一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合及其应用和试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒核酸检测的体外诊断
技术领域：
，具体而言，涉及一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合及其应用和试剂盒。
背景技术：
：长期以来，细胞学筛查是宫颈癌筛查的唯一或主要方式，自1941年传统巴氏细胞学检测引入临床以来，宫颈癌的发病率和死亡率大大降低，尤其死亡率至少降低了70％，但巴氏细胞学涂片的准确性受诸多因素的影响，假阴性率较高，为5％-40％。近30多年来，细胞学筛查先后经历了检测技术与诊断方式的革命，即液基细胞学制片技术和计算机辅助细胞检测系统的应用完善，前者明显提高了细胞涂片质量，降低假阴性率至10％左右，提高了宫颈上皮高级病变及侵润癌的阳性检出率。后者减少了主观评判错误，为大规范筛查迈出了重要一步，但仍离不开细胞病理学专家的判断鉴别，且需特殊设备，开展受限。随着人们对人乳头瘤病毒(HPV)和宫颈病变关系认识的逐渐加深以及医学实验技术发展，HPV感染的检查方法也由组织细胞水平发展到分子水平，HPV是一种嗜上皮性病毒。根据HPV致癌风险性大小，可将引起高度宫颈上皮内瘤变从而导致宫颈癌发生的HPV称为高危型HPV。2004年出版的《TheHealthProfessional'sHPVhandbook》指出高危型HPV有18种，分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82。高危型HPV感染被视为几乎所有宫颈癌发生的必要条件，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPVDNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80％。目前国内临床主要的HPV检测的常见方法包括测序法、杂交捕获法、基因芯片法及荧光PCR法。测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，不适于临床应用；杂交捕获法如Digene公司的HybridCaptureII已被美国FDA批准并已在临床上应用，检测时间长(DNA分离45min、DNA-RNA杂交60min、抗体捕获60min、化学发光30min、计算机判读15min一次实验一般要5～6小时)、灵敏度过低(3.5×105copies/mL)、操作复杂、检测基因型少无法具体分型(仅13种高危型)且需要特定昂贵的仪器，成本高，和其检测外的高危型和低危型如HPV6、11等存在交叉反应，该法假阳性的问题仍然十分严重，且成本高。不宜在经济较不发达的发展中国家推广；基因芯片法类产品(如PCR-反向点杂交法、液态芯片法)虽然能对HPV具体分型，且检测基因型相对多，但其缺点是不能实现实时检测，需要扩增后产物分析操作，耗时长(4h以上)、易存在PCR产物污染、操作复杂、不能满足临床宫颈癌大量筛查的需求。而上世纪90年代中期在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光PCR技术不但灵敏度高特异性强，自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，这些优点无疑给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。现有荧光PCR法HPV检测产品有以下缺点：1、现有荧光PCR产品不能在单管中实现18种高危型HPV分型，致使检测通量低且操作繁琐难以满足对大规模筛查要求。2、在单管中多数试剂盒检测少于18种高危型HPV，且不对HPV16、HPV18分型。综上亟需能够实现快速、有效且准确检测HPV病毒型别的产品，以用于HPV病毒高低危型的全面的检测，HPV病毒相关性疾病的预测及治疗监测。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合，该核酸组合可同时检测HPV16和HPV18且可对HPV16和HPV18特异性分型，同时还可通过内对照β-globin基因检测结果对检测过程进行质量控制，降低假阴性，具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的另一目的在于提供一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，该试剂盒可同时检测HPV16和HPV18且可对HPV16和HPV18特异性分型，同时还可通过内对照β-globin基因检测结果对检测过程进行质量控制，降低假阴性，具有操作简单、灵敏度高、特异性强的特点。检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断及宫颈癌的早期筛查。本发明是这样实现的：一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合，其包括：SEQIDNO.1-6所示的引物和SEQIDNO.7-9所示的探针。其中，SEQIDNO.1、SEQIDNO.4以及SEQIDNO.7可针对HPV16检测，SEQIDNO.2、SEQIDNO.5以及SEQIDNO.8可针对HPV18检测，SEQIDNO.3、SEQIDNO.6以及SEQIDNO.9针对β-globin基因检测，作为内参对照。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括以下核酸分子组合方式中的一种或多种：(1)SEQIDNO.10和SEQIDNO.24所示的引物以及SEQIDNO.34所示的探针；用于检测HPV31。(2)SEQIDNO.11和SEQIDNO.26所示的引物以及SEQIDNO.35所示的探针；用于检测HPV33。(3)SEQIDNO.10和SEQIDNO.25所示的引物以及SEQIDNO.34所示的探针；用于检测HPV35。(4)SEQIDNO.13和SEQIDNO.35所示的引物以及SEQIDNO.35所示的探针；用于检测HPV52。(5)SEQIDNO.12和SEQIDNO.35所示的引物以及SEQIDNO.35所示的探针；用于检测HPV58。(6)SEQIDNO.14和SEQIDNO.27所示的引物以及SEQIDNO.36所示的探针；用于检测HPV39。(7)SEQIDNO.15和SEQIDNO.28所示的引物以及SEQIDNO.36所示的探针；用于检测HPV45。