本发明属于药物化学和医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的化合物及其制备方法。
背景技术：
肿瘤已成为威胁当代人类健康的主要疾病，据世界卫生组织报道每年死于肿瘤的患者占所有死亡患者的60％以上。恶性肿瘤又叫癌症，在众多类型的癌症病例中，男性癌症患者中死亡率最高的是肺癌，而女性癌症患者中死亡率最高的主要是乳腺癌。有数据显示，癌症死亡率仍在上升，并且趋于年轻化。对于癌症的治疗手段有手术疗法、化学疗法、普通放射疗法、立体定向疗法、免疫疗法、内分泌疗法、导向疗法、冷冻疗法、加温疗法、基因疗法。其中化学疗法，一般是指药物对抗癌症，这些药物能在癌细胞生长繁殖的不同阶段抑制或者杀死癌细胞，达到治疗目的。化学疗法主要运用于各种类型的白血病，以及用于不能手术又对放射疗法不敏感的患者，在癌症治疗中占着重要地位。
中药厚朴为木兰科植物尖叶厚朴或凹叶厚朴干燥的枝皮根皮，主要活性成分为厚朴酚与和厚朴酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒药理作用，同时也具有保肝护肝、保护神经等药理作用。
小檗碱(berberine)是常见的一种异喹啉类生物碱，主要存在于小檗科、毛莨科、婴粟科等植物中。现在提取的原料小檗碱是从黄连、黄柏、三棵针、云连等药用植物的根茎中得到。小檗碱的化学成分以及药理作用近年来成为研究的热点，除了在临床上作为广谱抗菌药和清热解毒药外，在其它疾病的治疗中也起到了重要的作用，如糖尿病、肿瘤、心血管疾病等。由小檗碱在高温下裂解可得到小檗红碱。
采用化学合成的方法，将二者分子母核有目的拼接在一起，是现有技术中没有任何公开或报道的。另外，新拼接成的化合物，能否增加和厚朴酚及小檗红碱的生物利用度，药物毒性，其某些药理作用能否得到增强，是否能达到1+1≥2，增效减毒的作用，能否突出二者抗肿瘤的药理作用等，这些也都是现有技术中没有任何公开或报道的。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种化合物，所述化合物比和厚朴酚和小檗红碱毒性小，而且具有更好的抗肿瘤等作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种化合物，所述化合物的结构式为：
本发明所述化合物由小檗红碱与和厚朴酚通过特定的反应合成所得，本发明的化合物能够显著降低和厚朴酚与小檗红碱的毒性，而且能够达到1+1≥2，起到增效减毒的作用，在抗肿瘤方面具有更好的效果。
同时，本发明还公开了所述化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将式(ⅰ)所示化合物与卤代剂在溶剂a中进行烷基取代反应，得到式(ⅱ)所示化合物；
(2)将步骤(1)中得到的式(ⅱ)化合物在碱催化剂及相转移催化剂作用下，与式(ⅲ)所示化合物在溶剂b中发生烷基化取代反应，即得到所述化合物(式(ⅳ)和(v))
本发明所述化合物的制备方法，通过特定的方式将和厚朴酚和小檗红碱的母核拼合在一起，但是这种拼合并不是盲目的，而是在多年中医药临床用药经验的指导下以及有机化学的基础上，有目的、有选择的将二者结合一起，本申请发明人发现二者结合后能够起到增效减毒的效果。而且本发明的方法操作简单，能够快速高效得到本发明所述的化合物。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中卤代试剂选自1,4-二溴丁烷、1,4-二碘丁烷和1,4-二氯丁烷中的至少一种；根据最优产率我们选择1,4-二溴丁烷。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中卤代剂与式(i)化合物的摩尔比为20:1～40:1；所述溶剂a与式(i)化合物的摩尔比为100:1～200:1。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为1:1～4:1；碱催化剂与式(ⅱ)化合物的摩尔比为5:1～20:1；相转移催化剂与式(ⅱ)化合物的摩尔比为0.5:1～5:1；溶剂b与式(ⅱ)化合物的摩尔比为200:1～300:1。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中反应温度为30～100℃，反应时间为3～12小时；作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中反应温度为70～80℃，反应时间为8～10小时。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中反应的温度为30～100℃，反应时间为4～15小时；作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中反应的温度为70～80℃，反应时间为4～15小时。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中溶剂a选自甲醇、乙腈、dmf、丙酮、乙醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二氧六环和异丙醇中的至少一种；作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中的溶剂a为dmf。
