一种用于检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料及其制备方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体的说，涉及一种用于检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料及其制备方法。

背景技术：

锌是人体中第二大丰富的过渡金属，它是人体所必需的微量元素，不仅在许多生理过程中，如基因表达、细胞代谢、dna识别等起到关键作用，而且能够促进人体生长发育、增强免疫力以及调节各种酶及受体的作用。锌离子的缺乏将导致侏儒症、智力发育不良、胎儿发育迟缓等症状，因此寻找一种原位实时检测锌离子浓度的方法具有重要意义。

目前锌离子的检测方法主要有荧光分析法、原子吸收分光光度法和电化学分析法。迄今为止，荧光分析法结合其成像优势，已经开发了大量的zn²⁺荧光传感器，但是，其需zn²⁺连接有机荧光团形成配体，导致其前处理过程十分繁琐，分析时间长而且药品成本高，同时很难区分zn²⁺和cd²⁺两种结构相似的离子。因此，急需要开发出一种高选择性、高灵敏度且能够区分zn²⁺和cd²⁺两种离子的检测技术。

近年来，一种基于贵金属基底的表面增强拉曼(sers)光谱技术引起了研究者的广泛兴趣。sers技术由于其高灵敏度、无破坏性、检测线低等优点，被广泛用于检测生物分子、食品添加剂、金属离子等领域。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能用于快速、准确检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料及其制备方法。本发明的荧光-拉曼双探针材料检测锌离子，灵敏度高，选择性好。

本发明以二吡啶化合物作为荧光分子指示剂，其能与zn²⁺特异性结合，荧光强度随着zn²⁺浓度增加而线性增加；同时二吡啶化合物有效修饰到金属等离子体表面形成mdpa-aunps，表达出较高的sers活性，表面增强拉曼光谱在1024cm^-1处出现新峰且拉曼信号随着zn²⁺浓度增加而线性增加。

本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种用于检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料的制备方法，具体步骤如下：(1)首先将n-叔丁氧羰基乙二胺与氯甲基吡啶反应，生成n-boc保护的二吡啶化合物；然后用氢氟酸去除boc保护基团，制备得到n,n-二甲基吡啶乙二胺

(2)将n,n-二甲基吡啶乙二胺与巯基乙酸在edc/nhs作用下发生酰胺化反应，制备得到二吡啶巯基乙酰胺

(3)通过自组装法，将二吡啶巯基乙酰胺修饰到金纳米颗粒表面，常温孵育、离心得到用于检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料。

本发明中，步骤(3)中，金纳米颗粒的平均粒径在2～100nm之间。

本发明中，步骤(3)中，金纳米颗粒的平均粒径在30～70nm之间。

本发明中，步骤(3)中，金纳米颗粒由haucl4.4h2o水溶液和柠檬酸钠水溶液回流反应得到。

本发明中，步骤(3)中，常温孵育时间为30～90min，离心转速为7000～9000rpm，离心时间为3～10min。

本发明中，步骤(3)中，二吡啶巯基乙酰胺溶液的0.05～0.2mmol/l；金纳米胶体浓度为0.2～0.8nmol/l。

本发明中，步骤(3)中，二吡啶巯基乙酰胺溶液的分子浓度为0.08～0.12mmol/l；金纳米胶体浓度为0.4～0.6nmol/l。

本发明中，步骤(3)中，二吡啶巯基乙酰胺溶液和金纳米胶体体积比为1:20～1:100。

本发明中，步骤(3)中，二吡啶巯基乙酰胺溶液和金纳米胶体体积比为1:40～1:60。

本发明还提供一种上述制备方法制得的用于检测锌离子的荧光-拉曼双探针材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明以二吡啶巯基乙酰胺mdpa为荧光与拉曼双特性分子指示剂，将其修饰到金纳米颗粒上，制备出贵金属的功能化纳米材料，工艺简单、方便推广使用；

2、本发明采用荧光与拉曼双探针模式对锌离子进行检测，响应速度快、检测灵敏度高，其检测范围在之间，通过拉曼光谱检测最低浓度可达3pm，检测限低；

3、本发明的探针能够快速螯合锌离子，诱导功能化金纳米颗粒自团聚，进而有效增强拉曼增强因子，实现拉曼增强、多功能化的传感效果，提高锌离子检测灵敏度；

4、本发明利用双探针对zn²⁺与cd²⁺的拉曼特征峰分析，发现两种分子由于不同外电子层的螯合能力表现出不同的sers的信号，呈现cd²⁺1014cm^-1，zn²⁺1024cm^-1拉曼位移偏差，因此能有效定性区分这两种结构相似离子，实现zn²⁺和cd²⁺的区分；

5、本发明中，荧光检测器选择320nm激发波长、拉曼光谱仪选择785nm激发波长，在420nm处荧光强度随着锌离子浓度增加而增加，拉曼位移在1024cm^-1处出现新峰，同时拉曼强度随着锌离子浓度增加而增加。因此，本发明可以定量检测分析锌离子；

6、利用本发明的双探针进行检测，可以将zn²⁺和k⁺，ca²⁺，al³⁺，fe²⁺，ni²⁺，co²⁺，cu²⁺，cd²⁺相区分，特异性强。

附图说明

图1是实施例1中制备的二吡啶化合物mdpa的核磁共振谱图。

图2是实施例1中功能化金纳米颗粒随着锌离子浓度增加的紫外光谱图。

图3是实施例1中功能化金纳米颗粒的透射电镜图(左)，zn²⁺存在条件下的透射电镜图(右)。

图4是实施例1中的探针对不同离子的荧光光谱图。

图5是实施例1中的探针随着锌离子浓度增加的拉曼光谱图。

图6是实施例1中的探针对zn²⁺与cd²⁺定性区别的拉曼光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。

