具有高效药物负载性能的聚合物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及小分子药物负载和递送领域，并涉及氨基酸技术领域，尤其涉及具有高效药物负载性能的聚合物及其制备方法与应用。

背景技术：

高分子纳米药物是指利用纳米技术，将小分子药物包裹于自组装的高分子载体内部，制备出尺度为纳米级的药物输送系统。高分子载体通常是双亲性的聚合物，其可以形成疏水内核用于包裹疏水药物，亲水的外壳可以提高载药胶束的水溶性和体内稳定性。高分子纳米药物可以延长药物血液循环时间，通过肿瘤部位“增强的渗透和滞留效应”（epr效应）实现被动靶向，同时可以利用载体的设计实现药物的靶向输送和控制释放，最终提高药物的疗效并降低毒性。目前已有基于聚酯或聚氨基酸等高分子材料的纳米药物上市（genexol-pm）或正处于临床研究阶段（nk105、nc6004、ct-2103）。而且国内关于高分子纳米药物的开发也有大量的相关报道，例如，一种聚氨基酸材料，可以包裹阿霉素并提高其稳定性；一种高分子可以复合小分子顺铂，得到的复合物具有良好的溶解性和生物相容性。

高分子纳米药物近年来虽然发展迅速，但是其成功的临床转化仍然受制于纳米药物本身的各种性质，如载药量、包封率、溶解性和释放性能等。目前，很多高分子纳米药物都是利用纳米沉淀等自组装方法制备。然而，高分子材料通过这些方法通常很难得到很高的载药量和包封率。其中，药物之间过强的相互作用所诱导的聚集是造成上述结果的一个主要原因。通过合理的结构设计降低药物分子之间的相互作用或提高药物和高分子载体之间的相互作用可能有助于实现高效的药物负载。有文献报道了通过小分子二聚体降低药物分子间快速聚集行为，并用于实现了超高的药物担载，然而这种方法合成步骤复杂，在临床应用时有很大的困难。

技术实现要素：

本发明提供了一种高分子材料，尤其是该高分子材料侧链含有苯硼酸基团，可以通过配位作用实现对含有氨基药物的高效担载，并且设计的结构具有双氧水响应性，可以实现负载药物特异性释放。

本发明采用如下技术方案：

一种聚合物，具有式（i）所示的结构；

式（i）中，r1选自氢、烷基或取代烷基；

r2选自-nh-或-r5(ch2)rnh-，其中，r5为-o-、-oconh-、-oco-、-nhcoo-或-nhco-，1≤r≤10；

r3选自氢或以下基团：

r3^`选自氢或以下基团：

r4选自氢或疏水基团；

20≤n≤500；5≤m≤200。

上述技术方案中，所述烷基为c1~c40的烷基；所述取代烷基中，取代基为巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、rgd类短肽、lhrh类短肽或叶酸；所述疏水基团为c4~c20的烷基、苯甲基、胆固醇甲酰基、乙酰基、胆酸基或脱氧胆酸基。

本发明提供的基于聚氨基酸的高分子材料中，优选的，含有苯硼酸结构的聚氨基酸片段在总的聚氨基酸中比例不低于20%；更优选的，苯硼酸结构的基团比例在40%～60%之间；该比例太低或者太高可能会影响载药性能或材料溶解性能。

优选的，40≤n≤250；m为主链中天冬氨酸片段的聚合度，优选的，10≤m≤50。

优选的技术方案中，r1为甲基；r2为-nh-；r4为乙酰基，此时聚合物具有式（i-a）的结构：

r3选自氢或以下基团：

r3^`选自氢或以下基团：

。

本发明设计的基于氨基酸的高聚物，通过在该高分子的侧基引入苯硼酸基团，使其可以和含有氨基的药物通过配位作用增强载体和药物在自组装过程中的稳定性，减少小分子药物的聚集，以实现高效的药物负载；尤其优选设计的苯硼酸基团具有双氧水响应性，可以实现载药体系在肿瘤部位特异性释放；解决了当前高分子材料在制备纳米药物过程中存在的药物团聚和载药量低的问题。

