Ssm6a的重组表达和纯化方法及其使用的融合蛋白与流程

本发明涉及多肽的重组表达和纯化，尤其涉及氨基酸数目较多且富含二硫键的多肽的大规模重组表达和纯化。

背景技术：

慢性疼痛影响着超过20％的成年人群和50％的老年人群，极大降低患者的生活质量，同时也对各国构成了巨大的医疗负担。目前针对慢性疼痛的治疗主要包括使用非甾体抗炎药和阿片类药物。尽管非甾体抗炎药在世界范围内广泛使用，但其镇痛范围较小，且存在比较常见的胃肠道和肝肾损伤等不良反应；而阿片类药物虽然镇痛效果很好，但存在成瘾、致幻、和心肺损伤等严重不良反应，以及便秘和较强的药物戒断症状。同时，目前还存在很多没有有效治疗药物的其他类型的疼痛，例如神经系统损伤后的神经性疼痛、慢性内脏疼痛、纤维肌疼痛、癌症疼痛及各种对阿片类药物产生耐受的疼痛。这些现状都对新的镇痛药开发提出了严峻的挑战。

电压门控钠离子通道(Nav)Nav1.7大量表达于初级感觉神经元和交感神经节神经元，通过控制膜电位的阈值，在疼痛信号起始阶段发挥重要作用。其选择性抑制剂几乎可以用于各种类型的疼痛。目前选择性最好的Nav1.7离子通道抑制剂是来源于少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)毒液的毒素多肽Ssm6a(Discovery of a selective NaV1.7inhibitor from centipede venom with analgesic efficacy exceeding morphine in rodent pain models.PNAS,2013,110(43):17534-17539.Fusion of Ssm6a with a protein scaffold retains selectivity on NaV1.7and improves its therapeutic potential against chronic pain.Chemical Biology & Drug Design,2017,89(6):852-833.)，因此具有很大开发价值。中国发明专利(申请号为CN201210453532.1)已报道了该多肽的镇痛活性。

但是，Ssm6a等动物毒素来源的镇痛多肽普遍结构复杂，氨基酸数目较多，富含二硫键，导致体外复性难度高。因此，这样的镇痛多肽很难通过化学合成或常规的基因重组表达和纯化方式得到，只能依赖于活体提取获得。目前，通过人工合成，可以大量制备Ssm6a的方法尚未见报道。上述中国发明专利中也仅仅是从少棘蜈蚣毒液中通过分子筛和反相高效液相色谱分离纯化得到少量纯化的Ssm6a。

同时，对于这类结构比较复杂的毒素多肽，人工大量制备的合成工艺(包括化学合成和重组表达)一般不具有普遍适用性。同时，这类毒素多肽的纯化方法普遍采用反相高效液相色谱，污染较大、成本也比较高。

例如，中国专利申请03142248.9中公开了一种芋螺毒素MVII A与Trx的融合蛋白的原核重组表达和纯化方法，其中涉及的ω-芋螺毒素MVII A由25个氨基酸组成，其中包含的6个Cys残基形成三对二硫键。其中公开的原核重组表达和纯化方法中虽然使用了硫氧还蛋白和肠激酶，但是仍然未能实现产物直接和正确的表达，需要之后的额外体外复性步骤才能真正得到活性芋螺毒素。

技术实现要素：

虽然来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a具有很好的靶点选择性，有望开发成新一代镇痛药，具有较好的应用前景。但是，一方面该毒素多肽难以通过常规化学合成和重组表达方式(人工合成和纯化)制备。现有技术中没有关于其可以通过化学合成，或人工合成及纯化的教导；另一方面少棘蜈蚣毒液来源有限、成分复杂，从该天然来源提取毒素多肽Ssm6a的工艺难度很大、成本高。故目前镇痛多肽Ssm6a的开发利用受到了很大的限制，无法满足用于制备疼痛治疗药物的巨大需要。

本发明的目的是提供一种包含分子伴侣和毒素多肽Ssm6a的融合蛋白，其中所述分子伴侣促进毒素多肽Ssm6a中二硫键的正确折叠，使最终得到的成熟毒素多肽Ssm6a具有天然生物活性。

