一种抗粉红单端孢肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种多肽，尤其涉及一种抗粉红单端孢（trichotheciumroseum）肽及其制备方法和应用。

背景技术：

粉红单端孢（t.roseum）是一种在果蔬采后病害中不容忽视的病原真菌，该病原真菌可在采后贮运期间通过伤口进入产品体内，进而引起腐烂。据报道，发达国家有15%~25%的新鲜果蔬损失于采后的腐烂，而在发展中国家，由于缺乏贮运冷藏设备，果蔬腐烂损失率高达20%~50%。通常采用化学杀菌剂来有效控制病害，但存在化学杀菌剂残留、环境污染和病原物产生抗药性等问题。因此，亟需寻找新的、更为安全有效的方法来控制采后病害。

抗菌肽是一种具有生物活性的小分子肽，是生物防御系统的重要组成部分。抗菌肽来源广泛，目前已经从昆虫、哺乳动物、两栖动物、植物、细菌、海洋生物等中发现的抗菌肽大约有1598种。这些抗菌肽具有广谱抗菌作用，并对正常的真核细胞、哺乳动物细胞无毒性或低毒性，因此，抗菌肽有望成为新一代的抗菌药物，并且在化妆品、生物农药、动物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等方面具有广阔的应用前景。

抗菌肽根据其氨基酸组成及结构特征可以分为：⑴具有α-螺旋结构抗菌肽；⑵具有β-折叠结构抗菌肽；⑶富含半胱氨酸的多肽；⑷富含组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸的多肽；⑸由稀有的重组氨基酸组成的多肽。其中，富含甘氨酸的抗菌肽具有低溶血活性，还可以抑制革兰氏阴性菌、阳性菌及真菌的生长。例如，双翅肽(diptericins)的c端富含甘氨酸残基，可抑制革兰氏阴性菌生长；有学者从解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）分离出富含甘氨酸的肽yd1，发现该抗菌肽在最小抑菌浓度为8~64μg/ml时能抑制革兰氏阳性及阴性菌。但是由于抗菌肽具有低稳定性，生产成本高等因素限制了抗菌肽的广泛使用，因此研究者致力于研发具有高稳定性低毒性的新型抗菌肽。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性好、抗菌活性高的抗粉红单端孢肽。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该抗粉红单端孢肽的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供该抗粉红单端孢肽的应用。

为解决上述问题，本发明所述的一种抗粉红单端孢肽，其特征在于：该肽的氨基酸序列为gly-gly-ser-gly-gly-gly-ser-ser-gly-gly-ser-ile-gly-gly-arg。

如上所述的一种抗粉红单端孢肽的制备方法，包括以下步骤：

⑴挑取短小芽孢杆菌（b.pumilus）菌株纯培养物1~2环接种于lb液体培养基上，于37℃、180r/min条件下振荡培养2~3d后，得到发酵液，该发酵液以10000r/min的速率离心20min，得到上清液；

所述短小芽孢杆菌（b.pumilus）在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmccno.15031（保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月07日）；

⑵将所述上清液依次经大孔吸附树脂层析、尺寸排阻层析和制备型反向高效液相层析，得到洗脱液；

⑶所述洗脱液按常规方式经超滤浓缩、干燥、冻干后，即得纯化的抗粉红单端孢肽。

所述步骤⑵中大孔吸附树脂层析的条件是指采用ab-8大孔吸附树脂，以2bv/h的速度上样，并采用体积浓度为60~70%的乙醇溶液洗脱。

所述步骤⑵中尺寸排阻层析的条件是指采用葡聚糖凝胶g-100作为填料，并采用浓度为15~25mmol/l且ph=6~7的磷酸盐缓冲溶液洗脱。

所述步骤⑵中制备型反向高效液相层析的条件是指采用c18柱，以样品浓度为5mg/ml、上样量为200µl、洗脱流速为1ml/min、柱温为25℃的条件进行线性洗脱；洗脱a相为含0.1%tfa（三氟乙酸）水溶液，b相为含0.1%tfa（三氟乙酸）乙腈溶液；洗脱程序为：a相：10%~5%，0~5min；5%~0%，5~10min；0%~10%，10~11min；10%，11~30min。

如上所述的一种抗粉红单端孢肽的应用，其特征在于：该抗粉红单端孢肽作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过由大孔吸附树脂层析、尺寸排阻层析和制备型反向高效液相层析三种层析组成的层析系统，分别去除发酵液中与目的抗粉红单端孢肽具有电荷差异、极性差异、大小差异的杂蛋白等其他物质，从而达到纯化的效果。

2、本发明经纯化后的抗粉红单端孢肽通过结合lc-ms/ms，从而能够获得抗菌肽的氨基酸序列。

采用qexactivemassspectrometer(thermofisher)对制备得到的抗粉红单端孢肽进行分析检测，其中：色谱柱为300μmi.d.x5mm,packedwithacclaimpepmaprplcc18,5μm,100å,nanoviper（购自thermo公司）；流动相a：0.1%甲酸，2%acn；流动相b：0.1%甲酸，80%acn；柱温：25℃，检测波长：280nm；最大压力：200bar；时间：78min；流速：300nl/min；分析梯度见表1，检测结果见图1。

表1lc分析梯度

a)一级质谱参数：resolution：70,000;agctarget：3e6;

maximumit：40ms;scanrange：350to1800m/z.