本申请发明人发现，当所述步骤(1)中的溶剂a选择dmf时，dmf对该步反应的反应物溶解性较好，极性适中，在既保证了产物收率的前提下，又易于后处理。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中的碱催化剂选自无水碳酸钠、无水碳酸钾和三乙胺中的至少一种；相转移催化剂选自苄基三乙基氯化铵(teba)、四丁基溴化铵(tbab)、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基氯化铵中的至少一种；作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中的碱催化剂为无水碳酸钾，相转移催化剂为四丁基溴化铵(tbab)。
本申请发明人通过大量研究发现，当所述碱催化剂选择无水碳酸钾时，相转移催化剂选择四丁基溴化铵(tbab)产物的收率明显高于其他催化剂。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中溶剂b选自甲醇、dmf、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、吡啶、喹啉、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二氧六环和异丙醇中的至少一种；作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中的溶剂b为乙腈。
本申请发明人通过大量研究发现，当所述步骤(2)中的溶剂b选择乙腈时，乙腈对该步反应的反应物溶解性较好，沸点适中，极性适中，在既保证了产物收率的前提下，又易于后处理。
作为本发明所述化合物的制备方法的最优选实施方式，所述步骤(1)中的溶剂a为dmf；所述步骤(2)中的溶剂b为乙腈，碱催化剂为无水碳酸钾，相转移催化剂为四丁基溴化铵(tbab)。
本申请发明人经过研究发现，当所述步骤(1)中的卤代反应温度为80℃、反应时间为10h，步骤(2)中的烷基取代反应的温度为80℃、反应时间为12小时，既能保证收率，又具有较好的经济性。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)的具体方法为：将式(i)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入溶剂a，缓慢加入卤代剂，待温度至80℃时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温至室温，抽滤干燥即得式(ⅱ)化合物。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)的具体方法为：将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，所述式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为1:1～4:1，碱催化剂，相转移催化剂和溶剂b，升温至在温度为70-80℃下反应4～15小时，反应结束后进行冷却，抽滤，用二氯甲烷洗涤，滤液旋蒸回收，用乙酸乙酯重结晶得橙黄色固体粗品。以ch2cl2:ch3oh体系为洗脱剂，硅胶层析进行纯化得本发明所述化合物(ⅳ和v)。
本发明还提供了所述化合物在用于制备治疗肿瘤药物中的用途。
本发明所述化合物可用于制备治疗肿瘤的药物。
本发明化合物是发明人在多年中医药临床用药经验以及有机化学的指导下，有目的、有选择的将小檗红碱与和厚朴酚通过特定的合成方法结合在一起，所得化合物具有增效减毒的效果，抗肿瘤方面具有更好的效果。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的化合物由小檗红碱与和厚朴酚通过特定的反应合成所得，其能够显著降低和厚朴酚的毒性，而且能够达到1+1≥2，起到增效减毒的作用，在抗肿瘤方面具有更好的效果；本发明所述化合物在用于制备治疗肿瘤药物中具有重要用途，为制备治疗肿瘤药物提供了新的选择；本发明所述化合物的制备方法简单，能够快速高效的得到本发明的化合物。
附图说明
图1为本发明所述化合物(ⅳ)的高分辨质谱图；
图2为本发明所述化合物(ⅳ)的红外光谱图；
图3为本发明所述化合物(ⅳ)的紫外光谱图；
图4为本发明所述化合物(ⅳ)的核磁共振的氢谱图；
图5为本发明所述化合物(ⅳ)的核磁共振的碳谱图；
图6为本发明所述化合物(ⅳ)的核磁共振hmqc相关谱图；
图7为本发明所述化合物(ⅳ)的核磁共振hmbc相关谱图；
图8为本发明所述化合物(ⅳ)的核磁共振h-h相关谱；
图9为本发明所述化合物(v)的高分辨质谱图；
图10为本发明所述化合物(v)的红外光谱图；
图11为本发明所述化合物(v)的紫外光谱图；
图12为本发明所述化合物(v)的核磁共振的氢谱图；
图13为本发明所述化合物(v)的核磁共振的碳谱图；
图14为本发明所述化合物(v)的核磁共振hmqc相关谱图；
图15为本发明所述化合物(v)的核磁共振hmbc相关谱图；
图16为本发明所述化合物(v)的核磁共振h-h相关谱。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例所用式(i)～(v)的化合物的结构式分别如下所示：
实施例1