在一些实施方案中，上述毒素多肽Ssm6a的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、其天然变体或人工变体，其中融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IN NO:1或其变体。

在一些实施方案中，上述毒素多肽Ssm6a来源于少棘蜈蚣毒液。

本发明的另一目的是提供编码上述融合蛋白的核苷酸序列；包含其的载体；包含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供上述融合蛋白在制备用于缓解或治疗疼痛的药物中的用途。

本发明的另一目的是提供一种重组表达和纯化来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a的方法，包括如下步骤：

(i)构建包括编码本发明的融合蛋白的融合表达基因；

(ii)将步骤(i)中得到的融合表达基因插入表达质粒；转化宿主细胞；于合适的条件下，在宿主细胞表达；

(iii)分离与纯化该毒素多肽Ssm6a，

在一些实施方案中，上述宿主细胞优选是大肠杆菌细胞，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)细胞；上述表达质粒优选是pET28a。

本发明的上述Ssm6a重组表达和纯化方法可以根据所需产物的量，简单地扩大生产规模。同时，与化学合成相比，本发明的方法不需要使用昂贵的修饰氨基酸，且完全不需要使用大部分多肽常规制备方法中必需采用的反相纯化方法，避免了乙腈(目前多肽制备几乎必备的试剂，价格昂贵、毒性较大，需要回收处理)等化学溶剂的使用，不会导致毒性化学废液的产生，极大节约了生产成本和后续的环境成本。

可见，本发明弥补了现有技术中的技术空白，提供了一种简单经济、绿色环保的全新Ssm6a重组表达和纯化方法。

在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。

附图说明

图1是本发明的融合蛋白的示意图。

图2是本发明融合蛋白表达的结果，泳道1为总蛋白，泳道2为可溶蛋白，泳道3为沉淀蛋白，其中融合蛋白(硫氧还蛋白-6×His-tag-肠激酶切割位点-Ssm6a)基本可溶表达，灰度扫描显示占总蛋白30％。

图3a是本发明制备的毒素多肽Ssm6a的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图：具有单一目标条带；图3b为本发明制备的毒素多肽Ssm6a的HPLC检测图谱，目标产物为单一峰，纯度达到99.3％。

图4为本发明制备的毒素多肽Ssm6a的MALDI-TOF质谱鉴定图谱，测定分子量为5318.33。

图5a为小泛素修饰蛋白融合蛋白表达的结果，泳道1为总蛋白，泳道2为可溶蛋白，泳道3为沉淀蛋白，其中融合蛋白(6×His-tag-小泛素修饰蛋白-Ssm6a)可溶表达，灰度扫描显示目标融合蛋白占总蛋白5％；图5b为融合蛋白通过SUMO蛋白酶切割、多肽纯化后HPLC检测结果，显示为杂乱的错误折叠和聚合体，没有正确折叠产物。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细描述。所用的所有实验试剂和仪器设备，如无特别说明均为普通市售试剂和设备。

除非另外限定，本文中所用的全部术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义，在使用部分以下术语的定义时，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。本文给出的部分术语的定义仅是为了描述具体的实施方案，并非旨在限制。

一方面，本发明提供了包含分子伴侣和毒素多肽Ssm6a的融合蛋白(也称为“本发明的融合蛋白”)，其中分子伴侣促进毒素多肽Ssm6a中二硫键的正确折叠，使最终得到的成熟毒素多肽Ssm6a具有天然生物活性，并可以增加毒素多肽Ssm6a的表达量和可溶性。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含分子伴侣、纯化标签、内切酶切割位点和毒素多肽Ssm6a。

在一些实施方案中，本发明的“分子伴侣”是硫氧还蛋白、二硫键还原酶及异构酶、NusA、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌二硫键形成蛋白A(DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KDO合成酶(CKS)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。

在优选的实施方案中，本发明的“分子伴侣”是硫氧还蛋白。

在一些实施方案中，本发明的“纯化标签”是4-10个组氨酸(His-Tag)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或FLAG。

