阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用。

背景技术：

树突状细胞（dendritic cell；DC）是机体专职的抗原递呈细胞，可以识别、捕获和加工抗原，并将抗原递呈给naïve T细胞，激活抗原特异性的免疫反应，从而连接固有免疫系统和获得性免疫系统。在抗原递呈过程中，不同的信号参与了抗原特异性T细胞的激活，包括MHC-多肽复合物、DC和T细胞表面共刺激分子之间的相互作用、DC分泌的细胞因子等。DC分泌的白细胞介素-12（IL-12）可促进CD4⁺ Th1型免疫反应及细胞毒性T淋巴细胞反应，这两种免疫反应在肿瘤治疗中起着重要作用。DC疫苗（DC-based vaccine）是一种具有前景的肿瘤治疗性疫苗形式，在临床上可以诱导产生抗原特异性的免疫反应，安全性高。然而，由于DC未达到最佳成熟状态，并且分泌的IL-12水平较低，导致DC疫苗的临床效果有限。因此，需要通过佐剂提高DC成熟状态及IL-12分泌水平，从而提高DC疫苗的临床效果。

佐剂（如钟样受体激动剂：toll-like receptor (TLR) agonists）被广泛应用于新型疫苗（如多肽/蛋白疫苗、DNA疫苗及DC疫苗等），以提高疫苗的免疫原性。但是大部分佐剂具有毒副作用，不适合临床应用。目前美国FDA及欧洲批准用于临床应用的佐剂种类非常少，仅包括铝化合物佐剂、MF59、AS03、AF03及AS04。因此，急需开发新型、安全、高效的免疫佐剂增强疫苗的免疫原性，提高抗原特异性免疫反应，发挥疫苗良好的预防和治疗效果。

中草药已经有几千年的临床应用历史，临床效果与其有效成分对机体的免疫调节作用，尤其是对抗原递呈细胞的成熟状态及功能的调节密切相关，其安全性得到了充分的验证，并具有多效性，无依赖性等特征，是筛选安全、高效佐剂的理想来源。

技术实现要素：

本发明的目的是将从中药阿魏菇（Pleurotus ferulae）中提取纯化得到的阿魏菇多糖（PFPS）作为树突状细胞疫苗佐剂，刺激树突状细胞成熟，从而促进树突状细胞疫苗免疫反应，提高抗肿瘤效果。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用。

优选地，所述阿魏菇多糖为均一多糖，分子量为1500～1600kDa。

阿魏菇多糖的提取纯化方法，包括：

（1）采用水提醇沉法得到阿魏菇粗多糖；

（2）将阿魏菇粗多糖溶解于水中，然后过二乙氨基乙基纤维素柱，流动相为水和/或盐水。

优选地，所述盐水为浓度为0.05～0.3mol/L的氯化钠溶液。

优选地，所述盐水为浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 （A）阿魏菇粗多糖的洗脱曲线及洗脱液多糖含量，（B）不同流动相所得的洗脱液体外刺激DC成熟的活性。

图2 （A）为PFPS-0.05的纯化及分子量检测过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR的洗脱曲线，（B）PFPS-0.05的高效凝胶渗透色谱图。

图3 为PFPS-0.05对DC成熟及细胞因子表达的影响。收集体外培养的不成熟DC，用10、50、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小时。（A）通过流式细胞术检测DC表面CD40、CD80、 CD86和MHC II的表达。图中显示了这些蛋白的平均荧光强度（MFI）。（B）酶联免疫吸附法（ELISA）测定DC培养上清中白细胞介素-12（IL-12）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。数据来自4个独立的实验，并进行单因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01、***P <0.001，处理组与未处理组比较得出。

图4 为TLR4抑制剂对DC成熟及细胞因子表达的影响。收集体外培养的不成熟DC，用TLR4抑制剂（TAK-242）进行预处理，然后用10、50 、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小时。（A）通过流式细胞术检测DC表面CD40的表达。上边重叠峰图为CD40表达水平，下边为CD40的平均荧光强度（MFI）。（B）ELISA测定DC培养上清中IL-12及TNF-α的表达量。数据来自3个独立的实验，并进行成对t检验。

图5 为TLR4信号通路分子磷酸化水平检测。收集体外培养的不成熟DC，用50 μg/ml的PFPS-0.05进行刺激，在不同时间点收集DC，提取细胞质及细胞核蛋白，通过Western blot检测TLR4信号通路分子的磷酸化水平。