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入dmf，所述dmf与式(i)化合物摩尔比为100:1，缓慢加入1,4-二溴丁烷，所述1,4-二溴丁烷与式(i)化合物的摩尔比为20:1；温度升至80℃左右，回流反应10小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥，即得式(ⅱ)化合物；
(2)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为1:1，加入乙腈溶液，无水碳酸钾和四丁基溴化铵(tbab)，所加入的乙腈与式(ⅱ)化合物的摩尔比为200:1，所加入的无水碳酸钾与式(ⅱ)化合物的摩尔比为5:1，所加入的四丁基溴化铵(tbab)与式(ⅱ)化合物的摩尔比为0.5:1；升温至80℃下反应12小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为45.5％，纯度为93％；式(v)化合物收率为35.5％，纯度为91％。
实施例2
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入dmf，所述dmf与式(i)化合物摩尔比为150:1，缓慢加入1,4-二氯丁烷，所述1,4-二氯丁烷与式(i)化合物的摩尔比为25:1；温度升至30℃左右，回流反应10小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥。即得式(ⅱ)化合物；
(2)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为2:1，加入dmf、无水碳酸钾和四丁基氯化铵，所加入的dmf与式(ⅱ)化合物的摩尔比为250:1，所加入的无水碳酸钾与式(ⅱ)化合物的摩尔比为20:1，所加入的四丁基氯化铵与式(ⅱ)化合物的摩尔比为1:1；在温度为70℃下反应15小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为31.2％，纯度为90％；式(v)化合物收率为25.1％，纯度为87％。
实施例3
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入甲醇，所述甲醇与式(i)化合物摩尔比为200:1，缓慢加入1,4-二碘丁烷，所述1,4-二碘丁烷与式(i)化合物的摩尔比为25:1；温度升至100℃，反应3小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥，即得式(ⅱ)化合物；
(2)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为4:1，加入二氯甲烷、无水碳酸钾和苄基三乙基氯化铵(teba)，所加入的二氯甲烷与式(ⅱ)化合物的摩尔比为200:1，所加入的无水碳酸钾与式(ⅱ)化合物的摩尔比为8:1，所加入的苄基三乙基氯化铵(teba)与式(ⅱ)化合物的摩尔比为2:1；在温度为30℃下反应15小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为34.1％，纯度为87％；式(v)化合物收率为32.1％，纯度为89％。
实施例4
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入四氢呋喃，所述四氢呋喃与式(i)化合物摩尔比为150:1，缓慢加入1,4-二溴丁烷，所述1,4-二溴丁烷与式(i)化合物的摩尔比为30:1；温度升至60℃，反应10小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥，即得式(ⅱ)化合物；
(2)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为4:1，加入丙酮、三乙胺和十二烷基三甲基氯化铵，所加入的丙酮与式(ⅱ)化合物的摩尔比为200:1，所加入的三乙胺与式(ⅱ)化合物的摩尔比为15:1，所加入的十二烷基三甲基氯化铵与式(ⅱ)化合物的摩尔比为1：1；在温度为60℃下反应12小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，得到式(ⅳ),(v)的化合物，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为21.1％，纯度为90％；式(v)化合物收率为17.5％，纯度为89％。
实施例5
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入吡啶，所述吡啶与式(i)化合物摩尔比为120:1，缓慢加入1,4-二溴丁烷，所述1,4-二溴丁烷与式(i)化合物的摩尔比为40:1；温度升至80℃，反应12小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥，即得式(ⅱ)化合物。
(2)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为2.5:1，加入二氧六环、无水碳酸钾和十四烷基三甲基氯化铵，所加入的二氧六环与式(ⅱ)化合物的摩尔比为300:1，所加入的无水碳酸钾与式(ⅱ)化合物的摩尔比为10:1，所加入的十四烷基三甲基氯化铵与式(ⅱ)化合物的摩尔比为2：1；在温度为70℃下反应8小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为33.1％，纯度为91％；式(v)化合物收率为24.9％，纯度为92％。