本发明还提供一种具有式（ⅰ）结构的聚合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）具有式（ii）或式（iii）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的聚合物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐；

（2）将所述带有保护基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有式（iv）结构的共聚物，为聚（乙二醇）-b-聚[（n-2-羟乙基）-天冬酰胺]共聚物；

（3）将所述具有式（iv）结构的共聚物和具有式（v）结构的小分子反应，得到具有式（vi）结构的中间体；最后，具有式（vi）结构的中间体经过透析得到具有式（ⅰ）结构的聚合物；具体为具有式（vi）结构的中间体在透析过程中水解最终得到式（ⅰ）结构的聚合物。

本发明还提供一种聚合物冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

（1）具有式（ii）或式（iii）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的聚合物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐；

（2）将所述带有保护基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有式（iv）结构的共聚物，为聚（乙二醇）-b-聚[（n-2-羟乙基）-天冬酰胺]共聚物；

（3）将所述具有式（iv）结构的共聚物和具有式（v）结构的小分子反应，得到具有式（vi）结构的中间体；最后，具有式（vi）结构的中间体经过透析、冷冻干燥得到聚合物冻干粉；具体为具有式（vi）结构的中间体在透析过程中水解最终得到式（ⅰ）结构的聚合物。

本发明还提供了中间体的制备方法，包括如下步骤：

（1）具有式（ii）或式（iii）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的聚合物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐；聚合反应完成后，加入乙酸酐、乙酰氯、胆固醇甲酰氯等封端（r4），优选用乙酸酐进行封端；

（2）将所述带有保护基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有式（iv）结构的共聚物，为聚（乙二醇）-b-聚[（n-2-羟乙基）-天冬酰胺]共聚物；

（3）将所述具有式（iv）结构的共聚物和具有式（v）结构的小分子反应，得到具有式（vi）结构的中间体。

本发明涉及的化合物结构如下：

式（iv）

式（v）

r6为氢或者以下基团：

r6^`为氢或者以下基团：

上述技术方案中，步骤（1）中，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、或n,n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷混合物；所述反应优选在无水条件下进行。

上述技术方案中，步骤（3）中，具有式（iv）结构的共聚物和具有式（v）结构的小分子反应在溶剂中进行，所述溶剂为n,n-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜；所述反应优选在无水条件下进行；优选的，所述反应在有机碱（如4-二甲氨基吡啶）存在下进行。

本发明还提供一种载药复合物胶束，包括具有式（ⅰ）结构的聚合物和活性药物，所述活性药物优选为带有氨基的药物，如阿霉素、表阿霉素、伊立替康等。

本发明还提供上述载药复合物胶束的制备方法，为纳米沉淀法，主要包括以下步骤：活性药物与上述具有式（i）结构的聚合物溶解在n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃等有机溶剂中，然后滴入水性介质中，然后在水溶液中透析除去有机溶剂最终形成载药复合物胶束。优选的，所述具有式（i）结构的聚合物与活性药物的质量比为（1～20）:1，本发明得到的载药胶束的包封率不低于80%。

本发明还提供了上述具有式（i）结构的聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用，或者作为活性药物载体的应用。

本发明还提供了上述载药的复合物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述中间体的制备方法制备的中间体以及所述中间体在制备抗肿瘤药物中的应用，或者在制备活性药物载体中的应用。

综上所述，本发明提供了一种具有优良载药性能的高分子材料，该高分子为具有式（i）所示的结构的聚合物，可以用于生物材料尤其是药物递送领域。该高分子以聚（乙二醇）-b-聚[（n-2-羟乙基）-天冬酰胺]为基础，优选通过苯硼酸修饰得到。高分子主体具有良好生物相容性，其侧链的苯硼酸基团可以和含有氨基的药物通过配位作用达到高效的药物负载。本发明初步研究结果表明该材料对临床上常用的化疗药物如阿霉素、表阿霉素、伊立替康等具有超高的载药量（大于50%）和接近100%的包封率，而且药物释放具有肿瘤微环境的响应性。该高分子制备简单，便于推广，在生物材料尤其是纳米药物领域中有巨大的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的带有保护基的嵌段共聚物mpeg113-b-pbla21以氘代三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1制备的式（iv）结构的嵌段共聚物mpeg113-b-phea21以氘代三氟乙酸和氘代水作为混合溶剂（v:v=1:9）时的核磁共振氢谱图；