(8)SEQIDNO.16和SEQIDNO.30所示的引物以及SEQIDNO.36所示的探针；用于检测HPV59。(9)SEQIDNO.17和SEQIDNO.29所示的引物以及SEQIDNO.36所示的探针；用于检测HPV68。(10)SEQIDNO.18和SEQIDNO.30所示的引物以及SEQIDNO.36所示的探针；用于检测HPV73。(11)SEQIDNO.21和SEQIDNO.33所示的引物以及SEQIDNO.37所示的探针；用于检测HPV51。(12)SEQIDNO.20和SEQIDNO.32所示的引物以及SEQIDNO.37所示的探针；用于检测HPV53。(13)SEQIDNO.19和SEQIDNO.31所示的引物以及SEQIDNO.37所示的探针；用于检测HPV56和HPV66。(14)SEQIDNO.22和SEQIDNO.33所示的引物以及SEQIDNO.37所示的探针；用于检测HPV82。(15)SEQIDNO.23和SEQIDNO.33所示的引物以及SEQIDNO.37所示的探针；用于检测HPV26。同时采用上述的引物和探针进行PCR，可在同一体系进行超多重PCR，避免非特异性扩增，提高检测结果的准确性，不仅实现对HPV16、HPV18的检测，还可以实现对其他高危型HPV即HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV73、HPV51、HPV53、HPV56、HPV66、HPV82和HPV26的检测，具有较好的特异性和灵敏度。上述的核酸组合在制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其包括：上述的核酸组合。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括以下成分中的一种或多种：PCR反应液、酶混合液、HPV反应液和阳性对照；上述HPV反应液中含有上述核酸组合。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述PCR反应液含有以下：去RNA酶水、PCR缓冲液、Mg2+以及dNTPs。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述酶混合液含有：Taq酶和UDG酶。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合中的探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；上述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy3或Cy5荧光报告基团，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra中的任意一种或几种；SEQIDNO.7所示的探针的荧光报告基团与SEQIDNO.8以及SEQIDNO.34-37所示的探针的荧光报告基团均不同，SEQIDNO.8所示的探针的荧光报告基团与SEQIDNO.34-37所示的探针的荧光报告基团不同。SEQIDNO.34-37所示的探针的荧光报告基团为同一类型的荧光报告基团。进一步地，在本发明的一些实施方案中，SEQIDNO.7所示的探针的荧光报告基团为FAM，SEQIDNO.8所示的探针的荧光报告基团为VIC，SEQIDNO.34-37所示的探针的荧光报告基团为ROX。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述HPV反应液中，上述核酸组合的各引物浓度为0.1～0.5μmol/L，各探针浓度为0.05～0.3μmol/L。进一步地，在本发明的一些实施方案中，阳性对照包括：HPV16质粒、HPV18质粒、HPV52质粒及β-globin质粒。本发明具有以下有益效果：本发明提供的检测人乳头瘤病毒的核酸组合，SEQIDNO.1-6所示的引物和SEQIDNO.7-9所示的探针，SEQIDNO.1和SEQIDNO.4所示的引物与SEQIDNO.7的探针组合可针对HPV16检测，SEQIDNO.2和SEQIDNO.5所示的引物与SEQIDNO.8所示的探针组合可针对HPV18检测，SEQIDNO.3和SEQIDNO.6所示的引物与SEQIDNO.9所示的探针组合可针对内参基因β-globin检测，该核酸组合可在同一体系中进行，避免非特异性扩增，不仅可对HPV16和HPV18同时检测，还可以对HPV16和HPV18分型，具有较高的特异性和灵敏度。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例1中的HPV16质粒结构图图2为本发明实施例1中的各阳性对照质粒HPV16质粒、HPV18质粒、HPV52质粒及β-globin质粒的阳性对照扩增图图3为实验例1中采用实施例1的试剂盒对各病原体的特异性扩增图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的检测人乳头瘤病毒的试剂盒包括如下成分：(1)PCR反应液：所述PCR反应液由去RNA酶水、10×PCR缓冲液、25mMMg2+、10mMdNTPs组成(见表1)。表1PCR反应液的组成试剂名称加入体积(μl)/50反应去RNA酶水357.510×PCR缓冲液12525mMMg2+25010mMdNTPs37.5总计770(2)酶混合液所述的酶混合液包括DNA聚合酶、逆转录酶(表2)。表2酶混合液的组成试剂名称加入体积(μl)/50反应Taq酶29UDG酶1总计30(3)HPV反应液所述的HPV反应液包括以下组成组分：用于扩增HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV73、HPV51、HPV53、HPV56、HPV66、HPV82、HPV26和β-globin的上下游引物，碱基序列如SEQIDNO1～SEQIDNO.6、SEQIDNO10～SEQIDNO.33所示；以及针对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV73、HPV51、HPV53、HPV56、HPV66、HPV82和HPV26和β-globin的探针，各探针的碱基如SEQIDNO.7～SEQIDNO.9、SEQIDNO.34～SEQIDNO.37所示。将上述引物和探针配制成HPV反应液。在25μlPCR扩增体系中，HPV反应液使用4μl每个反应，其中SEQIDNO1～SEQIDNO.6、SEQIDNO10～SEQIDNO.33共计30条引物，每条引物浓度为0.4μmol/L；SEQIDNO.7～SEQIDNO.9、SEQIDNO.34～SEQIDNO.37共计7条探针，每条探针浓度为0.2μmol/L。