实施例6
本发明化合物的一种实施例，所述化合物采用以下制备方法制备而成：
(1)从市场直接购买得到式(i)化合物，其纯度为90％；
(2)将式(i)化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入甲醇和乙腈的混合溶液，所述甲醇和乙腈的混合溶液与式(i)化合物摩尔比为200:1，缓慢加入1,4-二溴丁烷，所述1,4-二溴丁烷与式(i)化合物的摩尔比为28:1；温度升至60℃，反应12小时，hplc监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，降温，抽滤，干燥，即得式(ⅱ)化合物。
(3)将式(ⅲ)化合物加入干净的三口烧瓶中，式(ⅲ)化合物与式(ⅱ)化合物的摩尔比为3:1，加入95％乙醇、无水碳酸钾和四丁基溴化铵，所加入的95％乙醇与式(ⅱ)化合物的摩尔比为250:1，所加入的无水碳酸钾与式(ⅱ)化合物的摩尔比为18:1，所加入的四丁基溴化铵与式(ⅱ)化合物的摩尔比为5：1；在温度为100℃下反应4小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，进一步纯化，即得本发明式(ⅳ)和(v)所示的化合物。
本实施例方法制备得到的式(ⅳ)化合物收率为36.6％，纯度为93％；式(v)化合物收率为29.9％，纯度为93％。
实施例7
本实施例对本发明所述化合物的高分辨质谱图、红外光谱图、紫外光谱图、核磁共振氢谱、碳谱图、核磁共振h-h相关谱、c-h相关谱图等分别进行了研究分析，如附图1～16所示。
从附图1～8可知，本发明化合物(ⅳ)，m.p.230.6℃，esi-msm/z:642.2788[m]+；
本发明化合物(ⅳ)，ir(kbr)νmax：3396.99,1636.3,1269.9,1397.17,1228.43,1600.63,1506.13,1480.1cm-1；
本发明化合物(ⅳ)1h-nmr和13c-nmr(meod-d2)如表1所示：
表1化合物(ⅳ)的1h-nmr和13c-nmr(meod-d2)
从附图9～16可知，本发明化合物(v)，m.p.233.6℃，esi-msm/z:642.2787[m]+；
本发明化合物(v)，ir(kbr)νmax：3396.99,1636.3,1269.9,1397.17,1228.43,1600.63,1506.13,1480.1cm-1；
本发明化合物(v)1h-nmr和13c-nmr(meod-d2)如表2所示：表2化合物(v)的1h-nmr和13c-nmr(meod-d2)
实施例8本发明化合物的抗肝癌效果试验
一、探讨本发明化合物对人肝癌细胞smmc-7721增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人肝癌细胞smmc-7721的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人肝癌细胞smmc-7721引自兰州大学生命科学学院；培养基rpmi1640(美国gibcobrl)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人肝癌smmc-7721细胞分别接种于含10％小牛血清rpmi1640培养基中，置37℃，5％co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
将浓度为1×105/ml的对数生长期的smmc-7721细胞，接种于96孔板，每孔100μl，在5％co2、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，5％co2培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测波长为490nm下的吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
本发明化合物对人肝癌细胞smmc-7721增殖的抑制作用检测结果如表3所示：
表3发明化合物对smmc-7721细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
由上述实验结果可知，本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对人肝癌癌细胞smmc-7721增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。说明本发明化合物可有效抑制人肝癌细胞smmc-7721的增殖。
二、探讨本发明化合物对人肝癌细胞hepg2凋亡的研究
(一)用sulforhodamineb(srb)染色法检测本发明化合物对人肝癌细胞hepg2增殖的抑制作用。
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人肝癌细胞hepg2引自广东药科大学生命科学学院；dmem培养基(吉诺生物公司)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