图6 为PFPS-0.05刺激的DC与人乳头瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DC）对肿瘤的治疗效果。肿瘤模型建立后，治疗分为早期治疗及晚期治疗，早期治疗组在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DC，晚期治疗组在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DC。对照组分别为在第5天及第12天注射PFPS+DC，或不治疗组。（A）左边为肿瘤体积生长曲线，右边为计算的曲线下面积（AUC）。（B）实验结束后，分离肿瘤并称重。数据进行单因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01，治疗组与不治疗组比较得出。

图7 为肿瘤小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例及亚群比例。实验结束后，分离脾脏细胞，通过流式细胞术检测CD4⁺（A）和CD8⁺（B）T细胞比例及亚群比例。*P<0.05、**P<0.01，治疗组与不治疗组比较得出。（C）CD4⁺和CD8⁺ Tem细胞比例与肿瘤体积相关性。

图8 为HPV特异性细胞免疫反应及骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）和巨噬细胞的比例。实验结束后，分离脾脏细胞。（A）脾脏细胞用HPV多肽刺激过夜，通过流式细胞术检测HPV特异性细胞免疫反应。（B）CD8⁺ IFN-γ⁺ 细胞比例与肿瘤体积相关性。（C）MDSCs（CD11b⁺Gr-1⁺）及巨噬细胞（CD11b⁺Gr-1^-）在肿瘤小鼠脾脏中的比例。（D）MDSCs比例与肿瘤体积相关性。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，治疗组与不治疗组比较得出。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

阿魏菇多糖的提取纯化

称取100g阿魏菇冻干粉，用1 L 95%乙醇浸提2小时去脂，5000 rpm/min离心10 min收集沉淀，沉淀用1 L去离子水重悬，60℃水浴2小时，超声20min助溶，6000 rpm/min离心15 min，收集上清，滤渣反复浸提4次后，合并上清液，在60℃水浴温度下真空旋转浓缩至1/10体积后，用Sevage试剂法：按浓缩液：Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1）=3:1比例混合，磁力搅拌30min后，6000rpm/min 离心10 min，保留上清，反复脱蛋白6次，所得上清加无水乙醇至终浓度为80%， 4℃过夜，6000rpm/min离心10 min，沉淀用无水乙醇，丙酮各洗涤一次，自然干燥3小时后得粗多糖。

称取360 mg粗多糖重新溶解于去离子水中（浓度约5 mg/ml），经0.22 μm超滤杯过滤后，真空旋转浓缩至终浓度约为20 mg/ml，过DEAE-52纤维素柱层析（2.6×66 cm），依次用去离子水、0.05 M、0.1 M和0.3 M NaCl溶液阶段洗脱柱子，流速为1.0 ml/min，5 ml/tube收集洗脱液，采用苯酚硫酸法在490 nm处测定多糖含量，绘制洗脱曲线（图1A）。按照洗脱峰收集合并组分，透析冷冻干燥，分别命名为PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1及PFPS-0.3，多糖纯度分别为59%、96%、70%及35%。

阿魏菇多糖刺激DC成熟活性检测

以不同浓度的纯化的PFPS处理体外培养的不成熟DC，12小时后通过流式细胞术检测DC表面CD40的表达（图1B）。可以看出，PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1均具有刺激DC成熟的活性，其中盐洗脱的多糖刺激DC成熟的活性显著高于水洗脱的多糖。

PFPS-0.05的分子量测定

基于多糖纯度及刺激DC成熟活性，我们选取0.05 M NaCl洗脱的PFPS-0.05进行进一步的分析。PFPS-0.05经0.22 μm滤膜过滤后，过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR，以去离子水进行洗脱，3 ml/tube收集洗脱液，流速为0.5 ml/min, 苯酚硫酸法测定吸光值，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，得到一个纯洗脱峰（图2A）。我们采用高效凝胶渗透色谱法（high performance gel-permeation chromatography）检测了PFPS-0.05的均一度及分子量检测（图2B）。移动相为0.71%的硫酸钠，流动速率为0.5 ml/min。结果显示，PFPS-0.05为成分均一的多糖。以分子量为9.75, 36.8, 135.35, 300.6 and 2000 kDa的右旋糖苷标准品制备标准曲线，计算PFPS-0.05的分子量大约为1500～1600 kDa。

