一种野百合多糖的提取方法与流程

本发明涉及一种植物成分提取方法，具体地说，涉及一种野百合多糖的提取方法。

背景技术：

百合(Lilium)是单子叶植物亚纲百合科草本植物，因其鳞茎由许多鳞片组成，故被命名为“百合”。其鳞茎含有大量的淀粉、蛋白质、脂肪、钙、铁等多种营养素，有些还能食用；其花、鳞茎常常被作为药材，有清肺止咳、舒心养神、美容养颜等多种作用。多糖、生物碱、皂苷和黄酮等是百合中的抑菌活性物质，抗癌、抗过敏及提高免疫力，是它们的药用价值。野百合(Lilium brownii)主要生长于山脊中下部坡度较大的草丛，其鳞茎可食，亦作药用，有润肺止咳、清热、安神、利尿等作用，园艺上极具观赏价值。

百合鳞茎多糖含量丰富，药理研究证明，其具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖和清除自由基等药理作用。百合多糖的提取方法，目前多用热水浸提、超声波辅助提取和酶法提取等，其中应用最多的是热水浸提法，而利用响应面分析法与正交试验法对百合多糖进行水浸提工艺的优化还鲜见报道。

响应面分析法是利用回归方程将多个因子实验中因素之间的相互作用关系用多项式拟合，然后研究函数的响应面和等高线，分析因素与响应面之间、两个因素之间的交互关系。其优点是试验的时间短、得到的回归方程准确度高及能反应几种因素间交互作用等，现在已被广泛应用于很多食品行业。正交试验法是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种野百合多糖的提取方法。该方法根据单因素试验结果，运用响应面分析法和正交试验法进一步优化百合多糖的提取工艺，并利用两种优化工艺分别提取不同产地百合的多糖，比较多糖得率，以期为商洛百合资源的进一步开发利用提供理论依据。

其具体技术方案为：

一种野百合多糖的提取方法，包括以下步骤：

取百合粉末2g，溶于适量水中；热水浸提一定时间后，用纱布过滤2次，合并2次过滤的滤液，减压浓缩至原体积1/4；加入3倍体积的95％乙醇进行醇析，室温下放置12h，4000r/min离心15min；沉淀再次溶解，用1/4体积Sevag试剂脱蛋白，静置12h，4000r/min离心15min，得百合多糖粗提取液。

优选地，提取时间100min-150min，提取温度76℃-80℃，固液比为1:20g/mL，粗多糖提取率为20.38-30.78％。

进一步，热水浸提后抽滤、醇沉、脱蛋白，再冷冻干燥得百合粗多糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过正交试验优选的百合多糖提取最优工艺为:提取时间2.5h，温度80℃，固液比为1:20g/mL，粗多糖提取率为20.38％。通过响应面法优选的百合多糖提取工艺为:提取温度76℃，提取时间1小时40分，料液比1:20g/mL，粗多糖提取率为30.78％。该研究表明响应面法对百合多糖水提法工艺条件进行的优化是稳定可行的，这将为商洛百合的进一步开发利用提供理论支撑。

附图说明

图1是提取温度对商洛野百合多糖得率的影响；

图2是提取时间对商洛野百合多糖得率的影响；

图3是提取料液比对商洛野百合多糖得率的影响；

图4是温度、时间和料液比交互作用对百合多糖得率的影响，其中，图4A为提取时间和提取温度的响应面图，图4B为提取时间和提取温度的等高线图，图4C为提取温度和料液比的响应面图，图4D为提取温度和料液比的等高线图，图4E为提取时间和料液比的响应面图，图4F为提取时间和料液比的等高线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料

兰州百合(LiLum davidi)购自于兰州市；商洛野百合(Lilium brownii)采自于丹凤县。

1.1.2主要试剂

苯酚、浓硫酸、95％乙醇、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。

1.2方法

1.2.1试验材料处理

取新鲜的百合若干，掰片洗净，60℃恒温烘干水分，粉碎过60目筛，得百合粉末，干燥保存备用。

1.2.2百合多糖提取

取百合粉末2g，溶于适量水中。热水浸提一定时间后，用纱布过滤2次，合并2次过滤的滤液，减压浓缩至原体积1/4。加入3倍体积的95％乙醇进行醇析，室温下放置12h，4000r/min离心15min。沉淀再次溶解，用1/4体积Sevag试剂脱蛋白，静置12h，4000r/min离心15min，得百合多糖粗提取液。

1.2.3百合多糖提取单因素试验

1.2.4正交试验设计

根据单因素试验结果，确定正交试验各参数如表1所示。

表1商洛野百合多糖提取正交试验设计L₉(3³)因素与水平

Table 1Factors and levels used in orthogonal array design L₉(3³)for polysaccharides extraction from Shangluo Lilium brownii