细胞培养：hepg2接种于含10％小牛血清dmem培养基中，置37℃，5％co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1、srb法检测本发明化合物对hepg2细胞的抑制作用
原理：sulforhodamineb(srb)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。srb可以与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在511nm的od读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。
方法：分别将对数生长期的hepg2细胞以10×104ml-1的浓度接种于96孔培养板中，培养24h后，向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，继续培养48h后，弃去培养液，加入10％的三氯乙酸(tca)100μl，静置5min后，将孔板移置4℃固定1h，倒掉固定液，用去离子水洗5遍，晾干。之后每孔加入100μl0.4％的srb染色10min，用1％的醋酸洗5次，自然晾干。然后每孔加入150μl10mmol·l-1的非缓冲tris碱液(unbufferedtris-basesolution，ph10.5)溶解与蛋白质结合的srb，用振荡器震荡5min使其充分溶解后，用酶标仪在515nm处测定每孔的od值。求其细胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100。其中c表示对照组的细胞od值；t表示加药组的细胞od值；t0表示对照平板测定加药时的细胞od值。在加药前即刻将平板中接种的细胞用tca固定。如果加药组最终的od值大于t0，说明细胞在加药后仍然生长。如果加药组最终的od值小于t0，说明加药后细胞被杀死。利用回归方程求出50％增殖抑制率的药物浓度(50％inhibitionconcentration，ic50)。从实验结果看，加药组最终的细胞数小于t0，继而说明药物对细胞生长有抑制作用，加药后细胞被杀死。以本发明化合物组和对照组处理hepg2细胞24h后的ic50值为例来比较各化合物对该细胞的毒性作用，ic50值如表4所示：
表4发明化合物对hepg2细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
由上述实验结果可知，本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对人肝癌癌细胞hepg2增殖的抑制作用增强，且与阳性药相当。说明本发明化合物可以有效抑制人肝癌癌细胞hepg2的增殖。
(二)细胞克隆形成实验
对数生长期实验细胞株制备成单细胞悬液，将其接种于六孔培养板，每孔500个，每组3个复孔，①本发明化合物iv、②本发明化合物v、③顺铂加入各组对应浓度(0.1×ic50)的药物，④空白对照组(培养液)，37℃、5％co2环境中培养7天，一直到六孔培养板出现肉眼可见的白色克隆斑，随即终止培养。弃去培养液，pbs缓冲液浸洗细胞2次，再用甲醇固定5min，然后giemsa染色0.5h，流水洗去染色液，室温下干燥。最后在倒置相差荧光显微镜(4倍)下计数≥50个细胞的细胞克隆数，克隆形成率(％)＝(克隆数/接种数)×100％。
(三)流式细胞学检测细胞凋亡
①对数生长期的细胞，胰酶消化后,以5×104/ml的密度接种,贴壁后加入dmem培养基培养24h,治疗组加入本发明化合物10μl(200μg/ml),对照组加入顺铂10μl(20μg/ml),空白组加入等体积的培养液。②继续培养48h，荧光素(fitc)对annexinv进行标记作为荧光探针，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
(四)细胞周期检测
对数生长期实验细胞株制备成单细胞悬液，将其接种于六孔培养板，每孔5×104个/ml，每组3个复孔，①本发明化合物iv、②本发明化合物v、③顺铂组
加入各组对应浓度(0.1×ic50)的药物，④空白对照组(培养液)，37℃、5％co2环境中培养48h后，消化①、②、③组贴壁细胞，ep管收集，预冷pbs吹扫，离心(1500rpm，15min)，弃去上清液，加预冷75％乙醇3ml固定0.5h，再次离心(1500rpm，15min)，弃去固定液，pbs细胞重悬5min，筛网(400目)过滤1次，离心(1000rpm，10min)，弃去pbs，4℃低温避光条件下pi染液0.5h，每组采集≥10000个细胞，流式细胞仪检测单色荧光细胞流式计数，multiplussoftware软件分析细胞周期。
对各组克隆率、凋亡率及细胞周期的检测结果如表5所示：
表5各组的克隆率、凋亡率及细胞周期比较(
由上述实验结果可知，本发明化合物对人肝癌细胞hepg2增殖具有一定的抑制作用；根据细胞凋亡实验可以看出，本发明化合物能促进肝癌细胞hepg2的凋亡。
(五)细胞迁移划痕实验
对数生长期实验细胞株制备成单细胞悬液，将其接种于六孔培养板，每孔5×104个，37℃、5％co2环境中培养24h后，用20μl移液器枪头对细胞进行划"一"字痕，每孔划痕1次，pbs洗涤2遍，尽量洗脱悬浮细胞①本发明化合物iv、②本发明化合物v、③顺铂组、④空白对照组(培养液)，再置于培养箱继续培养，应用相差显微镜分别拍摄培养12h、24h、36h痕边缘情况，划痕区愈合率(％)＝(初始面积-拍摄时间点面积)/初始面积×100％。