实施例1

(1)制备金纳米粒子

称取10mghaucl4溶于100ml双蒸水中，加热至沸腾，剧烈搅拌下快速注入1ml1％的柠檬酸钠，保持连续回流30min，冷却至室温。制备出酒红色溶液，在4℃保存，得到胶体浓度0.5nmol/l，直径50nm的aunps。

(2)制备mdpa二吡啶化合物。

首先，将2.24gn-叔丁氧羰基乙二胺和4.6g氯甲基吡啶盐酸盐溶解于50ml5mol/l的naoh水溶液，搅拌过夜；加入50ml蒸馏水并用二氯甲烷萃取，再无水na2so4干燥，通过旋蒸提纯；将粗产物通过硅胶柱使用二氯甲烷/甲醇(95:5)作为洗脱剂进一步纯化，得到产物n-叔丁氧基羰基-n,n-二氨基乙二胺，为棕黄色油状物。

其次，将1.9g上述化合物溶于15ml二氯甲烷中，冰水浴条件下将45ml的三氟乙酸用时1.5h滴加入反应并继续搅拌1.5h。旋蒸提纯后，将残余物溶于15ml2m的naoh水溶液中，用二氯甲烷萃取，最后将化合物n,n-二氨基乙二胺用无水na2so4干燥并提纯。

最后，通过edc/nhs交联法将第二化合物与巯基乙酸反应，取1g化合物悬浮于edc/nhs1:1并搅拌3h，此反应容易发生酰胺化反应，得到油状化合物二吡啶巯基乙酰胺mdpa，其核磁共振氢谱图见图1。

(3)mdpa-aunps的合成

该功能化金纳米颗粒mdpa-au主要通过自组装制备，将5ml的0.5nmol/launps和0.1ml0.1mmmdpa在室温条件下孵育1h，再将混合物以8000rpm离心5分钟以除去过量的mdpa，离心后，将下层沉淀再分散在5ml双蒸水制备出0.45nm的二吡啶巯基乙酰胺修饰的金纳米胶体，4℃的温度下保存。制备出以au-s共价键结合的化合物，当zn²⁺存在条件下，该二吡啶能有效螯合锌离子，通过荧光/拉曼双探针进行定性定量检测锌离子。图3的左图是实施例1中au-s共价键结合的双探针的透射电镜图。

(4)mdpa-aunps的优化配比

由于环境和生物样品中痕量和超痕量的zn²⁺，对mdpa-aunps的配比浓度需要选择最佳。根据实验条件制备的二吡啶巯基乙酰胺溶液的分子浓度为0.05～0.2mmol/l，金纳米胶体浓度为0.2～0.8nm，经过纯化步骤与计算分子的配比常常数，单aunps与二吡啶巯基乙酰胺的配比大约1:5000，优化条件所制备得到二吡啶巯基乙酰胺溶液的分子浓度为0.08～0.12mmol/l，金纳米胶体浓度为0.4～0.6nm，二吡啶巯基乙酰胺溶液和金纳米胶体体积比为1:20～1:100。随着mdpa用量的增加，425nm处的荧光强度和1024cm^-1处的sers强度在1:4000至1:6000的范围内保持稳定，此时二吡啶巯基乙酰胺溶液和金纳米胶体体积比为1:40～1:60。此外，mdpa-aunps与zn²⁺之间的螯合反应可以快速完成。

实施例2

(1)zn²⁺对mdpa-aunps探针的螯合

图2是实施例1中功能化金纳米颗粒随着锌离子浓度(0～10μmol/l)增加的紫外光谱图。

制备的金纳米颗粒的紫外等离子体吸收峰为520nm，图2可以看出随着锌离子的加入，与二吡啶化合物发生螯合作用，产生金纳米颗粒自团聚，同时在随着锌离子浓度达到0.1μmol/l，在680nm出现新的等离子体吸收峰。同时根据图3透射电子显微镜结果，加入0.1μmol/l锌离子之后，修饰后的金纳米颗粒发生团聚。该团聚同时能够增强拉曼增强因子，对于拉曼探针具有重要意义。

(2)zn²⁺的荧光检测

如图4所示，将4ml纳米探针于石英比色皿中，依次加入0.1μmol/l不同金属离子，以激发波长320nm进行考察；zn²⁺与cd²⁺两种离子都对荧光增强，其他无离子无增强效果，从而可定性检测分析锌离子。

(3)zn²⁺的拉曼检测

采用785nm激发波长的便携式拉曼光谱仪进行测量。将10μl不同浓度的锌离子(10^-6μmol/l,10^-5μmol/l,10^-4μmol/l,10^-3μmol/l,10^-2μmol/l,2×10^-2μmol/l,10^-1μmol/l)加入到mdpa-au纳米探针，混合均匀，然后取一滴在硅晶片上，从每个样品采集六个点测量sers信号，同时采用扣除背景、多点线性拟合校正基线，从图5可以看出，拉曼位移在1024cm^-1随着锌离子浓度增加依次增加，其荧光强度逐渐增加，最后达到饱和。

对于定量分析和痕量检测具有重要意义。

(4)zn²⁺与cd²⁺的定性区分

将1mmol/l的zn²⁺、cd²⁺、zn²⁺与cd²⁺混合溶液进行拉曼的测试分析，其sers谱图6，在拉曼位移1024cm^-1和1014cm^-1的两处代表zn²⁺与cd²⁺，同时混合后都是出现相应的两种特征峰，从而有效区分两种结构相似的离子。因此通过荧光与拉曼双探针方法能够快速、特异性检测锌离子。