在优选的实施方案中，本发明的“纯化标签”是6-10个组氨酸(His-Tag)。

在进一步优选的实施方案中，本发明的“纯化标签”是6个组氨酸。

在一些实施方案中，本发明的“内切酶”是凝血酶或肠激酶。

在优选的实施方案中，本发明的“内切酶”是肠激酶。

在一些实施方案中，本发明的“毒素多肽Ssm6a”包含下述氨基酸序列之一或由下述氨基酸序列之一组成:

(1)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；

(4)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列；和

(5)由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3的氨基酸序列如下：

ADNKCENSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH

SEQ ID NO:4的核苷酸序列如下:

GCCGACAACAAATGCGAAAACAGTCTGCGTCGCGAAATTGCCTGCGGTCAGTGTCGCGATAAAGTCAAAACCGACGGCTACTTTTACGAGTGCTGCACCAGCGACAGCACCTTCAAAAAATGCCAGGACCTGCTGCACTAA

在一个优选的实施方案中，本发明的毒素多肽Ssm6a的氨基酸序列是在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的至多5处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明的毒素多肽Ssm6a的氨基酸序列是在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的至多5处具有保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的“毒素多肽Ssm6a”来源于少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)毒液。

在进一步优选的实施方案中，本发明的“毒素多肽Ssm6a”的成熟蛋白质包含46个氨基酸，理论分子量5317.97，序列为SEQ ID NO:3，等电点为6.76，包含三对分子内二硫键(排列方式为C1-C5、C2-C4和C3-C6)，IC50值为25nM。

术语“少棘蜈蚣”的别名是金头蜈蚣，属于动物界，节肢动物门，唇足纲，蜈蚣目，蜈蚣科，蜈蚣属的节肢动物，主要分布于中国和日本。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含下述氨基酸序列之一或由下述氨基酸序列之一组成:

(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；

(4)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列；和

(5)由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1的氨基酸序列如下：

MAKPIEVTDQNFDETLGQHPLVLVDFWAEWCAPCRMIAPILEEIAKEYEGKLLVAKLDVDENPKTAMRYRVMSIPTVILFKDGQPVEVLVGAQPKRNYQAKIEKHLPATAGSGHHHHHHDDDDKADNKCENSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH

SEQ ID NO:2的核苷酸序列如下：

ATGGCGAAACCGATTGAAGTTACCGATCAGAACTTTGACGAAACGCTGGGCCAACATCCGCTGGTGCTGGTTGATTTCTGGGCGGAATGGTGCGCCCCGTGTCGTATGATTGCACCGATCCTGGAAGAAATCGCTAAAGAATATGAAGGTAAACTGCTGGTCGCAAAACTGGATGTGGACGAAAACCCGAAAACCGCTATGCGTTACCGCGTTATGAGCATTCCGACGGTCATCCTGTTTAAAGATGGCCAGCCGGTCGAAGTGCTGGTTGGTGCGCAGCCGAAACGCAACTACCAAGCCAAAATCGAAAAACATCTGCCGGCAACCGCTGGATCCCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAAGCCGACAACAAATGCGAAAACAGTCTGCGTCGCGAAATTGCCTGCGGTCAGTGTCGCGATAAAGTCAAAACCGACGGCTACTTTTACGAGTGCTGCACCAGCGACAGCACCTTCAAAAAATGCCAGGACCTGCTGCACTAA

在一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白的氨基酸序列是在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中的至多5处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明的融合蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的至多5处具有保守氨基酸取代的氨基酸序列。

术语“片段”是指全长核苷酸序列或氨基酸序列中的一部分。

术语“变体”、“变体序列”或“突变体”可以互换使用，是指与亲本核苷酸序列或氨基酸序列具有一定程度的核苷酸/氨基酸序列同一性的核苷酸序列或氨基酸序列。变体序列类似于亲本序列，但在其核苷酸序列或氨基酸序列中具有至少一个或几个或多个取代、缺失或插入，使得它们与亲本核苷酸序列或氨基酸序列不同。另外，变体可以保留亲本核苷酸序列或氨基酸序列的功能特征或活性，例如，保持亲本核苷酸序列或氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的生物活性。“变体”包括自然界中本身就存在的天然变体、通过自然过程获得的天然变体，以及通过人工方法获得的人工变体。

