本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种透明质酸发酵的补料方法。
背景技术：
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透明质酸也称为玻璃酸 (Hyaluronic acid简称HA)，是由Meyer和Plamer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种广泛存在于动物和人体结缔组织细胞外基质以及部分细菌中的一种高分子直链酸性粘多糖。经过半个多世纪的研究，对其结构、理化性质、生理功能和临床应用方面已有了明确的认识，其分子结构是由 D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和 N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)通过 B-1,4 和B-1,3 糖苷键反复交替连接而成，分子量在 1.0×105～4.0×106 Da 之间。
透明质酸具有良好的保湿作用，又是皮肤和其他组织中广泛存在的天然分子，其优良的性能已受到国际化妆品界的广泛关注。目前，透明质酸化妆品类已经从最初的膏霜、乳液、化妆水、精华素胶囊、贴膜，扩展到浴液、粉饼、口红、洗发护发剂、摩丝等。
制备透明质酸主要有以下的途径：一是从动物组织中分离提取；二是通过微生物发酵法获得。动物组织提取法是最早采用的透明质酸生产方法，但这种生产方法原料来源局限性大，产品提取率极低，仅为1%左右，工艺程序复杂，生产成本居高不下，造成商品价格昂贵，限制了它在医药和化妆品中的广泛应用,不宜进行大规模工业化生产。此外，二十世纪八十年代后，越来越多的证据显示一些含有动物组织来源原料的产品，对使用者存在潜在的危险，包括中国在内的许多国家，明令限制含有这些原料的化妆品、口服保健品及药品的销售与使用。而微生物发酵法具有许多优点，比如成本低，生产规模不受原料限制，易于分离纯化，易于形成规模化工业生产。
透明质酸发酵对培养基的营养比较挑剔，比如对氮源要求非常苛刻，必须不同氮源搭配使用，实现培养基优势互补，才能收到较好的发酵效果。再者要求培养基具备较高Ca、Mg离子浓度，Ca主要通过井水硬度提供，Mg元素通过在培养基中添加硫酸镁提供。但培养基中的磷酸氢二钾极易与Ca、Mg离子反应形成沉淀，特别是在高温条件下更能加速反应，酵液中无法保持较高的Ca、Mg离子浓度，最终造成营养成份的浪费，不利于发酵的进行，发酵粘度不稳定，无法取得较好的发酵效果，大大影响发酵的产量。
技术实现要素：
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本发明就是针对上述问题，提供了一种透明质酸发酵的补料方法，使用诱变选育的兽疫链球菌作菌种，葡萄糖、硫酸镁溶于井水后在发酵罐内进行灭菌，酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾营养物质溶于纯化水后在补料罐内灭菌，然后通过分批或连续补料的方式转入发酵罐进行接种发酵，提高发酵液中的Ca、Mg离子浓度，减少前期发酵液在制备过程中各成分之间的反应，减少营养成份的破坏，并提高营养成分的利用率，利于发酵的进行，发酵粘度达到63750mPa·s，有助于提高发酵质量和产量。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种透明质酸发酵的补料方法，包括如下步骤：
（1）活化菌种：将兽疫链球菌接种至斜面菌种培养基上，得到活化的兽疫链球菌菌种；
（2）配制种子培养基：取适量的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾和硫酸镁，倒入种子培养基内进行混合后灭菌；
（3）将步骤（1）活化得到的兽疫链球菌菌种接种至步骤（2）制得的种子培养基上进行培养，得到种子液；
（4）将步骤（3）培养得到的种子液接种至扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
（5）取适量的磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母粉和纯化水，进行混合并充分溶解后，倒入补料罐内的补料培养基上，进行灭菌处理，得到混合液a；
（6）取适量的葡萄糖、硫酸镁和井水中，进行混合并充分溶解后，倒入发酵罐内的发酵培养基上进行灭菌处理，得到混合液b；
（7）将混合液a倒入发酵罐内的发酵培养基内；
（8）将步骤（4）得到的扩大培养液接种至发酵罐内进行发酵培养。
所述步骤（2）种子培养基的成分及含量分别为：葡萄糖5-15g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-20g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，硫酸镁 0.1-1g/L。
所述步骤（2）的灭菌过程持续20-30min，温度119-123℃。
所述步骤（3）种子液的培养条件为通风发酵5-15h，温度34-37℃，用20～35%的NaOH水溶液控制pH值保持6.0-8.0。
所述扩大培养基的成分及含量与种子培养基一致。
所述步骤（5）的混合液a占发酵液总体积的5-20%，所述步骤（6）的混合液b占发酵液总体积的70-85%，所述步骤（5）和步骤（6）的灭菌时间均为持续20-30min，温度119-123℃。