针对各病毒类型的引物和探针的序列见表3。表3检测各种病毒类型的引物和探针的碱基序列其中，HPV16-P探针的5’端标记有荧光报告基因FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；HPV18-P探针的5’端标记有荧光报告基因VIC，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；β-globin-P探针的5’端标记有荧光报告基因CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO33-37所示的探针的5’端标记有荧光报告基因ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。(4)阳性对照阳性对照分别由浓度为105copies/ml的HPV16质粒、HPV18质粒、HPV52质粒及β-globin质粒等体积混合构成。上述4种质粒是包含上下游引物的部分核苷酸序列，总长度控制在250bp左右，将化学合成好的序列连接到pGH载体骨架上合适的酶切位点上、转化到大肠杆菌进行复制，经过大量培养后，抽提复制的质粒序列。图1示出了插入HPV16部分核苷酸片段序列的pGH载体结构图，各阳性对照检测结果见图2。各阳性对照质粒插入的片段如下：HPV16质粒，HPV16部分核苷酸片段的碱基序列(5’-3’)如下：GAGGGTCAAGTTGACTATTATGGTTTATATTATGTTCATGAAGGAATACGAACATATTTTGTGCAGTTTAAAGATGATGCAGAAAAATATAGTAAAAATAAAGTATGGGAAGTTCATGCGGGTGGTCAGGTAATATTATGTCCTACATCTGTGTTTAGCAGCAACGAAGTATCCTCTCCTGAAATTATTAGGCAGCACTTG(SEQIDNO.38)。HPV18质粒，HPV18部分核苷酸片段的碱基序列(5’-3’)如下：GTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAG(SEQIDNO.39)。HPV52质粒，HPV52部分核苷酸片段的碱基序列(5’-3’)如下：TACATAGTAGATTGGTTGTGTTTCATTTCAAAAACCCATTTCCATTTGATGAAAATGGCAATCCTATATATGAAATTAACAACGAAAATTGGAAATCCTTTTTCTCAAGGACGTGGTGCAAATTAGATTTAATACAGGAAGAGGACAAGGAAAACGATGGAGTCGATACCGGCACGTTTAAATGCAGTGCAGGAAAAAATACTAGATCTATACGAAGCTGATAGTAATGACC(SEQIDNO.40)。β-globin质粒，β-globin部分核苷酸片段的碱基序列(5’-3’)如下：AAGGACTCAAAGAACCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACAGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAATTGTGTCAGAAGCAAATGT(SEQIDNO.41)。(5)空白对照去RNA酶水组成。本实施例提供的试剂盒的使用方法可参考如下步骤：(1)样本处理取200μl临床样品，按照江苏硕世生物科技股份有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂盒(货号SDK60105)进行提取。(2)试剂准备采用本实施例的试剂盒配制反应体系(表4)：表4反应体系加量(μl)/1人份PCR反应液15.4酶混合液0.6HPV反应液4DNA样本5总体积25(3)PCR扩增程序按照以下程序进行PCR扩增：50℃5min；95℃10min；95℃10s，58℃50s，共进行45个循环；(4)结果判定质量控制条件：在进行检测结果分析前需满足以下条件：空白对照应无典型S型扩增；阳性对照FAM、VIC、ROX、CY5通道应呈典型S型扩增曲线且CT值≤30。待测样本检测结果判断时，首先查看待测样本中内对照(β-globin)CY5通道是否满足CT值≤35，否则此样本进行重复检测、甚至重新取样检测。检测结果需满足以上条件时，才能确保结果真实可信。在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.4，判断为HPV16阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.4，判断为HPV16阴性；在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤34.6，判断为HPV18阳性；无典型“S”型扩增或CT＞34.6，判断为HPV18阴性；在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤33.6，判断为其他16种HPV高危型阳性；无典型“S”型扩增或CT≥33.6，判断为其他16种HPV高危型阴性。实验例1在进行超多重PCR反应时，在单个反应管中加入大量的引物探针，促使在聚合反应中引物和探针随机组合生成大量的非特异性的扩增产物，严重影响试剂盒的灵敏度。因此本实验采用与市场上同类多管分型的HPV检测产品评估实施例1的试剂盒在临床应用中的一致性、灵敏度与特异性。选择江苏硕世生物股份有限公司的人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂(简称为HPV21分型试剂盒)做为本次评估的参比试剂盒，共使用550份医院收集的宫颈脱落细胞样本，对实施例1的试剂盒进行一致性分析。1HPV16检测结果实施例1的试剂盒检测的具体结果见表5。在本次试验提供的550例样本中，参比试剂盒检出92例HPV16阳性样本，实施例1的试剂盒在92份阳性样本中检测出92份阳性；参比试剂盒检出458例HPV16阴性样本，实施例1的试剂盒在458份阴性样本中检测出457份阴性。表5实施例1的试剂盒对HPV16的检测结果2HPV18检测结果HPV18型检测的具体结果见表6。在本次试验提供的550例样本中，参比试剂盒检出34例HPV18阳性样本，实施例1的试剂盒在34份阳性样本中检测出34份阳性，参比试剂盒检出516例HPV18阴性样本，实施例1的试剂盒在516份阴性样本中检测出513份阴性。