相对于对照/参照氨基酸序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将一条氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位，任何保守取代不视为相同的序列)，以获取最大百分比序列同一性时，该条氨基酸序列中，与对照/参照多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目除以其总的氨基酸残基数目，得到的商(以百分比表示)。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定比对的适宜参数，包括使用对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“一处或多处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入”优选为不超过10处(即，至多10处)、不超过9处、不超过8处、不超过7处、不超过6处、不超过5处、不超过4处、不超过3处、不超过2处、不超过1处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入。

术语“保守取代/置换”是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代/置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代/置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代/置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代/置换。示例性的保守取代/置换如下表A所示:

表A

术语“本发明的融合蛋白”、“(本发明的)分子伴侣-纯化标签-内切酶切割位点-毒素多肽Ssm6a的融合蛋白”、“(本发明的)重组硫氧还蛋白-6×His-tag-肠激酶切割位点-毒素多肽Ssm6a的融合蛋白”和/或“SEQ ID NO:1的氨基酸序列”及其变体在本发明中可以互换使用。术语“(本发明的)毒素多肽Ssm6a”、“毒素多肽Ssm6a”、“(本发明的)毒素多肽(蛋白)”、“(本发明的)活性多肽(蛋白)”与“SEQ ID NO:3的氨基酸序列”及其变体在本发明中可以互换使用，是指可以发挥来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a成熟蛋白质的生物学活性和功能的多肽序列。

术语“His-tag(His-标签)”是一种纯化标签，由4～10个组氨酸构成，与金属离子，如镍离子或锌离子具有高亲和力。故具有His-tag的融合蛋白可以利用金属离子亲和层析进行纯化。

另一方面，本发明提供了编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列(也称为“本发明的核苷酸序列”)，其包含下述核苷酸序列之一或由下述核苷酸序列之一组成:

(1)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列；

(3)核苷酸序列，其在严格杂交条件下与(1)或(2)所述的核苷酸序列杂交且编码具有SEQ ID NO:2活性的氨基酸序列，其中所述严格杂交条件参见Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Nolan C.编著,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press；以及

(4)其核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明还提供“本发明的用于在宿主细胞中表达的核苷酸序列”、“本发明的用于在大肠杆菌细胞中表达的核苷酸序列”。这种用于在宿主细胞/大肠杆菌细胞中表达的核苷酸序列可以不同于上述编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列，因为这种用于在宿主细胞/大肠杆菌细胞中表达的核苷酸序列是针对宿主细胞/大肠杆菌细胞及表达载体，进行了密码子优化的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供包含本发明的核苷酸序列的表达载体(也称为“本发明的表达载体”)。

在一个优选的实施方案中，本发明的表达载体包含上述用于在宿主细胞/大肠杆菌细胞中表达的核苷酸序列，或编码本发明的氨基酸序列(优选SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明的表达载体包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行了密码子优化及相应的修饰，可以更好地表达本发明的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的表达载体是自主复制质粒载体。

在进一步优选的实施方案中，本发明的表达载体是pET28a质粒。

术语“载体”是指能够将核酸序列转移至靶细胞的载体。例如，载体可以包含能够在靶细胞中表达的编码核苷酸序列。在本发明中，“载体”通常是指能够引导目的基因表达并且可用于将目的基因转移到靶细胞中的任何核酸构建体。

另一方面，本发明提供包含本发明的表达载体的宿主细胞(也称为“本发明的宿主细胞”)。本发明的宿主细胞是用于大量扩增本发明的表达载体的宿主细胞，其可以是任何本领域已知的合适宿主细胞，包括真核宿主细胞和原核宿主细胞。

在一个优选的实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

在进一步优选的实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

大肠杆菌细胞遗传背景清楚、操作技术简单、营养要求不高、大规模发酵经济。大肠杆菌BL21(DE3)细胞/菌株常常用于高效表达含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)核苷酸序列，其中T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

另一方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制备用于缓解或治疗疼痛的药物中的用途。

另一方面，本发明提供了一种重组表达和纯化来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a的方法(也称为“本发明的方法”)，包括：