所述步骤（7）发酵培养基的成分及含量分别为：葡萄糖30-100g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-20g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，硫酸镁 0.1-1g/L。
所述步骤（7）的混合液a通过分批补料或连续补料的方式倒入发酵罐内的发酵培养基内。
所述步骤（8）通风发酵14-30h，温度34-39℃，用20～35%的NaOH水溶液控制pH值保持6.0-8.0，转种量为5-15%。
所述纯化水为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
本发明的有益效果：使用诱变选育的兽疫链球菌作菌种，葡萄糖、硫酸镁溶于井水后在发酵罐内进行灭菌，酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾营养物质溶于纯化水后在补料罐内灭菌，然后通过分批或连续补料的方式转入发酵罐进行接种发酵，提高发酵液中的Ca、Mg离子浓度，减少前期发酵液在制备过程中各成分之间的反应，减少营养成份的破坏，并提高营养成分的利用率，利于发酵的进行，利于发酵的进行，发酵粘度达到63750mPa·s，有助于提高发酵质量和产量。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
通过上述所述的方法流程制备以下材料。
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.1g，灭菌温度为119℃，灭菌时间为20min。
种子培养条件为温度34℃，用20%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵5h。
发酵培养基组成(每L)：葡萄糖30g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1g。其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯化水溶解至占发酵液总体积的5%，灭菌温度为119℃，灭菌时间为20min，葡萄糖、硫酸镁用井水溶解至占发酵液总体积的70%，灭菌温度为119℃，灭菌时间为20min。
发酵温度为34℃，转种量为5%，通过分批补料或连续补料的方式进行发酵，用20%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵14h。
发酵结束后，去样品进行测试，得出发酵粘度低于63750mPa·s。
实施例2
通过上述所述的方法流程制备以下材料。
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1g，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
种子培养条件为温度35℃，用30%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵10h。
发酵培养基组成(每L)：葡萄糖100g，酵母粉4g，蛋白胨13g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1g。其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯化水溶解至占发酵液总体积的15%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min，葡萄糖、硫酸镁用井水溶解至占发酵液总体积的70%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
发酵温度为37℃，转种量为15%，通过分批补料或连续补料的方式进行发酵，用30%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵20h。
发酵结束后，取样品进行测试，得出发酵粘度达到63750mPa·s。
实施例3
通过上述所述的方法流程制备以下材料。
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖15g，酵母粉10g，蛋白胨20g，磷酸氢二钾5g，硫酸镁1g，灭菌温度为123℃，灭菌时间为30min。
种子培养条件为温度37℃，用35%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵15h。
发酵培养基组成(每L)：葡萄糖100g，酵母粉10g，蛋白胨20g，磷酸氢二钾5g，硫酸镁1g。其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯化水溶解至占发酵液总体积的20%，灭菌温度为123℃，灭菌时间为30min，葡萄糖、硫酸镁用井水溶解至占发酵液总体积的850%，灭菌温度为123℃，灭菌时间为30min。
发酵温度为39℃，转种量为5%，通过分批补料或连续补料的方式进行发酵，用35%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵30h。
发酵结束后，取样品进行测试，得出发酵粘度低于63750mPa·s。
经对比，实施例2得到的产品符合要求，发酵效率好，产量高。