗独特型ch2527结合物比较它们的亲和力(图2，25℃/37℃biacore分析(agm.)的结果(分析物：mak<cea/cd3>rh))，而且作为cd3-folr116d5tcb的hc处的n端融合物克隆它们中的四种。与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的cd3vh链同框亚克隆抗id单链fvdna序列。蛋白质表达受mpsv启动子驱动且合成的polya信号序列存在于编码序列(cds)的3’端。另外，每一种载体含有ebvorip序列。通过使用聚乙烯亚胺(pei)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的hek293-ebna细胞来生成分子。以1:3:2比率(“载体重链穴(vh-ch1-ch2-ch3)”:“共同轻链(clc)”:“载体重链节(scfv-vh-ch1-vh-ch1-ch2-ch3)”)用相应的表达载体转染细胞。对于转染，在含有6mml-谷氨酰胺和250mg/lg418的无血清excell培养基中培养hek293ebna细胞。对于600ml旋转管烧瓶(最大工作体积400ml)中的生成，转染前24小时在没有g418的情况下接种800x106个hek293ebna细胞。对于转染，将800x106个细胞以210xg离心5分钟并用40ml预温热的含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基替换上清液。混合表达载体与40ml含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基至400μgdna的总量。添加1080μlpei溶液(2.7μg/ml)后，将混合物漩涡震荡15秒并随后于室温温育10分钟。之后，混合细胞与dna/pei溶液，转移至600ml旋转管烧瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加320mlexcell+6mml-谷氨酰胺+5g/lpepsoy+1.0mmvpa+3g/l葡萄糖培养基并将细胞培养24小时，之后补加7％补料7。培养6-7天后，收集上清液用于通过以210xg离心20-30分钟(sigma8k离心机)来纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并添加终浓度0.01％w/v的叠氮化钠。将溶液保存于4℃直至纯化。通过使用蛋白a亲和层析的亲和层析，继以一个至两个大小排阻层析步骤，自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用25ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph7.5平衡的hitrap蛋白aff柱(cv＝5ml，gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph7.5清洗来去除未结合的蛋白质并在20个柱体积(梯度0％-100％)的20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠，0.01％tween-20ph2.5中洗脱靶蛋白质。通过添加1/10的2mtrisph10.5来中和蛋白质溶液。用ultra-15ultracel30k(merckmilliporeltd.)将靶蛋白质浓缩至最大4ml的体积，之后加载到用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0，0.01％tween20平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。对于大小排阻层析后的分析，通过在还原剂缺失下的sds-page及考马斯(instantbluetm，expedeon)染色来分析单一级分中分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用预制凝胶系统(4-12％bis-tris，invitrogen或3-8％tris-乙酸盐，invitrogen)。通过测量280nm处的光密度(od)，除以基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的ce-sds分析来分析最终的纯化步骤后分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用caliperlabchipgxii系统(caliperlifescience)。于25℃在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中使用tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析分子的聚集体含量。所有分子的最终质量均较好，单体含量≥92％。表2：蛋白酶活化的tcb分子的生成和纯化的汇总实施例5蛋白酶活化的tcb的瞬时表达。通过大小排阻层析来比较用于转染的不同质粒比率，因为怀疑节链以与穴链和轻链相比要低的水平表达。如图6和7中所示，使用质粒比率1(穴):2(节):3(clc)(图7)代替1(穴):1(节):3(clc)(图6)提高正确分子(左峰)的产量并降低穴穴同二聚体(右峰)的量。实施例6蛋白酶活化的tcb的切割和稳定性。通过毛细管电泳来分析蛋白酶活化的tcb。未经处理的样品和经过处理的样品的比较显示抗独特型scfc模块在用rhmatriptase/st14处理后完全切割掉。对于37℃温育48小时的样品的分析确认分子在配制缓冲液中的稳定性(图12a-d)。实施例7使用表达不同水平的folr1的靶细胞系的细胞杀伤。使用表达不同水平的folr1的靶细胞系评估由蛋白酶活化的tcb分子诱导的t细胞介导的细胞杀伤(图13)。使用人pbmc作为效应细胞并在与蛋白酶活化的tcb分子一起温育48小时时检测细胞杀伤。自新鲜采集的血液或自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。对于新鲜血液，使用50mlleucosep管(greinerbioone)进行制备。对于富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)，使用histopaque-1077密度制备。用无菌pbs1:1稀释血液/血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，丢弃含有pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在细胞温箱中于37℃，5％co2在含有2％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc直至进一步使用。简言之，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并以0.4x106个细胞/ml在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。对于杀伤测定法，一式三份以指示浓度添加分子。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的最终e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育1小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。结果(图14a，15a，16，17，18a，19a和20a)显示具有通过不可切割接头n端连接的抗独特型cd3scfv模块的蛋白酶活化的tcb(#7676和#7611，分别是图5b和d)能够显著降低对skov3和ht29细胞的细胞裂解。#7611(图5d)引起对hela细胞的杀伤降低而#7676中的抗独特型cd3scfv4.15.64(图5b)在降低细胞裂解方面效率要低。这与抗独特型cd3scfvn模块的亲和力一致。更高亲和力scfv模块掩蔽更加高效。经过处理的和未经处理的tcb相当的效力提示hela和skov3细胞表达matriptase。matriptase的表达看来在ht29细胞中更低。用本文中使用的所有分子处理mkn-45(一种folr1阴性细胞系)仅仅显示弱杀伤(图15a)。