(i)构建包括编码本发明的融合蛋白的融合表达基因；

(ii)将步骤(i)中得到的融合表达基因插入本发明的表达质粒；转化本发明的宿主细胞；于合适的条件下，在宿主细胞表达；

(iii)分离与纯化本发明的毒素多肽Ssm6a。

在一个优选的实施方案中，步骤(ii)中得到的转化后的宿主细胞在培养至OD₆₀₀达到大约0.6-0.8后，往培养基中加入IPTG，在大约30-37℃的温度下诱导大约7-9小时，离心收获细菌沉淀物。在一个优选的实施方案中，步骤(iii)分离与纯化所述毒素多肽Ssm6a具体为下述步骤(1)-(3)：

(1)裂解步骤(ii)中已将本发明的融合表达基因表达为本发明的融合蛋白的宿主细胞，将包含融合蛋白的裂解液进行亲和层析，得到融合蛋白的粗制品；

(2)将步骤(1)中得到的融合蛋白粗制品用内切酶酶切，得到酶切产物溶液；

(3)将步骤(2)中得到的酶切产物溶液进行离子交换层析，得到毒素多肽Ssm6a的纯化原液；任选进一步处理得到纯度为大约99％以上的毒素多肽Ssm6a精制品。

在进一步优选的实施方案中，步骤(1)中的亲和层析是Ni-NTAsepharose亲和层析。

在进一步优选的实施方案中，步骤(2)中的内切酶是肠激酶，其按摩尔比大约1：550至1:650加入，并在20-30℃下酶切大约5-7小时。

在进一步优选的实施方案中，步骤(3)(即，精制步骤)中的离子交换层析先采用Q sepharose Fast Flow柱，pH为大约7.5-9.0，然后使用SP sepharose Fast Flow柱，pH为大约4.5-5.5。

在尤其优选的实施方案中，步骤(2)中得到的酶切产物溶液以大约50-100cm/h的速度通过Q sepharose Fast Flow柱，之后以大约50-100cm/h的速度上样到SP sepharose Fast Flow柱。

在最优选的实施方案中，Q sepharose Fast Flow柱采用流穿模式；SP sepharose Fast Flow柱采用吸附模式，上样后然后经过大约0-500mM NaCl线性梯度洗脱。

在进一步优选的实施方案中，本发明的方法还包括将得到的纯化原液通过超滤浓缩换液至大约pH5.0的醋酸水溶液，冷冻干燥得到Ssm6a精制品。

术语“约/大约”是指在给定值或范围的50％内，优选在25％内，更优选在10％-1％内；或指在平均数的可接受标准差内。

术语“融合表达基因”是指用于融合表达目的基因的核苷酸序列，其中除了目的基因的核苷酸序列外，还可以包括用于增加目的基因的表达量、增加目的基因的溶解性、促进目的基因表达得到的目的蛋白保持其天然活性、促进目的基因表达得到的目的蛋白的分泌、便于酶切等的各种表达元件。

术语“纯化原液”是指纯化结束后获得的目的蛋白的纯度在99％以上的溶液。

术语“精制品”或“纯品”是指纯化原液采用适当的方法脱盐、换液、浓缩、冻干后得到的目的蛋白干粉。

术语“肠激酶识别位点”是天冬氨酸—天冬氨酸—天冬氨酸—天冬氨酸—赖氨酸，即DDDDK五个氨基酸，肠激酶的高度专一性水解能力可保证本发明的毒素多肽Ssm6a N端的正确性，使得到的毒素多肽Ssm6a与天然毒素多肽Ssm6a具有完全相同的氨基酸序列。

术语“流穿模式”是指含有目标产物的料液经过层析柱时，采用适当的条件使其中的杂质与柱填料结合，目标产物随料液流出从而实现分离效果的柱纯化方式。

术语“吸附模式”是指含有目标产物的料液经过层析柱时，采用适当的条件使目标产物与柱填料结合、并通过适当的条件洗脱下来，从而实现分离和富集浓缩效果的柱纯化方式。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中含有由5～10个氨基酸组成的连接肽，优选为5～10个甘氨酸和丝氨酸交替相连构成的连接肽。连接肽的存在可以让分子伴侣更有效地促进毒素多肽Ssm6a折叠、肠激酶位点更好地暴露。

