本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法，属于中兽药制备技术领域。
二、
背景技术：
鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、Duck Astrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80％，甚至可高达100％，是严重危害养鸭业主要病原之一。
目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化分子修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强。
党参是一种经典的补气用中药。大量的现代药理学研究和普遍的临床应用结果表明，党参多糖是其主要有效成分之一，具有良好的提高免疫的作用。虽然有学者发现，经过硫酸化修饰的硫酸化党参多糖对鸡传染性法氏囊病毒和猪圆环病毒等表现出良好的抑制作用。但是，由于其多糖分子量较大，水溶性并不好，对制剂和应用造成一定的困难。我们课题组发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多糖成分分子修饰物的活性和溶解性往往大相径庭。本课题组前期研究发现，磷酸化修饰后多糖的抗病毒活性和水溶解性得到显著提升，为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有一定效果的党参多糖80％醇沉部位采用磷酸化分子修饰，并利用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用率。
本发明首次对党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位采用正交法优化了磷酸化分子修饰条件，发现磷酸化分子修饰能显著增加党参多糖有效部位抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。
三、
技术实现要素：
技术问题 本发明针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题，提供一种党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的磷酸化分子修饰方法，所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％，且对鸭病毒性肝炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的防治。
技术方案
采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位党参多糖，经数次临床试验发现党参多糖乙醇浓度80％醇沉部分(CPPS80)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对CPPS80的磷酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位(CPPS80)的磷酸化分子修饰方法为：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg党参多糖有效部位CPPS80加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化党参多糖。经Nicolet FT-IR 200型傅立叶变换红外光谱仪分析为党参多糖磷酸酯pCPPS80。按此方法制备的党参多糖磷酸酯含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％。所获得的党参多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的党参多糖CPPS80。
有益效果
病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40％以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80％，甚至可高达100％，造成的损失难以估量。
党参多糖是党参的主要药效成分，具有良好的抗病毒、提高免疫等作用，目前已经开发成为兽医临床用抗病毒药物和提高免疫用药物。广泛的兽医临床试验发现，许多补益类中药多糖对猪圆环病毒、繁殖呼吸综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒等有较好的疗效，但对鸭病毒性肝炎、鸡新城疫等瘟疫疗效却不稳定。已有的研究发现党参多糖硫酸化分子修饰物具有更良好的抗病毒作用，但硫酸化分子修饰操作相对复杂，刺激性大，修饰物水溶性欠佳，生物利用度也有限。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高党参多糖的水溶性和生物利用度，本发明采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位CPPS80，所形成的党参多糖磷酸酯pCPPS80不仅磷酸根和磷酸酯多糖含量高，产物得率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性 肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为方便。
与现有技术相比，本发明优点如下：