表6实施例1的试剂盒对HPV18的检测结果3其他高危型(包括HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV73、HPV51、HPV53、HPV56、HPV66、HPV82和HPV26)的检测结果其它16种HPV亚型核酸检测具体结果见表7。除了HPV16和HPV18外，其他16种HPV检测结果为，依据实施例1的试剂盒的检测范围及其产品特性，实施例1的试剂盒不能对除了HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV进行分型。在本次试验提供的550例样本中，参比试剂盒检出449例其它16种HPV亚型核酸阳性，实施例1的试剂盒在449份阳性样本中检测出449份阳性；参比试剂盒检测的其它16种HPV亚型核酸阴性101例，实施例1的试剂盒在101份阴性样本中检测结果99份阴性。表7实施例1的试剂盒对其它16种HPV亚型病毒核酸检测结果综上，将上述6份实施例1的试剂盒检测为阳性，HPV21分型试剂盒检测为阴性的样本进行测序法分析，实施例1的试剂盒检测结果与测序法结果一致，因此实施例1的试剂盒对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV73、HPV51、HPV53、HPV56、HPV66、HPV82和HPV26具有非常高的灵敏度和特异性，且与HPV21分型试剂盒具有高度的一致性。特异性分析采用实施例1的试剂盒检测与人乳头状瘤病毒感染部位相同、症状相似的病原体及试剂盒检测范围之外的人乳头状瘤病毒，用于评估特异性的病原体包括：嗜酸乳杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、棒状杆菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、大肠杆菌、肠道球菌、消化链球菌、克雷伯菌、变形杆菌、假单胞菌、拟杆菌、双岐杆菌、梭菌、腺病毒、巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、白色念珠菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、阴道毛滴虫，细菌的浓度为106cfu/ml，病毒的浓度为105pfu/ml；HPV6、HPV11、HPV61、HPV67、HPV71和HPV81的浓度为106copies/ml。结果见图3，实施例1的试剂盒检测上述病原体未见明显S型扩增曲线见图3，检测结果呈阴性，因此得出上述病原体对实施例1的试剂盒的检测不会产生干扰，实施例1的试剂盒具有较高的特异性。灵敏度分析将浓度为108copies/ml的各型别阳性参考品分别用TE稀释为105、104、103、102、101copies/ml共5个浓度梯度，取经梯度稀释好的105、104、103、102、101copies/ml的核酸，采用实施例1的试剂盒检测各阳性参考品，每个浓度重复检测20次。对实验结果(表8)进行统计分析，反应体系中浓度为1×103copies的18个HPV阳性参考品检出率分别都大于95％，将95％检出率的浓度作为实施例1的试剂盒检的灵敏度。因此，实施例1的试剂盒反应体系的灵敏度拟定为103copies/ml，灵敏度较高。表8实施例1的试剂盒灵敏度分析结果表8中：检出率例的数字A/数字B(数字C)中，数字A代表检出结果为阳性的次数，数字B代表总重复次数，数字C代表检出率。综上，本发明实施例提供的检测人乳头瘤病毒的试剂盒，该试剂盒可同时检测HPV16和HPV18其可对HPV16和HPV18特异性分型，同时还可通过内对照β-globin基因检测结果对检测过程进行质量控制，降低假阴性，具有操作简单、灵敏度高、特异性强的特点，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断及宫颈癌的早期筛查。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江苏硕世生物科技股份有限公司<120>一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合及其应用和试剂盒<160>41<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtggtcaggtaatattatg20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tattggttacataaggcacagg22<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3cctcaaacagacaccatg18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4agtgctgcctaataatttc19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5acagtaacaaataattgatt20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6ccaacttcatccacgttc18<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7tagcagcaacgaagtatcctctcc24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8aacaatggtgtttgctggca20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9cagtaacggcagacttctcctca23<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>10cgaagactctttgaact17<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11gaaaattggaaatcctttttc21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12aaattggaaatcctttttctc21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13aaaattggaaatcctttttct21<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