图3为实施例2制备的式（v）结构的小分子以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图4为实施例3制备的式（vi）结构的前体材料以氘代二甲基亚砜作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图5为实施例3制备的式（i）结构的高分子以氘代二甲基亚砜作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图6为实施例4中式（i）结构的高分子负载阿霉素胶束的载药量和包封率；

图7为实施例4制备的载药量为33.4%的胶束粒径分布；

图8为实施例4制备的载药量为33.4%的胶束在不同的双氧水浓度下药物释放曲线；

图9为实施例3制备的式（i）结构的高分子对nih/3t3细胞的毒性考察结果图；

图10为实施例4制备的阿霉素载药量为33.4%的胶束对hela细胞增值抑制效果。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明式（i）的聚合物制备方法按照下面的步骤：

在无水n,n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷混合溶剂中（v:v为1:9），利用具有式（ii）、式（iii）的聚乙二醇中的伯胺基引发γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐聚合，在反应完毕后可加入过量的乙酸酐封端，得到带有保护基的聚合物，然后在n,n-二甲基甲酰胺中和乙醇胺反应，得到式（iv）结构的共聚物。

在制备带有保护基的聚合物过程中，所述具有式（ii）或式（iii）结构的化合物与所述γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐单体的摩尔比优选为1：5~200，更优选为1：10~50；所述反应的温度优选为20℃~30℃；所述反应的时间优选为48h~96h。

上述带有保护基的聚合物与乙醇胺反应过程中，保护基在有机碱的作用下脱除并和进一步和乙醇胺作用，得到具有式（iv）结构的共聚物。其中所述反应的温度优选为30℃~40℃，所述搅拌反应的时间优选为12h~24h，所述反应的溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺。反应结束后，用过量乙醚沉降，经过滤、洗涤、干燥后得到式（iv）结构的共聚物。

为了得到式（iv）结构的共聚物冻干粉末，将上述沉降产物用n,n-二甲基甲酰胺溶解，在纯水中透析24h~72h，透析过程中换水6~15次，冷冻干燥，得到具有式（iv）结构的共聚物冻干粉。

式（v）结构的小分子的合成按照如下所示的方法进行。简略的，将4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯和n,n'-羰基二咪唑混合于无水二氯甲烷中，反应结束后充分水洗干燥，抽干溶剂得到式（v）结构的小分子。

式（iv）结构的共聚物和（v）结构的小分子反应，得到（vi）结构的中间体。反应优选在无水n,n-二甲基甲酰胺中进行，加入4-二甲氨基吡啶（dmap）作为反应的催化剂。所述搅拌反应的温度优选为40℃~60℃。所述搅拌反应的时间优选为48h~96h。反应完毕，得到（vi）结构的中间体。该中间体不需要进一步纯化，可以直接加蒸馏水透析，在此过程中频哪醇被水解脱除，冻干后得到式（i）结构的高分子。

本发明在制备具有式（i）结构的高分子过程中，以γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐为原料，对这种氨基酸-n-内羧酸酐来源没有特殊限制，可以参照以下方法制备：

l-天冬氨酸和苯甲醇在浓硫酸的作用下发生反应，经后处理得到γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯，所述γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯与双（三氯甲基）碳酸酯（三光气）反应，得到γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐。

上述涉及的化合物结构如下：

式（ii）

式（iii）

式（iv）

式（v）

r6为氢或者以下基团：

r6^`为氢或者以下基团：

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚合物及其载药复合物胶束制备方法进行详细描述，但是本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