实施例8肿瘤细胞系与人pbmc共温育后的t细胞活化。在hela，skov3和ht29细胞上评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞活化。使用人pbmc作为效应细胞并在与靶细胞和抗体一起温育48小时时检测t细胞活化。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。一式三份以指示浓度添加分子。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的最终e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化cd4阳性和cd8阳性t细胞上的cd25和cd69来评估t细胞活化。t细胞活化结果与在先前评估靶细胞杀伤的实施例(实施例7)中观察到的结果一致。实施例9由蛋白酶活化的tcb和表达低抗原水平的靶细胞系介导的t细胞活化。在仅仅表达低水平folr1的ht29细胞上评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞活化(图13)。使用自血沉棕黄层分离的人pbmc作为效应细胞。对于富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)，使用histopaque-1077密度制备。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，丢弃含有pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在细胞温箱中于37℃，5％co2在含有2％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc直至进一步使用。简言之，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，评估存活力并以0.4x106个细胞/ml在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。一式三份以指示浓度添加分子。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的最终e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化cd4阳性和cd8阳性t细胞上的cd25和cd69来评估t细胞活化。t细胞活化结果与在先前评估靶细胞杀伤的实施例(实施例7)中观察到的结果一致。经过处理的蛋白酶活化的tcb的效力与16d5tcb(6298)相当。16d5tcb(倒转型式)显示比经典型式要高的效力。具有不可切割接头或没有matriptase预处理的掩蔽tcb并不对这种细胞系诱导t细胞活化。对于具有低或中等folr1表达水平的细胞系，两种抗独特型scfv均充分掩蔽cd3fab(图22a和b)。实施例10由蛋白酶活化的tcb及原代细胞系hrcepic介导的t细胞活化。在仅仅表达很小量folr1的原代人肾皮质上皮细胞(sciencecell)细胞上评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞活化(图13)。使用自血沉棕黄层分离的人pbmc作为效应细胞。对于富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)，使用histopaque-1077密度制备。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，丢弃含有pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在细胞温箱中于37℃，5％co2在含有2％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc直至进一步使用。简言之，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并以0.4x106个细胞/ml在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。一式三份以指示浓度添加蛋白酶可活化的tcb分子。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的最终e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化cd4阳性和cd8阳性t细胞上的cd25和cd69来评估t细胞活化。掩蔽16d5tcb在10.000pmtcb的最高浓度并不在与原代人肾皮质上皮细胞一起温育后诱导t细胞活化，尽管有低水平folr1表达，证明抗独特型掩蔽模块的有效性。对16d5tcb(倒转和经典型式)能观察到很少的t细胞活化(图23)。实施例11抗idcd3fab掩蔽16d5tcb的cd3结合物。对ovcar3细胞的杀伤。在ovcar3细胞上评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞介导的靶细胞杀伤(图24)。使用人pbmc作为效应细胞并在与分子一起温育48小时时检测细胞杀伤。自健康供体的新鲜采集的血液分离人外周血单个核细胞(pbmc)。使用50mlleucosep管(greinerbioone)进行制备。用无菌pbs1:1稀释血液并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，丢弃含有pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在细胞温箱中于37℃，5％co2在含有2％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc直至进一步使用。简言之，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并以0.4x106个细胞/ml在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。对于杀伤测定法，一式三份以指示浓度添加分子。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的最终e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞和pbmc与1％tritonx-100一起温育1小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。结果(图24)显示具有通过不可切割接头n端连接的抗独特型cd34.15.64交叉fab的蛋白酶活化的tcb没有显著掩蔽cd3结合物。而且，ovcar3细胞表现出表达matriptase，因为未经处理的分子也诱导对这些细胞的杀伤。实施例12用三种不同人pbmc供体对skov3和hela细胞的杀伤。对表达不同水平的folr1的两种不同细胞系评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞杀伤(图25-27)。使用人pbmc作为效应细胞并在与分子一起温育48小时时检测细胞杀伤。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。对于富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)，使用histopaque-1077密度制备。用无菌pbs1:1稀释血液/血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，丢弃含有pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在coolcell盒中于-80℃冷冻过夜，之后将它们转移至液氮。在测定开始之前24小时，融化pbmc并在细胞温箱中于37℃，5％co2保存于含有10％fcs和1xglutamax的rpmi1640培养基中。测定开始前那天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并以0.4x106个细胞/ml在适宜的培养基中重悬浮。