细胞迁移划痕实验检测结果如表6所示：
表6各组的不同时间点划痕愈合率比较(
实验结果显示，本发明化合物对人肝癌细胞hepg2增殖具有一定的抑制作用，可以减少癌细胞克隆和迁移，阻滞细胞于g0/g1期，促进癌细胞凋亡。
实施例9本发明化合物的抗乳腺癌效果试验
一、探讨本发明化合物对人乳腺癌细胞mcf-7增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人乳腺癌细胞mcf-7的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人乳腺癌细胞mcf-7引自广东药科大学生命科学学院；培养基rpmi1640(美国gibcobrl)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人乳腺癌细胞mcf-7分别接种于含10％小牛血清培养基rpmi1640中，置37℃，5％co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。将浓度为1×105/ml的对数生长期的mcf-7细胞，接种于96孔板，在5％co2、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，5％co2培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
实验结果如表7所示：
表7本发明化合物对mcf-7细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对人人乳腺癌细胞mcf-7增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
二、探讨本发明化合物对人乳腺癌细胞mda-mb-453增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人乳腺癌细胞mda-mb-453的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人乳腺癌细胞mda-mb-453引自中科院上海细胞库；培养基l-15(美国)，谷氨酰胺(赛默飞世尔)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人乳腺癌细胞mda-mb-453分别接种于含15％小牛血清、0.2922g/l谷氨酰胺培养基l-15中，置37℃，100％air培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。将浓度为1×105/ml的对数生长期的mda-mb-453细胞，接种于96孔板，在100％air、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，100％air培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
实验结果如表8所示：
表8本发明化合物对mda-mb-453细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对人乳腺癌mda-mb-453细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
三、探讨本发明化合物对人乳腺癌细胞mda-mb-231增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人乳腺癌细胞mda-mb-231的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人乳腺癌细胞mda-mb-231引自中科院上海细胞库；培养基l-15(美国)，谷氨酰胺(赛默飞世尔)，牛胰岛素(翊圣生物)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人乳腺癌细胞mda-mb-231分别接种于含10％小牛血清、0.01g/l谷氨酰胺，0.01g/l牛胰岛素的培养基l-15中，置37℃，100％air培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。将浓度为1×105/ml的对数生长期的mda-mb-453细胞，接种于96孔板，在100％air、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，100％air培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
实验结果如表9所示：
表9本发明化合物对mda-mb-231细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对人乳腺癌mda-mb-231细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例10本发明化合物的抗血癌效果试验
以白血病细胞k562为例，通过探讨本发明化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用中，来研究该化合物对的抗血癌作用。