向干燥的反应瓶内加入5.00g数均分子量为5000的具有式（ii）结构的聚乙二醇单甲醚，与80ml无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20ml干燥的二氯甲烷中，得到第一溶液；将5.50gγ-苯甲基-l-天冬氨酸酯-n-内羧酸酐溶解于5ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺和50ml二氯甲烷的混合溶剂中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48h；然后加入10ml乙酸酐继续反应24h。反应结束后，减压抽去大部分溶剂，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到带有保护基的嵌段共聚物，为γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯，保护基为苄基。对得到的带保护基的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图1，结果表明γ-苯甲基-l-天冬氨酸酯的聚合度为21，将该嵌段共聚物记为mpeg113-b-pbla21，其结构如下：

取5.00g得到的mpeg113-b-pbla21在35℃下溶解于45ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺中，加入4ml乙醇胺，搅拌反应24h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用n,n-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，图2为实施例1制备的嵌段共聚物以氘代三氟乙酸和氘代水作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式（iv）的结构，其中，r1是甲基；r2为-nh-；r3为氢；r4是乙酰基；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n=113，m=21，记为mpeg113-b-phea21，其具体结构如下：

。

实施例2

在一干燥的圆底烧瓶中，加入7.2g4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯和10.3g羰基二咪唑，加入50ml无水二氯甲烷溶解，室温反应12h。反应结束后向体系中加入500ml乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水和饱和食盐水洗涤有机层，随后将有机层用无水mgso4干燥过夜。减压除去有机溶剂最后得到7.6g式（v）结构的小分子。对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，图3为实施例2制备的小分子以氘代二甲基亚砜为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明成功合成该小分子，其具体结构如下：

式（v）。

实施例3

为了得到式（i）的高分子材料，向干燥的反应瓶内加入2.00g实施例1中制备的具有式（iv）结构的嵌段共聚物、1.0g式（v）结构的小分子和dmap（412mg），抽真空12h。然后加入10ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺溶解，在50℃、氮气保护条件下搅拌反应12h。反应结束后，用过量的乙醚进行沉降，洗涤，抽滤，干燥后，得到中间体。对得到的中间体聚合物进行核磁共振分析，结果参见图4，结果表明，苯硼酸基团成功接枝到高分子上。得到的中间体具有式（vi）结构，其中，r1是甲基；r2为-nh-；r6为苯硼酸基团，苯硼酸基团所占的比例为48%；r4是乙酰基；得到的中间体具体结构如下：

将上述中间体溶解在水中，后纯水中透析72h，透析过程中换水10次，得到具有式（i-a）结构的聚合物，最后冷冻干燥得到冻干粉，对得到的材料进行核磁共振分析（图5），结果表明频哪醇被完全水解。

r3为以下基团：

n=113，m=21。

实施例4

将实施例3中得到的式（i-a）结构的聚合物20mg与不同质量（4、10、13.3、或20mg）的盐酸阿霉素溶于0.5mln,n-二甲基甲酰胺，在溶解过程中加入当量为盐酸阿霉素1.5倍的三乙胺，在37℃的摇床中充分混合3小时，而后缓慢滴入快速搅拌的超纯水中（2ml），滴加完毕后继续搅拌3h，纯水中透析12h，透析过程中换水5次，最后通过冷冻干燥得到负载阿霉素的复合胶束。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例4得到的载药胶束内阿霉素的含量，通过以下公式计算胶束中的阿霉素的担载量（dlc）和包封率（dle）：

dlc=(胶束中药物的质量/胶束的总质量)×100%

dle=(胶束中药物的质量/投入药物的质量)×100%

图6是为实施例4制备的载药胶束的载药量和包封率的汇总，结果显示，式（i）结构的高分子几乎可以定量负载阿霉素，包封率接近100%。

将不同载药量的胶束复溶于pbs（ph=7.4），浓度到0.1mg/ml，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学粒径，结果参见图7，图7为实施例4制备的载药量为33.4%的载药胶束的流体力学分布图，结果表明胶束粒径在18nm~48nm之间，分布均匀。其他不同载药量的胶束粒径也在100nm以下，且分布较窄。