使用圆底96孔板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞。在测定开始那天，对pbmc计数并检查存活力。将pbmc以350g离心5分钟并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。去除靶细胞的培养基并将pbmc添加至靶细胞，之后一式三份以指示浓度添加稀释的抗体。包括folr116d5tcb作为阳性对照且包括非靶向性tcb分子(结合cd3但不结合靶细胞抗原)作为阴性对照。以10:1的e:t比将pbmc添加至靶细胞。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育2小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。结果(图25-27)显示具有通过不可切割接头n端连接的scfv4.32.63的folr1tcb(图5d)在100pm的浓度诱导降低的对hela细胞的杀伤且在10nm的浓度诱导降低的对skov3细胞的杀伤。具有通过不可切割接头n端连接的scfv4.15.64的folr1tcb(图5b)在10nm的浓度在降低对skov3细胞的杀伤方面效率要低。更强的掩蔽(意味着抗独特型scfv4.32.63具有更高的亲和力)在掩蔽cd3结合物方面比弱的抗独特型scfv4.15.64更加高效。经过处理的和未经处理的tcb相当的效力提示hela和skov3细胞表达蛋白酶，例如matriptase。实施例13用抗独特型ga201scfv掩蔽的her1结合性抗体ga201的制备。在这个实施例中制备下面的分子：1：具有抗独特型ga201scfv和甘氨酸丝氨酸接头中的基质金属蛋白酶位点的n端融合的ga201igg1抗体(seqidno32和34)；和2：her1结合性igg1抗体ga201(seqidno32和33)。其示意图显示于图28和29。使用分别结合可变轻和重链末端的简并引物通过rt-pcr(逆转录)自杂交瘤细胞的rna获得ga201抗独特型(id)结合物序列。通过给小鼠免疫接种获得杂交瘤细胞。在geneart定购具有侧翼单一选择性内切核酸酶位点的单链fv(scfv)dna序列合成并作为ga201轻链处的n端融合克隆。使用roche表达载体构建所有重和轻链scfv融合蛋白编码表达质粒。载体由下面的构件构成：-潮霉素抗性基因，作为选择标记，-埃巴二氏病毒(ebv)的复制起点，orip，-来自载体puc18的复制起点，其容许这种质粒在大肠杆菌中复制，-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，-来自人巨细胞病毒(hcmv)的立即早期增强子和启动子，-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polya”)信号序列，和-独特的bamhi和xbai限制性位点。通过依照制造商的用法说明书(invitrogen，usa)使用freestyletm293表达系统用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的人胚肾293-f细胞来生成分子。简言之，于37℃/8％co2在freestyletm293表达培养基中培养悬浮freestyletm293-f细胞并在转染那天以1-2x106个可存活细胞/ml的密度在新鲜的培养基中接种细胞。对于250ml最终转染体积以1:1摩尔比使用325μl293fectintm(invitrogen，germany)和250μg重(“ga201重链”)和轻链(“抗ga201vh-vlscfvmmp可切割接头g4sga201轻链”或“ga201轻链”)质粒dna在opti-memi培养基(invitrogen，usa)中制备dna-293fectintm复合物。转染后7天通过以14000g离心30分钟来收获含有抗体的细胞培养物上清液并穿过无菌滤器(0.22μm)过滤。将上清液保存于-20℃直至纯化。通过使用蛋白a亲和层析的亲和层析，继以大小排阻层析，自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。简言之，将经过无菌过滤的细胞培养物上清液应用至用pbs缓冲液(10mmna2hpo4，1mmkh2po4，137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.4)平衡的hitrap蛋白ahp(5ml)柱。用平衡缓冲液清洗掉未结合的蛋白质。用0.1m柠檬酸盐缓冲液，ph2.8洗脱抗体和抗体变体，并用0.1ml1mtris，ph8.5中和含有蛋白质的级分。然后，合并洗脱的蛋白质级分，用amiconultra离心过滤装置(mwco：30k，millipore)浓缩至3ml的体积并加载到用20mmhistidin，140mmnacl，ph6.0平衡的superdex200hiload120ml16/60凝胶过滤柱(gehealthcare，sweden)上。合并含有经过纯化的ga201-抗ga201-scfv或ga201且高分子量聚集体少于5％的级分并作为1.0mg/ml等分试样保存于-80℃。对于大小排阻层析后的蛋白质分析，通过在还原剂缺失下的sds-page及考马斯(instantbluetm，expedeon)染色来分析单一级分中分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用预制凝胶系统(4-12％bis-tris，invitrogen或3-8％tris-乙酸盐，invitrogen)。通过测量280nm处的光密度(od)，除以基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的ce-sds分析来分析最终的纯化步骤后分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用caliperlabchipgxii系统(caliperlifescience)。于25℃在200mmkh2po4，250mmkcl，ph7.0运行缓冲液中使用superdex200分析性大小排阻柱(gehealthcare，sweden)通过高效sec来分析分子的聚集体含量。以0.5ml/min的流速将25μg蛋白质注射到柱上并在50分钟里等度洗脱。所有分子的终纯度为≥95％单体含量，如通过高效sec检测的。抗独特型scfv掩蔽的ga201的分子量通过非还原条件下的ce-sds分析测定为216.3kda(图1a)，和还原条件下ga201重链58.3kda和scfv连接的ga201轻链60.3kda(图30b)。基于氨基酸序列的分子量计算为重链49.2kda和scfv融合的ga201轻链51.9kda，这指示hek293细胞中两条链的糖基化。表3：蛋白酶活化的ga201igg(图28)和ga201(图29)对照分子的生成和纯化的汇总分子上清液蛋白a-产量sec-产量11.0l1.3mg0.4mg21.0l26.4mg24mg实施例14抗独特型scfv对ga201igg的掩蔽效果。通过her1表达性h322m细胞上的facs分析和her1包被的芯片表面上的表面等离振子共振(spr)分析显示抗独特型ga201scfv的n端融合掩蔽ga201的her1结合的效率。对于ga201-抗ga201-scfv的蛋白水解切割，使用重组活性人mmp2(calbiochem)。将1mg通过含有mmp切割位点的甘氨酸丝氨酸接头融合至ga201的ga201抗独特型scfv与1.2μgmmp2一起在pbs中于37℃温育过夜。对于经切割和未切割的ga201-抗ga201-scfv的her1结合的facs分析，使用非小细胞肺癌系h322m。将细胞调节至1x106/ml并分配至96孔圆底板。添加分子并在冰上温育30分钟。将细胞用facs缓冲液(pbs+2％fcs+0.1％叠氮化钠)清洗一次并与f(ab’)2-山羊抗人iggfc二抗fitc缀合物(thermofisherscientific)一起重悬浮。在冰上再过20分钟后，将细胞清洗两次并在facs缓冲液中重悬浮并在bdfacscantoii中分析。测量10000个细胞并使用发光信号的中值进行分析。在ga201-抗ga201-scfv的mmp-2切割之前，h322m细胞上没有可测量的对her1的结合，指示抗独特型scfv完全掩蔽ga201结合域(图31)。