1.多糖磷酸化分子修饰的方法国内虽有3篇报道[1.李益，钱慈，郭明，梁东军.香菇多糖磷酸化修饰的工艺研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2013，30(5)：664-670；2.孙雪，潘道东，曾小群，曹锦轩.浒苔多糖的磷酸化修饰工艺[J].食品科学，2011，32(24)：73-77；3.张难，吴远根，莫莉萍，邱树毅，王文平.香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究[J].食品与发酵工业，2007，33(12)：63-67]，但此3文并不是对党参多糖进行修饰，更不是对有效作用部位进行修饰，所选的工艺方法为响应面法，本法采用的正交筛选，获得的最佳修饰条件也不同。且最根本的在于本发明所修饰的党参多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位CPPS80，目前国内外尚未见相似研究。
2.通过本发明实施所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。
3.通过本发明实施所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80不仅对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞作用显著优于未修饰党参多糖有效部位CPPS80，且对DHV-1攻毒感染鸭的治疗作用也优于未修饰的党参多糖有效部位CPPS80。
四、具体实施方式
1.党参多糖的提取及有效部位筛选
称取1000g党参，加10倍量水浸泡3h，加热煮沸1h，收集煎煮液，反复3次；合并收集的煎煮液，煮沸浓缩至1000mL，用高速离心机离心，取上清。缓慢向浓缩液中加入不同体积分数为95％的乙醇，使溶液中乙醇含量分别为50％、65％、75％、80％，静置过夜，分别离心收集沉淀。经流水透析后，真空浓缩，4000rpm/min，离心20min，上清再次加入不同体积分数95％乙醇沉淀，重复透析、浓缩、离心，反复3次后，经去蛋白处理，纯化处理后，60℃真空干燥，碾碎，分别得到党参多糖不同醇沉部位CPPS50、CPPS65、CPPS75、CPPS80和总多糖CPPSt。
3日龄非免樱桃谷鸭随机均分7组，每组31羽，分别为空白对照组、攻毒对照组和5个不同醇沉部位党参多糖组。除空白对照组外，其余6组鸭分别肌肉注射鸭肝炎病毒DHV-10.2mL/羽后，1h后各多糖组分别于饮水中添加多糖饮喂，3mg/羽.天，连续3天，每天观察记录各组鸭死亡情况，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。结果发现，党参多糖不同醇沉部位CPPS50、CPPS65、CPPS75、CPPS80和总多糖CPPSt及攻毒对照组各组存活率依次为9.67％、22.58％、19.35％、22.58％、29.03％和16.13％。其中80％醇沉部位CPPS80的存活率显著高于攻毒对照组，并高于其他醇沉部位，拟对此部位进一步修饰研究。
2.党参多糖有效部位CPPS80磷酸化分子修饰及条件优化
采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖有效部位CPPS80。根据单因素预试验结果，反应pH值、反应温度，反应时间对磷酸化修饰的影响较大，采用正交试验设计方法，选取反应PH值(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，确定三个水平，按照正交表L9(34)(表1)设计正交试验。
表1 正交试验因素和水平设计
精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg党参多糖有效部位CPPS80加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化党参多糖。结果见表2。
表2 L9(34)磷酸化党参多糖正交结果
以产物量为指标，最佳组合为A3B3C2，产物量为0.524g，以产物量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素B＞C＞A，即反应温度对产物量影响最大，其次是反应时间，最后是pH。以党参多糖含量为指标，最佳组合为A2B1C2，多糖含量为67.61％，以多糖含量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素A＞B＞C，即pH值对党参多糖含量影响最大，其次是反应温度，最后是时间。以磷酸根含量为指标，最佳组合为A1B3C3，磷酸根含量为15.62％，以磷酸根含量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素A＞B＞C，即pH对磷酸根含量的影响最大，其次是反应温度， 最后是反应时间。根据上述分析，对产物量影响最大的是反应温度，反应温度为90℃时，产物量最高。对糖含量影响最大的是pH，pH为8.5时，党参多糖含量最高；对磷酸根含量影响最大的是pH，为7.5时，磷酸根含量最大。首先保证磷酸根含量，选pH＝7.5为最佳pH值。因此，pH为7.5，反应时间为8h，反应温度为90℃为磷酸化党参多糖的最佳工艺。