>14cctctgactcccagtta17<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15gttacttctgattcacaatta21<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>16ggctgcacaaggctcagg18<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>17ggctgcacaaggcacagg18<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>18ggttgcaaaaggcacagg18<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>19tttgcaytatggcctgt17<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20taccacccatgatgtagt18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>21cgtgtgatatattcttctgta21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22cgtatacatatttgttacgca21<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>23ggataattattatttatggccct23<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>24ttgctcctctacctgtac18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>25ctgtatttccacttcaga18<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26ctccatcgttttccttgtcct21<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>27aagttggtactacgggta18<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>28taaattagtactgcgggta19<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>29tgtatccacaacggtaag18<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30gagtagtatctacaactgtt20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31ggtacaccttattktcacta20<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>32agataaaccttgctgtca18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>33caccttgctgtcaytagt18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34cagacagcggktatggcaat20<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>35gacgtggtgcaaattaggcttaat24<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>36aacaatggtatatgttggca20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37cgccgtaaacgtattcccta20<210>38<211>201<212>DNA<213>人工序列<400>38gagggtcaagttgactattatggtttatattatgttcatgaaggaatacgaacatatttt60gtgcagtttaaagatgatgcagaaaaatatagtaaaaataaagtatgggaagttcatgcg120ggtggtcaggtaatattatgtcctacatctgtgtttagcagcaacgaagtatcctctcct180gaaattattaggcagcacttg201<210>39<211>222<212>DNA<213>人工序列<400>39gtgtattctccctctccaagtggctctattgttacctctgactcccagttgtttaataaa60ccatattggttacataaggcacagggtcataacaatggtgtttgctggcataatcaatta120tttgttactgtggtagataccactcgcagtaccaatttaacaatatgtgcttctacacag180tctcctgtacctgggcaatatgatgctaccaaatttaagcag222<210>40<211>232<212>DNA<213>人工序列<400>40tacatagtagattggttgtgtttcatttcaaaaacccatttccatttgatgaaaatggca60atcctatatatgaaattaacaacgaaaattggaaatcctttttctcaaggacgtggtgca120aattagatttaatacaggaagaggacaaggaaaacgatggagtcgataccggcacgttta180aatgcagtgcaggaaaaaatactagatctatacgaagctgatagtaatgacc232<210>41<211>187<212>DNA<213>人工序列<400>41aaggactcaaagaacctctgggtccaagggtagaccaccagcagcctgcccagggcctca60ccaccaacttcatccacgttcaccttgccccacagggcagtaacagcagacttctcctca120ggagtcaggtgcaccatggtgtctgtttgaggttgctagtgaacacaattgtgtcagaag180caaatgt187当前第1页1 2 3