未切割的ga201-抗ga201-scfv的结合与非特异性同种型igg对照抗体相当(图31)。与之对比，抗独特型scfv的mmp切割引起ga201的活化且对h322m细胞上的her1的结合恢复至与未掩蔽的亲本抗体ga201相似的水平(图31)为了确认mmp切割后受到掩蔽的ga201结合的facs结合数据，我们还使用biacoret100仪器(gehealthcarebiosciencesab，uppsala，sweden)实施了spr实验作为第二分析方法。使用标准胺偶联化学在cm5生物传感器的表面上固定化her1。在乙酸钠，ph5.0中以1μg/ml注射her1胞外域。以相同方式但仅用媒介缓冲液处理参照对照流动室。在1xpbsph7.4，0.05％tween20rochediagnosticsgmbh)中稀释过夜mmp切割之前和之后的ga201-抗ga201-scfv，和ga201，并以30μl/min的流速以3.125和50nm之间的渐增浓度注射。结合阶段为3分钟且解离时间为10分钟。用以5μl/min的流速注射0.85％磷酸30秒来再生her1结合。通过使用biaevaluation软件中的1:1朗格缪尔(langmuir)结合模型来计算动力学速率常数和平衡解离常数。对ga201亲本未掩蔽抗体测定到kd值1nm的对her1的结合(图32)。ga201-抗ga201-scfv的过夜mmp-2温育后，测量到2nm的kd值及与未掩蔽的对照抗体相似的关于结合和解离的ka和kd速率常数，指示通过蛋白酶切割完全恢复her1结合(图32)。未切割的ga201-抗ga201-scfv在spr分析中并不显示任何对her1的结合(图32)。总之，我们用两种独立的分析方法证明了通过将抗独特型scfv融合至igg1抗体ga201的n端使得对her1的结合完全丧失。而且，对her1的结合通过经由甘氨酸丝氨酸接头中的mmp切割位点中的蛋白酶切割去除scfv得到完全恢复。实施例15具有抗cd3scfv的抗folr1/抗cd3和抗间皮素/抗cd3t细胞双特异性(tcb)分子的制备。生成具有各种抗独特型scfv的数种t细胞双特异性(tcb)分子并与它们各自id编号一起示意性描绘于图33a-j。制备下面的分子：id8364：“folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.32.63-mmp9-mk062matriptase位点-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mmp9-mk062蛋白酶接头”(图33a，seqidno1，3和72)。id8363：“folr116d52+1igg，经典型式(抗独特型scfv4.32.63-组织蛋白酶s/b位点-cd3-n端融合至folr1vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和组织蛋白酶s/b蛋白酶接头”(图33b，seqidno1，3和85)。id8365：“folr116d52+1igg，倒转型式，(抗独特型scfv4.32.63-mk062matriptase接头-cd3-n端融合至cd3vl-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mk062matriptase接头”(图33c，seqidno1，3，73和74)。id8366：“folr116d52+1igg，倒转型式，(抗独特型scfv4.32.63-不可切割gs接头-cd3-n端融合至cd3vl-惰性fc),n端融合抗cd3scfv4.32.63和不可切割gs接头”(图33d)。id8672：“抗间皮素2+1igg，经典型式，msln电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-mmp9-mk062matriptase-cd3-n端融合至抗间皮素vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mmp9-mk062matriptase”(图33e，seqidno77，78，81，82)。id8673：“抗间皮素2+1igg，经典型式，msln电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-不可切割gs接头-cd3-n端融合至抗间皮素vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63不可切割gs接头”(图33f)。id8674：“抗间皮素2+1igg，倒转型式，msln电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-mmp9-mk062matriptase-cd3-n端融合至cd3vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mmp9-mk062matriptase”(图33g，seqidno76，77，78，79)。id8675：“抗间皮素2+1igg，倒转型式，msln电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-不可切割gs接头-cd3-n端融合至cd3vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和不可切割gs接头”(图33h)。id8505：“抗间皮素2+1igg，倒转型式，msln电荷变体，cd3(抗间皮素hcn端融合至cd3vl-惰性fc)”(图33i)。id8676：“抗间皮素2+1igg，经典型式，msln电荷变体，cd3交叉(抗间皮素igg及cd3-n端融合至抗间皮素vh-惰性fc)”(图33j)。与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的域同框亚克隆可变域。蛋白质表达受mpsv启动子驱动且合成的polya信号序列存在于cds的3’端。另外，每一种载体含有ebvorip序列。通过使用聚乙烯亚胺(pei)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的hek293-ebna细胞来生成分子。(8505除外，通过用哺乳动物表达载体悬浮生长的共转染cho细胞来生成此分子。在evitriaag(switzerland)进行瞬时转染。)对于转染，在含有6mml-谷氨酰胺和250mg/lg418的无血清excell培养基中培养hek293ebna细胞。对于600ml旋转管烧瓶(最大工作体积400ml)中的生成，转染前24小时在没有g418的情况下接种800x106个hek293ebna细胞。对于转染，将800x106个细胞以210xg离心5分钟并用40ml预温热的含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基替换上清液。混合表达载体与40ml含有6mml-谷氨酰胺的cdcho培养基至400μgdna的总量。添加1080μlpei溶液(2.7μg/ml)后，将混合物漩涡震荡15秒并随后于室温温育10分钟。之后，混合细胞与dna/pei溶液，转移至600ml旋转管烧瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加320mlexcell+6mml-谷氨酰胺+5g/lpepsoy+1.0mmvpa+3g/l葡萄糖培养基并将细胞培养24小时，之后补加7％补料7。培养6-7天后，收集上清液用于通过以210xg离心20-30分钟(sigma8k离心机)来纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并添加终浓度0.01％w/v的叠氮化钠。将溶液保存于4℃直至纯化。通过使用蛋白a亲和层析的亲和层析，继以一个至两个大小排阻层析步骤，自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5平衡的蛋白amabselectsure(cv＝5ml，gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5清洗来去除未结合的蛋白质并在20个柱体积(梯度0％-100％)的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0中洗脱靶蛋白质。