在一些实施方案中，本发明的方法包括发酵步骤，摇瓶发酵主要控制诱导温度约30℃到37℃，IPTG浓度约0.05-0.4mM，在此条件下可以实现产物高效表达；罐发酵需严格控制pH6.8-7.3，保证菌体正常生长，控制诱导温度约30℃到37℃，溶氧约30％-40％，IPTG浓度约0.05-0.4mM，实现产物高效表达。

在一些实施方案中，本发明的方法包括融合蛋白提取步骤，其中破壁缓冲液pH需控制在7.5-8.5之间。pH低于7.5会导致破壁不充分，且后续产物不能挂Ni-NTA sepharose亲和柱，而高于8.5融合蛋白容易产生降解，影响终产品纯度。

在一些实施方案中，本发明的方法包括精制步骤(即，上述步骤(3))，其中的两步柱纯化的pH值需要严格控制：Q sepharose Fast Flow柱需控制在7.5-9.0，SP sepharose Fast Flow柱需控制在4.5-5.5。pH值过高或过低都不能得到终产物或者得到的终产物的纯度降低。具体而言，如果Q sepharose Fast Flow柱pH值低于7.5，则杂质挂柱减少而使产物纯度降低，而高于9.0，Ssm6a也会挂到柱子上，没有和杂质分离；如果SP sepharose Fast Flow柱pH低于4.5，则杂质挂柱增多，纯度降低，而高于5.5，产物不挂柱导致不能得到终产品。

在一个优选的实施方案中，本发明重组表达和纯化来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a的方法包括以下步骤:：

(1)构建包括硫氧还蛋白-6×His-tag-肠激酶切割位点-Ssm6a融合表达基因；

(2)根据大肠杆菌密码子偏好性，优化毒素多肽Ssm6a基因序列，得到人工合成基因片段SEQ ID NO:4；

(3)将步骤(2)中得到的人工合成基因片段SEQ ID NO:4插入pET28a质粒，然后将包含SEQ ID NO:4的pET28a质粒转化大肠杆菌感受态细胞，得到成功转化的大肠杆菌A；

(4)将步骤(3)制备得到的大肠杆菌A接种至LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后加入IPTG，30℃-37℃培养7-9小时后，离心收获细菌沉淀物，超声破壁，离心，将得到的上清加入Ni-NTA sepharose亲和柱进行层析，之后进行透析或进行乙醇沉淀，得到融合蛋白；

(5)将步骤(4)中得到的融合蛋白重新溶解于酶切缓冲液，按摩尔比1:550至1:650加入肠激酶，20-30℃下酶切5-7小时，得到酶切产物；

(6)将步骤(5)中得到的酶切产物以50-100cm/h速度通过Q sepharoseFast Flow柱，得到流穿液，调节流穿液pH为4.5-5.5，然后以50-100cm/h的速度上样到SP sepharose Fast Flow柱，经过0-500mM NaCl线性梯度洗脱，收集目标峰，得到纯化原液；

(7)将步骤(6)中得到的纯化原液通过超滤浓缩换液至pH5.0的醋酸水溶液，冷冻干燥得到Ssm6a精制品。

实施例1基因重组工程菌构建

设计包括硫氧还蛋白-6×His-tag-肠激酶切割位点-Ssm6a的融合表达序列(SEQ ID NO:1)，然后根据大肠杆菌的密码子偏好性，优化其编码基因序列，得到最终优化后的编码核苷酸序列SEQ ID NO:2，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成(合成订单号：80-28327346)。

合成的基因片段经Nde I和Xho I双酶切(Fermentas公司)，连接到经相同的酶双酶切处理后的pET28a质粒(Novagen公司产品，按照制造商的建议操作)。连接后的重组pET28a质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证(测序单号：CX170710388-S)，确认序列准确无误。

CaCl₂处理法制备得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，然后42℃热击将上述序列确认的重组pET28a质粒转入感受态细胞，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养过夜。挑取单克隆菌株，提取质粒，测序验证，确认无误。