本实验、台盼蓝排染法、彗星电泳技术和ao/eb双染法检测本发明化合物对白血病细胞株k562的抑制作用、对k562细胞dna的损伤和诱导k562细胞的凋亡作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-2)，人白血病细胞k562引自兰州大学生命科学学院；培养基rpmi1640(美国gibcobrl)，黄酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb，美国sigma)，台盼蓝(sigma公司)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
原理：活细胞具有排斥台盼蓝的能力，细胞死亡后由于膜完全性的破坏，细胞即被着色。将含有台盼蓝的细胞悬液滴入白细胞计数板小室中，在光学显微镜下观察计数活细胞(未被染成蓝色的细胞)。
实验方法：浓度为10×104·ml-1的处于对数生长期的k562细胞悬液，以0.5ml·孔-1接种于24孔培养板中。置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中预培养24h后加药。继续培养24、48h后，取0.4％台盼蓝溶液0.15ml加入0.6ml细胞悬液中，充分混匀，染色5min后吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，光学显微镜下数活细胞，重复3次，取其平均数。求其细胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100。其中c表示对照组的细胞数；t表示加药组的细胞数；t0表示对照平板测定加药时的细胞数。如果加药组最终的细胞数大于t0，说明细胞在加药后仍然生长。如果加药组最终的细胞数小于t0，说明加药后细胞被杀死。利用回归方程求出ic50。从实验结果看，加药组最终的细胞数小于t0，继而说明药物对细胞生长有抑制作用，加药后细胞被杀死。ic50值如表10所示：
表10本发明化合物对k562细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对k562细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例11本发明化合物的抗肺癌效果试验
一、探讨本发明化合物对人大细胞肺癌细胞h-460增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人大细胞肺癌细胞h-460的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人大细胞肺癌细胞h-460引自中科院上海细胞库；培养基rpmi1640(美国gibcobrl)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人大细胞肺癌细胞h-460分别接种于含10％小牛血清培养基rpmi1640中，置37℃，5％co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。将浓度为1×105/ml的对数生长期的人大细胞肺癌细胞nci-h460，接种于96孔板，在5％co2、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，5％co2培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
实验结果如表11所示：
表11本发明化合物对h-460细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对h-460细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
二、探讨本发明化合物对人肺癌细胞a549增殖的抑制作用
本实验采用mtt法检测本发明化合物对人肺癌细胞a549增殖的抑制作用。
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：本发明化合物(dmso配制原液，临用前稀释，保证dmso浓度在反应体系中至少稀释为1×10-3)，人肺癌细胞a549引自武汉大学中国典型培养物保藏中心；培养基rpmi1640(美国gibcobrl)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：人肺癌细胞a549分别接种于含10％小牛血清培养基rpmi1640中，置37℃，5％co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。将浓度为1×105个/ml的对数生长期的人肺癌细胞a549，接种于96孔板，在5％co2、37℃孵育条件下培养24h；向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，每个浓度6个复孔，设置调零孔和对照孔，多余的孔用相同体积的pbs补齐，置37℃，5％co2培养箱中培养48h，吸弃培养液，用无菌pbs洗涤，每孔清洗2次，每次200μl。然后每孔加入100μl含mtt的培养基(5mg/mlmtt：培养基＝1:4)，恒温箱中继续培养4h后，小心地吸出培养液，每孔加入150μldmso，振荡器振荡后，用酶标仪检测吸光度值，记录结果，利用spss16.0软件计算ic50值。