通过添加1/10的0.5mna2hpo4ph8.0来中和蛋白质溶液。用ultra-15ultracel30k(merckmilliporeltd.)将靶蛋白质浓缩至最大4ml的体积，之后加载到用20mm组氨酸，140mmnacl，0.01％tweenph6.0平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。通过测量280nm处的光密度(od)，除以基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的ce-sds分析来分析最终的纯化步骤后分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用caliperlabchipgxii系统(caliperlifescience)。于25℃在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中使用tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析分子的聚集体含量。所有分子的最终质量均较好，单体含量≥95％。表4：蛋白酶活化的tcb分子的生成和纯化的汇总实施例16质量控制和稳定性-不同tcb分子的毛细管电泳sds分析。通过还原剂存在和缺失下的ce-sds分析来分析最终的纯化步骤后分子的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书使用caliperlabchipgxii系统(caliperlifescience)。未经处理的分子(于4℃保存的)，经过处理的分子(用适宜的重组蛋白酶(r&dsystems)于37℃处理24小时)和于37℃温育72小时的分子的比较(图34，35a和35b)。未经处理的和经过处理的分子的比较显示rhmatriptase/st14处理含有mk062matriptase接头的倒转型式后抗idscfv的完全切割但mmp9-mk062matriptase接头的不完全切割。重组人组织蛋白酶b和重组人组织蛋白酶s处理也是不完全的。用于加工纯化的酶的条件尚未是最佳的。于37℃温育72小时的分子以与纯分子相同的高度运转，提示分子于37℃对于体外测定法持续时间是稳定的。使用预染色的蛋白质标志物mark12(invitrogen)来估算正确的分子量。实施例17不同接头和型式的蛋白酶活化的folr1tcb的比较。jurkatnfat活化测定法。用于不同型式和接头的蛋白酶活化的tcb的比较的jurkatnfat活化测定法。jurkat-nfat报告细胞系(promega)是一种具有nfat启动子，表达人cd3ε的人急性淋巴性白血病报告细胞系。如果tcb结合肿瘤靶且cd3结合物(交联)结合cd3ε的话，可以在添加one-glo底物(promega)后以发光测量萤光素酶表达。在96孔白色壁透明底板(greinerbioone)中在50μl/孔没有潮霉素的jurkat培养基(rpmi1640，2g/l葡萄糖，2g/lnahco3，10％fcs，25mmhepes，2mml-glutamin，1xneaa，1x丙酮酸钠)中接种20.000个靶细胞。将板于37℃温育约20小时。收获jurkat-nfat报告细胞并使用vicell评估存活力。在没有潮霉素的jurkat培养基中重悬浮细胞并添加50μl/孔(50.000个细胞/孔)。e:t比为2.5:1(基于接种的细胞数)。在没有潮霉素的jurkat培养基中稀释抗体并添加50μl/孔。将细胞在增湿温箱中于37℃温育6小时，之后将它们自温箱取出达10分钟以适应至室温，之后读出发光。将50μl/孔one-glo溶液添加至孔并在黑暗中于室温温育10分钟。使用wallacvictor3elisa读数仪(perkinelmer2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。经过预处理的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色实心正方形)和folr1tcb(黑色朝下三角形)的比较显示切割后的效力完全恢复。此浓度范围中对于两种细胞系对于与掩蔽的tcb(含有gs不可切割接头，灰色朝上三角形)和非靶向性tcb对照(空心朝下三角形)一起温育的细胞检测不到发光。点线显示没有任何tcb的情况下靶细胞和效应细胞的发光(图36a和36b)。实施例18由不同型式的蛋白酶活化的tcb介导的肿瘤细胞细胞毒性。对表达不同水平的folr1的细胞系评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞杀伤。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含有pbmc的界面转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在cool细胞冷冻容器(biocision)中于-80℃缓慢冷冻，然后转移至液氮。在测定开始之前1天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用96孔圆底板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞并在增湿温箱中于37℃温育约20小时。在测定开始之前约20小时，在rpmi1640培养基(10％fcs，1xglutamax)中融化pbmc。将pbmc以350g离心7分钟。在新鲜的培养基(rpmi1640，10％fcs，1xglutamax)中重悬浮团粒并在增湿温箱中于37℃温育最多24小时。在测定开始那天，收获pbmc并以350g离心7分钟。在测定培养基中重悬浮团粒并将100ul/孔中的0.2x106个pbmc(e:t10:1，基于接种的靶细胞的数目)添加至靶细胞。在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中稀释分子并一式三份以指示浓度添加50ul/孔，之后将板在增湿温箱中于37℃温育约48小时。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。结果(图37a和37b)显示两种不同型式的蛋白酶活化的tcb的比较，二者均含有用mk062matriptase接头连接的抗独特型cd3scfv4.32.63。倒转型式的蛋白酶活化的tcb(8365，灰色圆圈)看来在杀伤(hela和skov-3靶细胞)方面比经典型式的蛋白酶活化的tcb(8408，深灰色朝上三角形)更加有力。然而，含有不可切割接头的倒转分子(8366，浅灰色正方形)在掩蔽方面比经典分子(8409，深灰色朝下三角形)效率要低。图37chela靶细胞细胞毒性。含有抗独特型cd3scfv4.32.63和具有不同蛋白酶位点的gs接头的经典蛋白酶活化的tcb的比较。含有mmp9-matriptasemk062接头的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色正方形)达到folr1tcb(浅灰色朝下三角形)的效力而仅含有matriptasemk062的蛋白酶活化的tcb(浅灰色菱形)在杀伤hela细胞方面效率更低。含有组织蛋白酶位点(灰色圆圈)或不可切割接头(黑色朝下三角形)的分子是相当的。图37dskov-3靶细胞细胞毒性。含有抗独特型cd3scfv4.32.63和具有不同蛋白酶位点的gs接头的经典蛋白酶活化的tcb的比较。含有mmp9-matriptasemk062接头的蛋白酶活化的tcb(8364，灰色正方形)几乎达到folr1tcb(浅灰色朝下三角形)的效力而仅含有matriptasemk062的蛋白酶活化的tcb(浅灰色菱形)在杀伤skov-3细胞方面效率更低。含有组织蛋白酶位点的分子(灰色圆圈)效力比仅含有matriptasemk062位点的分子要低且含有不可切割接头的分子(黑色朝下三角形)在指示浓度范围中对skov-3细胞仅仅诱导10％以下的杀伤。实施例19人肾上皮皮质细胞或人支气管上皮细胞与tcb和人pbmc共温育后的t细胞活化。对仅仅表达很少量的folr1的hrcepi(人肾皮质上皮细胞)和hbepic(人支气管上皮细胞)评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞活化。