实施例2重组工程菌摇瓶发酵

实施例1中最终得到的菌种接种于100ml LB培养基(含卡那霉素50μg/ml)，220rpm(转/分钟)，37℃培养过夜作为种子。按照1％体积比的量接种于10L的LB培养基(含卡那霉素50μg/ml)进行发酵(2L摇瓶，装液量1L，共10瓶)：首先220rpm，37℃培养至OD₆₀₀达到0.8，调温至30℃，加入IPTG(终浓度0.2mM)诱导蛋白表达8h(小时)，8000rpm离心5min(分钟)收获菌体。

实施例3重组工程菌15L罐发酵

实施例1中最终得到的菌种接种于320ml LB培养基(含卡那霉素50μg/ml)，220rpm，37℃培养过夜作为种子。过夜种子按4％体积比的量接种于8L的LB培养基(含卡那霉素50μg/ml)。初始温度37℃，初始转速200rpm，初始通气量1:0.5，全程通过补加浓氨水控制pH值为6.8。通过增加转速、通气量和流加补糖培养基(60％葡糖糖，2％硫酸镁)控制溶氧保持在30％-40％。当OD₆₀₀达到20时，调温至30℃，加入IPTG(终浓度0.5mM)开始诱导蛋白表达，10小时后发酵结束，8000rpm离心5min收获菌体。

实施例4融合蛋白提取

实施例2及3获得的菌体按照1：10重悬于破菌缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)，超声充分破壁后，于4℃下15000rpm离心30min，收集上清液。上清液加入Ni-NTA sepharose亲和介质，4℃缓慢搅拌1小时，装柱过掉清液。得到的填料加入破菌缓冲液清洗后，加入4倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 8.0，300mM NaCl，250mM咪唑)洗脱下目标融合蛋白。通过透析方法，将得到的融合蛋白换液至酶切缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 8.0，2mM CaCl₂)。

实施例5融合蛋白提取

实施例4得到的融合蛋白溶液中加入等体积无水乙醇，充分搅拌沉淀，过滤得到沉淀蛋白。沉淀蛋白重新溶解于与实施例4相同的酶切缓冲液。得到的融合蛋白经SDS-PAGE电泳检测，发现融合蛋白基本可溶表达，灰度扫描显示可溶的融合蛋白占总蛋白的大约30％。

实施例6融合蛋白切割

将肠激酶加入到实施例4及实施例5得到的溶解于酶切缓冲液的融合蛋白溶液中进行酶切。酶切条件为温度25℃，按摩尔比1:600加入肠激酶，切割6小时。

实施例7活性多肽Ssm6a精制

采用两步离子交换层析法进行。

Q sepharose Fast Flow柱纯化：采用流穿模式。实施例6得到的酶切产物上样至Q sepharose Fast Flow柱，柱子预先用缓冲液A(50mM Tris-Cl，pH 8.0)平衡，上样流速控制在50-100cm/h之间，结束后用1倍柱体积缓冲液A冲洗，合并收集流穿液和冲洗液，得到合并收集液。

SP sepharose Fast Flow柱纯化：采用吸附模式。Q sepharose Fast Flow柱纯化得到的合并收集液用冰醋酸调节pH 4.5，上样至SP sepharose FastFlow柱，柱子预先用缓冲液B(10mM NaAc,pH 4.5)平衡，上样流速控制在50-100cm/h之间，结束后用1倍柱体积缓冲液B冲洗，然后用含有0-500mM NaCl的缓冲液B线性梯度洗脱，收集目标峰得到毒素多肽Ssm6a纯化原液。

实施例8活性多肽Ssm6a冻干

实施例7中精制得到的毒素多肽Ssm6a纯化原液通过超滤浓缩仪浓缩，然后换液至pH 5.0的醋酸水溶液，分装，冷冻干燥得到白色纯品(白色絮状产物)。该纯品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带(参见图3a)；HPLC检测为单一峰，纯度达到99.3％(参见图3b)，MALDI-TOF质谱鉴定分子量为5318.33(参见图4)，与理论分子量5317.97一致。这表明其中得到的毒素多肽Ssm6a中的三对二硫键均以形成，否则产物的分子量将比理论分子量5317.97增加6。