实施例5

将实施例3中得到的式（i-a）结构的聚合物20mg与不同质量（4、10、13.3、或20mg）的盐酸表阿霉素溶于0.5mln,n-二甲基甲酰胺，在溶解过程中加入当量为盐酸表阿霉素1.5倍的三乙胺，在37℃的摇床中充分混合3小时，而后缓慢滴入快速搅拌的超纯水中（2ml），滴加完毕后继续搅拌3h，纯水中透析12h，透析过程中换水5次，最后通过冷冻干燥得到负载表阿霉素的复合胶束。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例5得到的载药胶束内表阿霉素的含量，载药量和包封率计算公式参考实施例4。结果显示，式（i）结构的高分子几乎可以定量负载表阿霉素，药物的包封率接近100%。

将不同载药量的胶束复溶于pbs（ph=7.4），浓度到0.1mg/ml，利用动态光散射分析，结果表明所有载药胶束流体力学粒径均在100nm以下，且分布较窄。

实施例6

将实施例3中得到的式（i-a）结构的聚合物20mg与不同质量（4、10、13.3、或20mg）的盐酸伊立替康溶于0.5mln,n-二甲基甲酰胺，在溶解过程中加入当量为盐酸伊立替康1.5倍的三乙胺，在37℃的摇床中充分混合3小时，而后缓慢滴入快速搅拌的超纯水中（2ml），滴加完毕后继续搅拌3h，纯水中透析12h，透析过程中换水5次，最后通过冷冻干燥得到负载伊立替康的复合胶束。

利用紫外-可见光谱在360nm的吸收测定实施例6得到的载药胶束内伊立替康的含量，载药量和包封率计算公式参考实施例4。结果显示，式（i）结构的高分子几乎可以定量负载伊立替康，药物的包封率大于90%。

将不同载药量的胶束复溶于pbs（ph=7.4），浓度到0.1mg/ml，利用动态光散射分析，结果表明所有载药胶束流体力学粒径均在100nm以下，且分布较窄。

实施例7

取5mg的实施例4制备的载药量为33.4%的复合胶束溶解在5ml0.01m的ph值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，其中含有0.5%的吐温80，然后转移至截留分子量为3500的透析袋，用45ml相应的缓冲液进行透析，透析在温度为37℃、转速为100的恒温振荡箱中进行，每隔特定时间取样4ml，并补充相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定释放液的浓度，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图8所示。释放结果表明载药胶束在正常的生理条件下药物释放缓慢，而在100μm的双氧水条件下药物可以很快释放。由于肿瘤组织和细胞内双氧水的含量比正常组织高，这样的结果表明载药胶束释放具有肿瘤组织微环境的响应性，在体内应用时有更好的特异性。

实施例8

采用mtt细胞毒性试验对制备的聚合物材料毒性进行考察，具体步骤如下：

1、收集对数期nih/3t3细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μl（~7000个）细胞；在37℃，饱和湿度，5%co2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例3制备的式（i-a）结构的聚合物稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μl，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5%co2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐（mtt）溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μl二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度下的细胞存活率。

图9为实施例3制备的式（i-a）结构的聚合物对nih/3t3细胞毒性考察结果图，结果表明在各浓度下细胞存活率均在80%以上，证明本发明制备的高分子材料具有良好的安全性。

实施例9

1、收集对数期hela人宫颈癌细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μl（~7000个）细胞；在37℃，饱和湿度，5%co2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例4制备的载药量为33.4%的载药胶束稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μl，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5%co2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μl二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的高分子的细胞存活率。

图10为实施例4制备的载药量为33.4%的载药胶束对hela细胞毒性考察结果图，对照组为阿霉素纯药。结果表明，制备的载药胶束具有很好的肿瘤细胞增殖抑制效果。

本发明通过对高分子的合理修饰提高药物和小分子之间的相互作用，增强载体和药物在自组装过程中的稳定性，减少小分子药物的聚集，以实现高效的药物负载，尤其是这样的设计不需要复杂的合成步骤，在实用中更有优势。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。