使用人pbmc作为效应细胞并在与分子和细胞一起温育48小时后对t细胞活化标志物染色。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含有pbmc的界面转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在cool细胞冷冻容器(biocision)中于-80℃缓慢冷冻，然后转移至液氮。在测定开始之前1天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用96孔平底板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞并在增湿温箱中于37℃温育约20小时。在测定开始之前约20小时，在rpmi1640培养基(10％fcs，1xglutamax)中融化pbmc。将pbmc以350g离心7分钟。在新鲜的培养基(rpmi1640，10％fcs，1xglutamax)中重悬浮团粒并在增湿温箱中于37℃温育最多24小时。在测定开始那天，收获pbmc并以350g离心7分钟。在测定培养基中重悬浮团粒并将100ul/孔中的0.2x106个pbmc(e:t10:1，基于接种的靶细胞的数目)添加至靶细胞。在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中稀释分子并一式三份以指示浓度添加，之后将板在增湿温箱中于37℃温育约48小时。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化cd4阳性和cd8阳性t细胞上的cd25和cd69来评估t细胞活化。包括folr116d5tcb(6298)和非靶向性tcb(结合cd3但不结合靶细胞抗原，7235)作为对照。每个点代表三名不同人pbmc供体的一式三份的均值。以误差棒指示标准偏差。使用不配对t检验进行统计分析。对于folr1tcb，对于cd8阳性细胞，结果显示cd69的升高，其显著高于蛋白酶活化的tcb的中值荧光强度(图38a和38b)。实施例20由不同型式的蛋白酶活化的间皮素(msln)tcb介导的肿瘤细胞细胞毒性。对表达不同水平的间皮素(msln)的细胞系评估由蛋白酶活化的tcb分子介导的t细胞杀伤。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含有pbmc的界面转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在cool细胞冷冻容器(biocision)中于-80℃缓慢冷冻，然后转移至液氮。在测定开始之前1天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用96孔圆底板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞并在增湿温箱中于37℃温育约20小时。在测定开始之前约20小时，在rpmi1640培养基(10％fcs，1xglutamax)中融化pbmc。将pbmc以350g离心7分钟。在新鲜的培养基(rpmi1640，10％fcs，1xglutamax)中重悬浮团粒并在增湿温箱中于37℃温育最多24小时。在测定开始那天，收获pbmc并以350g离心7分钟。在测定培养基中重悬浮团粒并将100ul/孔中的0.2x106个pbmc(e:t10:1，基于接种的靶细胞的数目)添加至靶细胞。在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中稀释分子并一式三份以指示浓度添加，之后将板在增湿温箱中于37℃温育约48小时。于37℃，5％co2温育48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。结果(图39a和39b)显示由蛋白酶活化的mslntcb(8672)介导的对ncih596和aspc-1细胞系的靶细胞杀伤。蛋白酶活化的tcb几乎达到mslntcb(8676)对ncih596和aspc-1的效力。含有不可切割gs接头的分子(8673)在指示浓度范围中对两种细胞系均没有诱导杀伤。实施例21用于监测原代肿瘤样品中的靶表达(folr1tcb)和蛋白酶活性(蛋白酶活化的folr1tcb)的jurkat-nfat报告物测定法。此测定法的意图是显示人肿瘤样品中肿瘤靶抗原(folr1)表达和肿瘤特异性蛋白酶像mmp9，matriptase或组织蛋白酶的活性。jurkat-nfat报告细胞系(promega)是一种具有nfat启动子，表达人cd3ε的人急性淋巴性白血病报告细胞系。如果t细胞双特异性分子结合肿瘤靶和cd3ε(交联)的话，可测量萤光素酶表达。在添加one-glo底物(promega)后测量发光。自indivumedgmbh(germany)接收原代肿瘤样品。在转运培养基中运输样品过夜。手术后约24小时，将样品切成小块。通过添加18μl冷的matrigel(matrigel(734-1101，corning/vwr)来准备96孔白色壁，平(透明)底板。再次将板于37℃温育2分钟，之后添加肿瘤碎片(一式三份)。添加33μl/孔冷的matrigel并将板于37℃温育2分钟。添加50μl/孔抗体稀释液(在没有潮霉素但含有2x青霉素/链霉素的jurkat培养基中)并将板于37℃，5％co2温育约48小时。收获jurkat-nfat报告细胞并使用vicell评估存活力。将细胞以350xg离心7分钟，之后将它们在没有潮霉素的jurkat培养基中重悬浮并添加50μl/孔(50.000个细胞/孔)。将板在增湿温箱中于37℃温育5小时，之后取出进行发光读出。将80μl每孔转移入白色壁96孔板。将27μl/孔one-glo溶液添加至每个孔并在黑暗中于室温温育10分钟。使用wallacvictor3elisa读数仪(perkinelmer2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。jurkatnfat报告细胞在与folr1tcb(6298)和含有mmp9-matriptase切割位点的蛋白酶活化的folr1tcb(8364)共温育后活化。蛋白酶活化的folr1tcb(8363，8408)和对照tcb(8409，7235)并不诱导萤光素酶表达。点线指示与肿瘤共温育的jurkatnfat细胞的基线发光(图40)。实施例22蛋白酶活化的tcb的血清稳定性。在人血清中温育后蛋白酶活化的tcb的毛细管电泳。将分子在增湿温箱中(5％co2)于37℃在人igg消减的血清中温育0或14天。所有分子通过亲和层析(蛋白a)进行纯化，然后通过毛细管电泳进行分析。或是在缓冲液(含0.01％tween-20的组氨酸缓冲液(bichsel))中或是在人血清(igg消减的，sp1839，tl-15216，16fsp63814)中添加100μg每种分子。分子的浓度高于2mg/ml且终浓度为0.5mg/ml。一种分子(8408)的预处理用rhmatriptase(r&dsystems)在增湿温箱中于37℃，5％co2进行24小时(在其它情况中血清的ph可以变化)。第0天的样品在液氮中直接冷冻并于-80℃保存直至分析。第14天的样品在增湿温箱中于37℃，5％co2温育14天直至将它们也骤冻。在ce-sds分析之前，经由hplc亲和层析纯化所有样品(agilenttechnologies1200系列，柱：upchurchscientificc-130b，包装材料：appliedbiosystemsporos20a60μl，缓冲液：10mmtris，50mm甘氨酸，500mmnaclph8.0和ph2.0，注射体积：100μl，流速1ml/min，收集：基于峰的，中和：0.5m磷酸钠ph8.010％体积)。蛋白酶活化的tcb在人igg消减的血清中稳定最少14天(图41a-c)。实施例23具有抗cd3scfv的抗her2/抗cd3和抗folr1/抗cd3t细胞双特异性(tcb)分子的设计。设计数种t细胞双特异性(tcb)分子并与它们各自id编号一起示意性描绘于图42a-f。设计下面的分子：id8955：“herceptarg2+1igg，经典型式，herceptarg电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-mmp9-mk062matriptase-cd3-n端融合至herceptargvh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mmp9-mk062matriptase”(图42a，seqidno81，132，133和136)。