(三)实验结果
实验结果如表12所示：
表12本发明化合物对a549细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对a549细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例12本发明化合物抗人宫颈癌细胞hela的效果试验
(一)采用mtt法检测本发明化合物对人宫颈癌细胞hela的抑制作用。
材料与试剂：人宫颈癌细胞系hela(中国医学科学院肿瘤细胞库)；dmem培养基、胎牛血清(美国gibco)；mtt(美国sigma)；其它化学试剂均为分析纯
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
细胞的培养：人宫颈癌细胞系hela用含10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养，用0.25％胰酶－0.53mmol·l－1edta消化，2～3d传代1次。
mtt分析：将对数生长期的hela细胞接种于96孔板中，每孔104个细胞，每组设6个平行孔，加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液培养48h，弃旧培养液，加入200μl0.2mg·ml－1mtt的无血清培养基，继续培养4h后弃上清液，加入150μldmso，振荡溶解蓝紫色甲臢沉淀。用酶标仪测定吸光度(a492)。生长抑制率＝(1－a实验组/a对照组)×100％。据生长抑制率的结果计算ic50，结果如表13所示：
表13发明化合物对hela细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对hela细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例13本发明化合物抗人胃癌细mgc-803的效果试验
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：人胃癌mgc-803细胞株，细胞株来源于上海生命科学研究院；dmem培养基(hyclone公司)，胰蛋白酶(amresco公司)，优质胎牛血清(gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(mtt，sigma公司)，二甲基亚矾(dmso，sigma公司)。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞的培养：人胃癌mgc-803细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养。
mtt分析：将对数生长期的mgc-803细胞接种于96孔板中，每孔104个细胞，每组设6个平行孔，加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液培养48h，弃旧培养液，加入200μl0.2mg·ml－1mtt的无血清培养基，继续培养4h后弃上清液，加入150μldmso，振荡溶解蓝紫色甲臢沉淀。用酶标仪测定吸光度。生长抑制率＝(1－a实验组/a对照组)×100％。据生长抑制率的结果计算ic50。
(三)实验结果
实验结果如表14所示：
表14本发明化合物对mgc-803细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对mgc-803细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例14本发明化合物抗人前列腺细胞pc-3的效果试验
(一)材料、仪器与试剂
材料与试剂：人前列腺细胞pc-3引自上海生命科学研究院；rpmi-1640培养(美国gibco公司)，胰蛋白酶(amresco公司)，优质胎牛血清(gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(mtt，sigma公司)，二甲基亚矾(dmso，sigma公司)。
实验仪器：美国precisionscientificco2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞的培养：人前列腺细胞pc-3用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基在37℃、5％co2条件下培养。
mtt分析：将对数生长期的pc-3细胞接种于96孔板中，每孔104个细胞，每组设6个平行孔，加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液培养48h，弃旧培养液，加入200μl0.2mg·ml－1mtt的无血清培养基，继续培养4h后弃上清液，加入150μldmso，振荡溶解蓝紫色甲臢沉淀。用酶标仪测定吸光度。生长抑制率＝(1－a实验组/a对照组)×100％。据生长抑制率的结果计算ic50。
(三)实验结果
实验结果如表15所示：
表15本发明化合物对pc-3细胞的半数抑制浓度(μmol/l)
实验结果显示本发明化合物的ic50值小于合成前单体化合物，即对pc-3细胞增殖的抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。