按照最佳条件，再次用250mg党参多糖有效部位CPPS80进行磷酸化分子修饰，结果发现，其多糖含量为72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％。所获得的磷酸化党参多糖分子修饰物分别用蒸馏水、PBS和细胞培养液溶解，加入后轻微振摇，均立刻溶解，溶液呈均质淡棕色，对光观察，无明显可视沉淀物。表明党参多糖有效部位CPPS80经过磷酸化分子修饰形成后，水溶性显著增加，制剂使用更为方便。
3.党参多糖有效部位CPPS80磷酸化分子修饰产物红外光谱分析
采用KBr压片法以Nicolet FT-IR 200型傅立叶变换红外光谱仪分析上述最佳条件修饰的党参多糖有效部位磷酸化分子修饰产物(见图1)，党参多糖有效部位CPPS80和党参多糖磷酸化修饰物pCPPS80红外吸收光谱基本一致，均表现出了多糖的特异性吸收峰：两者在3600-3200cm-1处出现的宽峰是由O-H伸缩振动引起的，在3020-2820cm-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的，1633cm-1和1410cm-1左右处是由COO-的伸缩振动引起的，1200-950cm-1处出现的吸收峰群是C-O-C和C-O-H伸缩振动引起的。磷酸化党参多糖出现了新增加的吸收峰，1159.44cm-1处为亚磷酸酯引起；941.62cm-1处为焦磷酸酯。
附图说明 图1党参多糖有效部位CPPS80和党参多糖磷酸化修饰物pCPPS80红外分析光谱图
两者在3600-3200cm-1处的宽峰是-OH的伸缩振动吸收峰，在3020-2820cm-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起吸收峰，1633cm-1和1410cm-1处是由COO-的伸缩振动引起吸收峰、1200-950cm-1处出现的吸收峰群是C-O-C和C-O-H伸缩振动引起的吸收峰。修饰后的党参多糖保留了多糖特征吸收峰在1159.44cm-1处为亚磷酸酯引起；941.62cm-1处为焦磷酸酯引起。
4.党参多糖磷酸酯pCPPS80对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养鸭胚肝细胞的抑制作用研究
取14-16日龄鸭胚，无菌条件下取出肝脏。将取出的鸭胚肝脏去胆囊，用D-Hank′s清洗2次，剪碎后用D-Hank′s清洗3次。加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化8～15min，吸掉胰蛋白酶，用D-Hank′s清洗3次，加入含1％青霉素钾、1％硫酸链霉素、1％L-谷氨酰胺、10％小牛血清的DMEM培养基。计数使细胞浓度在0.8×106-1.2×106个/mL范围内，置37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞形成完整单层后，弃去细胞培养液，用D-Hank′s液洗2次待用。
将CPPS80、pCPPS80用细胞维持液分别从最大安全浓度(CPPS80和pCPPS80的最大安全浓度分别为313μg/mL和156μg/mL)连续倍比稀释5个浓度。在鸭胚肝细胞单层中每孔各加入病毒70μL，培养2h后弃去病毒液，用D-Hank’s反复清洗3遍，弃去清洗液，分别加入70μL稀释后受试药物，每药各浓度重复5孔。同时设细胞对照(CC)和病毒对照(VC)，置38℃5％CO2培养 箱内培养，当VC组出现明显病变时，用MTT法检测，读取A570值。同时计算病毒抑制率＝(A570.药+病毒-A570.VC)/(A570.CC-A570.VC)×100％。以A570值和病毒抑制率综合分析药物的抗病毒作用。结果见表3。CPPS80在39～19.05μg/mL时，其A570值均高于病毒对照组，但均不显著，最大病毒抑制率为4.76％。pCPPS80在安全浓度范围的最后2个浓度A570值均显著高于病毒对照组，均表现出抗DHV-1感染作用。pCPPS80的病毒抑制率为25.93％～80.24％，普遍高于CPPS80。
表3 CPPS80和pCPPS80体外抗DHV-1作用的A570值和病毒抑制率
注：同列数据标不同字母者差异显著(P＜0.05)。
5.党参多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染雏鸭的治疗作用研究
将165只4日龄樱桃谷鸭随机均分成4组：第1组为CPPS80治疗组，45只；第2组为pCPPS80治疗组，45只；第3组为病毒对照(VC)组，45只；第4组为空白对照(BC)组(隔离饲养)，30只。将1-3组的雏鸭肌肉注射DHV-1病毒0.2mL攻毒。攻毒后立即按如下方案于饮水中混饮给药：CPPS80治疗组3mg/只.天；pCPPS80治疗组2.5mg/只.天；每天1次，连续3d。每天观察各组鸭的临床症状及死亡情况，记录各组死亡数，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组死亡率(剔除采血雏鸭)，存活的鸭全面扑杀。
结果见表4。VC组的死亡率为97.8％；CPPS80治疗组的死亡率为777.8％，显著低于VC组；pCPPS80治疗组的死亡率为66.7％，显著低于VC组；pCPPS80组较CPPS80组死亡率低11个百分点，二者间没有显著性差异。说明党参多糖有效部位CPPS80磷酸化分子修饰后所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80的治疗效果优于未修饰的党参多糖有效部位CPPS80。
表4 CPPS80和pCPPS80对感染DHAV雏鸭死亡率的影响
注：同列数据标不同字母者差异显著(p＜0.05)。/：BC组没有死亡，停止死亡时间无法计算。