id8957：“herceptarg2+1igg，经典型式，herceptarg电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63–不可切割gs接头-cd3-n端融合至herceptargvh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和不可切割gs接头”(图42b，seqidno81，132，133和135)。id8959：“herceptarg2+1igg，经典型式，herceptarg电荷变体，cd3交叉(herceptargigg及cd3-n端融合至herceptargvh-惰性fc)”(图42c，seqidno81，132，133和134)。id8997：“folr136f22+1igg，经典型式，folr136f2电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-mmp9-mk062matriptase-cd3-n端融合至folr136f2vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和mmp9-mk062matriptase”(图42d，seqidno81，137，138和139)。id8998：“folr136f22+1igg，经典型式，folr136f2电荷变体，cd3交叉(抗独特型scfv4.32.63-不可切割gs接头-cd3-n端融合至folr136f2vh-惰性fc)，n端融合抗cd3scfv4.32.63和不可切割gs接头”(图42e，seqidno81，137，138和140)。id8996：“folr136f22+1igg，经典型式，folr136f2电荷变体，cd3交叉(folr136f2igg及cd3-n端融合至folr136f2vh-惰性fc)”(图42f，seqidno81，137，138和141)。与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的域同框亚克隆可变域。蛋白质表达受mpsv或cmv(用于herceptarg)启动子驱动且合成的polya信号序列存在于cds的3’端。另外，每一种载体含有ebvorip序列。实施例24由蛋白酶活化的folr1tcb介导的原代细胞细胞毒性。在表达低水平的folr1的原代细胞系上评估由蛋白酶活化的folr1tcb分子介导的t细胞杀伤(图43)。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含有pbmc的界面转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在cool细胞冷冻容器(biocision)中于-80℃缓慢冷冻，然后转移至液氮。在测定开始之前1天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用96孔平底板以20,000个细胞/孔的密度分配靶细胞并在增湿温箱中于37℃温育约20小时。在测定开始之前约20小时，在rpmi1640培养基(10％fcs，1xglutamax)中融化pbmc。将pbmc以350g离心7分钟。在新鲜的培养基(rpmi1640，10％fcs，1xglutamax)中重悬浮团粒并在增湿温箱中于37℃温育最多24小时。在测定开始那天，收获pbmc并以350g离心7分钟。在测定培养基中重悬浮团粒并将100ul/孔中的0.2x106个pbmc(e:t10:1，基于接种的靶细胞的数目)添加至靶细胞。在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中稀释分子并一式三份以指示浓度添加50μl/孔，之后将板在增湿温箱中于37℃温育约48小时，72小时或96小时。于37℃，5％co2温育48小时，72小时和96小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。由人pbmc和100nm或10nmfolr1tcb介导的人支气管上皮细胞毒性与蛋白酶活化的tcb相比要高。实施例25由蛋白酶活化的folr1tcb介导的folr1阴性靶细胞细胞毒性。在folr1阴性mkn-45细胞系上评估由蛋白酶活化的folr1tcb分子介导的t细胞杀伤(图44)。自从健康人供体获得的血沉棕黄层分离人外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs1:1稀释血沉棕黄层并在histopaque梯度(sigma，#h8889)上分层。离心(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含有pbmc的界面转移入新的falcon管，随后填充50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并在2mlack缓冲液中重悬浮pbmc团粒进行红细胞裂解。于37℃温育约2-3分钟后，对管填充无菌pbs至50ml并以350xg离心10分钟。这个清洗步骤重复一次，之后在含有10％fcs，1xglutamax和10％dmso的rpmi1640培养基中重悬浮pbmc。将pbmc在cool细胞冷冻容器(biocision)中于-80℃缓慢冷冻，然后转移至液氮。在测定开始之前1天，用胰蛋白酶/edta收获贴壁的靶细胞，计数，检查存活力并在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中重悬浮。使用96孔平底板以20000个细胞/孔的密度分配靶细胞并在增湿温箱中于37℃温育约20小时。在测定开始之前约20小时，在rpmi1640培养基(10％fcs，1xglutamax)中融化pbmc。将pbmc以350g离心7分钟。在新鲜的培养基(rpmi1640，10％fcs，1xglutamax)中重悬浮团粒并在增湿温箱中于37℃温育最多24小时。在测定开始那天，收获pbmc并以350g离心7分钟。在测定培养基中重悬浮团粒并将100ul/孔中的0.2x106个pbmc(e:t10:1，基于接种的靶细胞的数目)添加至靶细胞。在测定培养基(rpmi1640，2％fcs，1xglutamax)中稀释分子并一式三份以指示浓度添加50μl/孔，之后将板在增湿温箱中于37℃温育约48小时和72小时。于37℃，5％co2温育48小时，72小时和96小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的ldh(ldh检测试剂盒，rocheappliedscience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。最大靶细胞裂解(＝100％)通过在ldh读出之前将靶细胞与1％tritonx-100一起温育20小时来实现。最小裂解(＝0％)指在没有任何tcb的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。蛋白酶活化的tcb在100nm并不诱导靶细胞杀伤。例示性序列尽管为了理解清楚的目的已经通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。