b)二级质谱参数：resolution：17,500;agctarget：1e5;maximumit：60ms;topn：20;nce/steppednce：27

检测结果见图2。

结果表明：本发明抗粉红单端孢肽的氨基酸序列分别为：gly-gly-ser-gly-gly-gly-ser-ser-gly-gly-ser-ile-gly-gly-arg。

3、本发明通过利用抗粉红单端孢肽的特点和不同层析方法之间的特性差异，不仅科学合理地对抗粉红单端孢肽进行了分离纯化，还为抗粉红单端孢肽的氨基酸序列检测提供了依据。

4、本发明经抗菌试验、稳定性试验显示，具有稳定性好、抗菌活性高的特点。

【对照例】以文献（体内和体外条件下不同浓度硅酸钠和对应ph抑制粉红单端孢效果比较）中的硅酸钠为对照，将硅酸钠浓度处理成20、40、60、80、100mmol/l，观察其对粉红单端孢菌丝生长的影响。

结果表明：当硅酸钠浓度达到20mmol/l时，其抑制效果开始显现，且作用明显。

【抗菌试验】

采用标准琼脂孔穴扩散法分别对本发明抗粉红单端孢肽进行抗菌试验。对照例的硅酸钠采用平板对峙法，将灭菌后pda培养基冷却至温度60℃，分别加入不同质量的硅酸钠，使得硅酸钠的终浓度为20、40、60、80、100mmol/l，充分溶解后，倒板，然后将直径为5mm的粉红单端孢菌饼放置平板中央，28℃培养5d。

分别将本发明抗粉红单端孢肽和对照例的硅酸钠配制成相同浓度的溶液，以粉红单端孢（t.roseum）为实验菌株，将实验菌株孢子悬浮液放置在平板中央，用灭过菌的打孔器（直径5mm）在距孢子悬浮液2cm处打孔，孔中分别滴加各抗菌肽和硅酸钠溶液，在28℃培养5d，观察抑菌圈大小，结果见表2。

表2各抗菌肽的抗菌活性

结果表明：当抗粉红单端孢肽浓度为1µg/ml时，其抑制粉红单端孢（t.roseum）效果开始显现，且作用明显。

【稳定性试验】

将本发明抗粉红单端孢肽在4℃下保存30天，然后按照进行抗菌试验，结果见表3。

表3各抗菌肽的稳定性

结果表明：该抗粉红单端孢肽具有强耐酸碱性和耐热（80℃以下）稳定性。此外，抗粉红单端孢肽对木瓜蛋白酶有良好的耐受性，对胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受性较弱。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明抗粉红单端孢肽的制备型rp-hplc图。

图2为本发明抗粉红单端孢肽的maldi-tof/ms图。

具体实施方式

一种抗粉红单端孢肽，该肽的氨基酸序列为gly-gly-ser-gly-gly-gly-ser-ser-gly-gly-ser-ile-gly-gly-arg。

该抗粉红单端孢肽的制备方法，包括以下步骤：

⑴挑取短小芽孢杆菌（b.pumilus；短小芽孢杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmccno.15031，保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月07日）菌株纯培养物1~2环接种于lb液体培养基上，于37℃、180r/min条件下振荡培养2~3d后，得到发酵液，该发酵液以10000r/min的速率离心20min，得到上清液。

⑵将上清液依次经大孔吸附树脂层析、尺寸排阻层析和制备型反向高效液相层析，得到洗脱液。具体过程如下：

ab-8大孔吸附树脂经无水乙醇平衡后，上清液以2bv/h的速度上样，并采用体积浓度为60~70%的乙醇溶液进行洗脱（也可以采用不同的乙醇浓度作为洗脱液进行梯度洗脱），每2min收集一次洗脱液并采用标准琼脂孔穴扩散法进行抑菌试验，收集具有抑菌圈的洗脱液a。

尺寸排阻层析以葡聚糖凝胶g-100作为填料，先采用ph6.8的磷酸盐缓冲溶液平衡，再采用浓度为15~25mmol/l且ph=6~7的磷酸盐缓冲溶液对洗脱液a进行洗脱，每4min收集一次洗脱液并进行抑菌试验，收集具有抑菌圈的洗脱液b。

采用sunfire^tmprepc18柱（10μm,10ｘ150mm，美国waters公司）对洗脱液b进行制备型反向高效液相层析。在样品浓度为5mg/ml、上样量为200µl、洗脱流速为1ml/min、柱温为25℃的条件下进行线性洗脱。洗脱a相为含0.1%tfa（三氟乙酸）水溶液，b相为含0.1%tfa（三氟乙酸）乙腈溶液；洗脱程序为：a相：10%~5%，0~5min；5%~0%，5~10min；0%~10%，10~11min；10%，11~30min。洗脱后收集洗脱液。

⑶洗脱液按常规方式经超滤浓缩、干燥、冻干后，即得纯化的抗粉红单端孢肽。

另外，本发明抗粉红单端孢肽可以通过化学合成得到，还可以根据该肽的氨基酸序列构建得到上述抗粉红单端孢肽表达载体，进而得到含有上述抗粉红单端孢肽表达载体的菌株并对其进行发酵。

该抗粉红单端孢肽的应用是指：该抗粉红单端孢肽作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。

应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域的人可以提出各种改进和变化，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质和范围以及所附的权利要求范围内。