1.2.5响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，运用Design Expert软件设计三因素三水平的响应面法试验，以多糖得率为指标判定最佳工艺条件。响应面试验设计如表2所示。

表2商洛野百合多糖提取响应面试验设计因素与水平

Table 2Factors and levels used in response surface methodology for polysaccharides extraction from Shangluo Lilium brownie

1.2.6百合多糖含量测定

取多糖溶液1mL，加入5％苯酚溶液1mL和浓硫酸1mL，静置40min，比色测定。由所得吸光值A和回归方程，可得出样品中多糖的浓度，再按下面公式计算多糖的得率。

多糖得率％＝(多糖浓度C×溶液体积V×稀释倍数/样品干重m)×100％

2试验结果与分析

2.1多糖提取单因素试验结果

由图1可知，在确定浸提时间为1h、料液比为1:20g/mL的条件下，提取温度从60℃起到80℃，随着温度的升高，百合多糖得率也随之增加，80℃时多糖得率达到最大值，之后迅速下降。因而，确定80℃为百合多糖提取的最佳温度。

由图2可知，在提取温度为80℃、料液比为1:20g/mL的条件下，浸提时间从1h到2h，百合多糖的得率随时间不断增加，在2h时达到最大值，2h之后，多糖的得率下降。因而，确定2h为百合多糖提取的最佳时间。

由图3可知，在确定提取时间为2h、提取温度为80℃的条件下，料液比从1:10g/mL起到1:20g/mL，多糖的得率随着料液比的增大而增加，在1:20g/mL时达到最大值，之后多糖得率逐渐降低。这表明最佳提取料液比为1:20g/mL。

2.2正交试验设计及结果

根据单因素试验结果，选用提取温度(℃)、提取时间(h)和料液比(g/mL)为优选因素进行正交试验，正交试验结果见表3。

表3正交试验设计与结果

Table 3 Results and analysis of orthogonal array design

根据表3所示正交试验结果，通过比较各个因素的极差结果R值，可以得出R_A＞R_B＞R_C，即影响因素的主次顺序为浸提温度＞浸提时间＞料液比。最佳的提取工艺条件为A₂B₃C₂，即提取温度80℃，提取时间2.5h，提取料液比1:20g/mL，百合多糖得率为20.38％，优于正交试验其他组合。

2.3响应面试验设计及结果

表4 Box-Behnken试验设计及结果

Table 4 The experimental design and results for Box-Behnken

表5多糖提取工艺优化模型方差分析

Table 5 Analysis of variance of the mathematical model for polysaccharide extraction

注：**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。

由图4可以看出，各因素间交互作用对百合多糖得率的影响，在一定的范围内，随着提取时间的增加和料液比的增加，百合多糖得率增加幅度相对较大，表现为二者的曲线相对较陡；提取温度与提取时间及料液比的交互作用对百合多糖的得率影响较小，表现为其曲面较为平缓。另有研究表，交互作用的显著程度可以由等高线反映，越不显著其等高线越接近圆形，越显著越趋向椭圆形。由图4c可以看出，提取时间和料液比交互作用的影响要大于其他组。

2.4优化工艺的确定和验证试验

利用优选的正交试验工艺参数(提取温度80℃，时间2.5h，料液比1:20g/mL)对商洛野百合和兰州百合进行验证，三次重复，结果如表6所示。在该条件下商洛野百合和兰州百合的多糖得率分别为20.24％和37.75％。

运用Design-Expert 8.06软件对响应面法所得数据进行分析优化，得出响应面法提取百合多糖的理论最优工艺条件为提取温度76.51℃，时间1.81h，料液比1:19.11g/mL。根据可操作性，将其修正为：温度76℃，时间1小时40分，料液比1:20g/mL，三次重复。如表6所示，在该条件下商洛野百合和兰州百合的多糖得率分别为30.4％和43.23％，表明响应面分析法可以有效地对百合多糖提取工艺进行优化。

表6商洛野百合与兰州百合多糖得率的验证试验

The verification test for polysaccharide yield from Shangluo Lilium brownii and Lanzhou LiLum davidi

3结论

本发明通过正交试验优选的百合多糖提取最优工艺为:提取时间2.5h，温度80℃，固液比为1:20g/mL，粗多糖提取率为20.38％。通过响应面法优选的百合多糖提取工艺为:提取温度76℃，提取时间1小时40分，料液比1:20g/mL，粗多糖提取率为30.78％。该研究表明响应面法对百合多糖水提法工艺条件进行的优化是稳定可行的，这将为商洛百合的进一步开发利用提供理论支撑。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。