***序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（f.hoffmann-larocheltd）<120>蛋白酶活化的t细胞双特异性分子<130>p33331<160>170<170>patentinversion3.5<210>1<211>215<212>prt<213>嵌合的<400>1glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly151015thrvalthrleuthrcysglyserserthrglyalavalthrthrser202530asntyralaasntrpvalglnglulysproglyglnalaphearggly354045leuileglyglythrasnlysargalaproglythrproalaargphe505560serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala65707580glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn859095leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnpro100105110lysalaalaproservalthrleupheproproserserglugluleu115120125glnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrpro130135140glyalavalthrvalalatrplysalaaspserserprovallysala145150155160glyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlystyrala165170175alasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisarg180185190sertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthr195200205valalaprothrglucysser210215<210>2<211>971<212>prt<213>嵌合的<400>2glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu151015thrvalargilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr202530serilehistrpvallysglnalaproglylyscysleulystrpmet354045glytrpileasnthrgluthrglygluproalatyralaaspaspphe505560lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr65707580leuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrphephecys859095alahisprotyrasptyraspvalleuasptyrtrpglyglnglythr100105110servalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyser115120125glyglyglyglyserglyglyglyglyseraspthrvalleuthrgln130135140serproalaserleuglyvalserleuglyglnargalathrileser145150155160cysargalaserlysservalserthrserasntyrsertyrilehis165170175trptyrglnglnlysproglyglnproprolysleuleuilelystyr180185190valsertyrleugluserglyvalproalaargpheserglysergly195200205serglythraspphethrleuasnilehisprovalgluglugluasp210215220alaalathrtyrtyrcysglnhisserargglupheprotrpthrphe225230235240glycysglythrlysleugluilelysglyglyglyglyserglygly245250255glyglyserargglnalaargvalvalasnglyglyglyglyglyser260265270glyglyglyglyserglyglyglyglysergluvalglnleuleuglu275280285serglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleusercys290295300alaalaserglyphethrpheserthrtyralametasntrpvalarg305310315320glnalaproglylysglyleuglutrpvalserargileargserlys325330335tyrasnasntyralathrtyrtyralaaspservallysglyargphe340345350thrileserargaspaspserlysasnthrleutyrleuglnmetasn355360365serleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysvalarghisgly370375380asnpheglyasnsertyrvalsertrpphealatyrtrpglyglngly385390395400thrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphe405410415proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu420425430glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp435440445asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu450455460glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser465470475480serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro485490495serasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysaspgly500505510glyglyglyserglyglyglyglysergluvalglnleuvalgluser515520525glyglyglyleuvallysproglyglyserleuargleusercysala530535540alaserglyphethrpheserasnalatrpmetsertrpvalarggln545550555560alaproglylysglyleuglutrpvalglyargilelysserlysthr565570575aspglyglythrthrasptyralaalaprovallysglyargphethr580585590ileserargaspaspserlysasnthrleutyrleuglnmetasnser595600605leulysthrgluaspthralavaltyrtyrcysthrthrprotrpglu610615620trpsertrptyrasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser625630635640seralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserser645650655lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasp660665670tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr675680685serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr690695700serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrgln705710715720thrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasp725730735lyslysvalgluprolyssercy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