PFPS-0.05促进DC成熟及细胞因子表达

以不同浓度（10、50和100 mg/ml）的PFPS-0.05刺激体外培养的不成熟DC，12小时后收集细胞，采用流式细胞术检测DC表面CD40、CD80、CD86和MHC II分子的表达。如图3A所示，PFPS-0.05显著提高了CD40及CD86的表达水平，并呈剂量依赖性。CD80及MHC II的表达水平也有一定的提高。收集上述细胞培养上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定白细胞介素-12（IL-12）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。如图3B所示，PFPS-0.05显著增加了IL-12及TNF-α的分泌水平，水平与阳性对照细菌脂多糖（LPS）相当。结果显示，PFPS-0.05促进了DC的成熟及细胞因子表达。

PFPS-0.05通过TLR4信号通路刺激DC成熟

为了验证PFPS-0.05是否通过TLR4信号通路刺激DC成熟，我们用TLR4抑制剂（TAK-242）对DC进行预处理，然后用不同浓度的PFPS-0.05或LPS刺激。12小时后检测CD40表达及细胞因子分泌。如图4A&B所示，TAK-242预处理显著抑制了PFPS-0.05及LPS诱导的CD40的表达及IL-12和TNF-α的分泌水平，结果暗示PFPS-0.05通过TLR4信号通路刺激了DC成熟。

我们进一步检测了TLR4信号通路下游分子的活性状态。50 mg/ml的PFPS-0.05处理后，在不同时间点收集细胞，提取细胞质及细胞核蛋白，通过Western blot检测TLR4信号通路分子的磷酸化水平。如图5所示，JNK和ERK在10 min时被磷酸化，30 min时磷酸化水平开始降低。p38也在10 min时被磷酸化，并持续到了240 min。我们也观察到，在30 min时被磷酸化并且持续到了240 min。结果显示，PFPS-0.05激活了TLR4下游MAPK及信号通路。

PFPS-0.05刺激的DCs与人乳头瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DCs）抑制了肿瘤的生长

为了检测PFPS-0.05刺激DC的抗肿瘤效果，我们用TC-1细胞建立了小鼠肿瘤模型。肿瘤模型建立后，治疗分为早期治疗及晚期治疗，早期治疗组在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs early），晚期治疗组在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs late）。对照组分别为在第5天及第12天注射PFPS+DCs，或不治疗组。每组8只小鼠，每隔一天测量一次肿瘤大小。对照组在27天时死了一只小鼠，肿瘤体积为3097 mm³，PFPS+DCs组在17天时死了一只小鼠，肿瘤体积为242 mm³，HPV+PFPS+DCs late组在31天时死了一只小鼠，肿瘤体积为1742 mm³，而HPV+PFPS+DCs early组所有小鼠均存活到了实验结束。如图6A所示，与对照组相比，早期治疗组和晚期治疗组均显著抑制了肿瘤的生长，抑制率分别为93%和62%。实验结束后，处死肿瘤小鼠，分离肿瘤，拍照并称重。如图6B所示，早期治疗组和晚期治疗组的肿瘤显著小于对照组，肿瘤重量也显著低于对照组。

HPV+PFPS+DCs改变了T细胞的数量及活性状态，诱导产生了HPV特异性的细胞免疫反应，并且降低了骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）的比例

采用流式细胞术，检测了肿瘤小鼠脾脏中T细胞的数量及活性状态，HPV特异性的细胞免疫反应及MDSCs的比例。如图7A&B所示，与对照组相比，早期治疗组和晚期治疗组小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例显著上升。以CD44和CD62L为标志物，检测T细胞活性状态。与对照组相比，HPV+PFPS+DCs early组CD4⁺ Tem（效应记忆细胞），CD8⁺ Tem和Tcm（中央记忆细胞）细胞的比例显著上升。进而发现，CD4⁺和CD8⁺ Tem细胞的比例与肿瘤体积呈显著负相关性（图7C）。

我们接下来检测了HPV特异性的细胞免疫反应，HPV+PFPS+DCs early及late在一定程度上增加了CD4⁺ T细胞反应，但显著增加了CD8⁺ T细胞反应（图8A），并与肿瘤体积呈显著负相关性（图8B）。与对照组相比，HPV+PFPS+DCs early显著降低了MDSCs的比例，但没有改变巨噬细胞的比例（图8C）。我们也观察到MDSCs的比例与肿瘤体积呈显著正相关性（图8D）。结果显示，HPV+PFPS+DCs增强了T细胞的活性状态，诱导产生了HPV特异性的细胞免疫反应，降低了MDSCs的比例，从而抑制了肿瘤的生长。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。