摇瓶发酵每升发酵液能得到毒素多肽Ssm6a纯品6mg，罐发酵每升发酵液能得到毒素多肽Ssm6a纯品100mg。

实施例9毒素多肽Ssm6a的小泛素修饰蛋白(SUMO)融合表达

按照实施例1描述的方法合成6×His-tag-小泛素修饰蛋白-毒素多肽Ssm6a的融合表达基因，连入pET28a质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞；按照实施例2或实施例3描述的方法进行发酵，获得菌体；按照实施例4描述的方法破壁，提取融合蛋白；Ni-NTA sepharose亲和柱洗脱得到的融合蛋白按照摩尔比1:500加入SUMO蛋白酶，20℃酶切4小时；酶切产物按照实施例7描述的方法精制。

按照本实施例的方法，得到的多肽为杂乱的错误折叠或聚集体状态，不能得到正确折叠的成熟毒素多肽Ssm6a(参见图5a和图5b)。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围，本领域的专业技术人员在不脱离本发明原理的前提下对还可以对本发明进行修饰，这些修饰同样属于本发明的保护范围。

序 列 表

<110> 海门迈克艾伦生物医药有限公司

<120> Ssm6a的重组表达和纯化方法及其使用的融合蛋白

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Lys Pro Ile Glu Val Thr Asp Gln Asn Phe Asp Glu Thr Leu

1 5 10 15

Gly Gln His Pro Leu Val Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Ala

20 25 30

Pro Cys Arg Met Ile Ala Pro Ile Leu Glu Glu Ile Ala Lys Glu Tyr

35 40 45

Glu Gly Lys Leu Leu Val Ala Lys Leu Asp Val Asp Glu Asn Pro Lys

50 55 60

Thr Ala Met Arg Tyr Arg Val Met Ser Ile Pro Thr Val Ile Leu Phe

65 70 75 80

Lys Asp Gly Gln Pro Val Glu Val Leu Val Gly Ala Gln Pro Lys Arg

85 90 95

Asn Tyr Gln Ala Lys Ile Glu Lys His Leu Pro Ala Thr Ala Gly Ser

100 105 110

His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ala Asp Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Asn Ser Leu Arg Arg Glu Ile Ala Cys Gly Gln Cys Arg Asp Lys

130 135 140

Val Lys Thr Asp Gly Tyr Phe Tyr Glu Cys Cys Thr Ser Asp Ser Thr

145 150 155 160

Phe Lys Lys Cys Gln Asp Leu Leu His

165

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgaaac cgattgaagt taccgatcag aactttgacg aaacgctggg ccaacatccg 60

ctggtgctgg ttgatttctg ggcggaatgg tgcgccccgt gtcgtatgat tgcaccgatc 120

ctggaagaaa tcgctaaaga atatgaaggt aaactgctgg tcgcaaaact ggatgtggac 180

gaaaacccga aaaccgctat gcgttaccgc gttatgagca ttccgacggt catcctgttt 240

aaagatggcc agccggtcga agtgctggtt ggtgcgcagc cgaaacgcaa ctaccaagcc 300

aaaatcgaaa aacatctgcc ggcaaccgct ggatcccatc accatcacca tcacgatgac 360

gatgacaaag ccgacaacaa atgcgaaaac agtctgcgtc gcgaaattgc ctgcggtcag 420

tgtcgcgata aagtcaaaac cgacggctac ttttacgagt gctgcaccag cgacagcacc 480

ttcaaaaaat gccaggacct gctgcactaa 510

<210> 3

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Asp Asn Lys Cys Glu Asn Ser Leu Arg Arg Glu Ile Ala Cys Gly

1 5 10 15

Gln Cys Arg Asp Lys Val Lys Thr Asp Gly Tyr Phe Tyr Glu Cys Cys

20 25 30

Thr Ser Asp Ser Thr Phe Lys Lys Cys Gln Asp Leu Leu His

35 40 45

<210> 4

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgacaaca aatgcgaaaa cagtctgcgt cgcgaaattg cctgcggtca gtgtcgcgat 60

aaagtcaaaa ccgacggcta cttttacgag tgctgcacca gcgacagcac cttcaaaaaa 120

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