本发明涉及放线菌次级代谢产物制备活性化合物领域，具体涉及一类蒽醌类化合物及其制备方法和在制备治疗癌症药物中的应用。
背景技术：
：海洋天然产物因其独特的自然环境和海洋生物独特的次级代谢产物近年来日渐成为人们研究的热点。临床用药需求从陆地天然产物正在转向海洋天然产物，可见海洋天然产物肩负着新药开发的使命面临着巨大的挑战和压力。一直以来，从陆地动植物微生物里提取的天然产物是临床药物的重要来源，例如镇痛药吗啡是从罂粟花中提取得来，强心药洋地黄毒苷来源于毛地黄，抗癌药物紫杉醇是从太平洋杉树皮和木材中分离得到。但是，90年代以来陆地来源的天然产物出新率逐年下降，重复分离到的化合物严重浪费了人力物力财力，人们开始逐渐将注意力转移到了海洋来源的天然产物。海洋这个独特的自然环境使得生活在其中的生物以特有的代谢途径进化，产生结构和生物活性上都不同于陆地生物的次级代谢产物。我们研究海洋生物次级代谢产物主要研究海洋微生物和浮游植物，绿藻，褐藻，红藻，海绵，刺胞动物，苔藓虫，软体动物，被囊动物，棘皮动物，红树林和潮间带以及各种各样的其他海洋生物群落等等。目前，已经从海洋生物中提取到了三万多种化合物。蒽醌类化合物在天然药物中存在广泛并且具有重要的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗氧化等，特别在心血管疾病、癌症、老年痴呆等疾病防治上应用广泛，研究颇多，受到全球医药人士的普遍关注。技术实现要素：本发明提供了一类结构新颖的蒽醌类化合物，均为由放线菌通过大米发酵及提纯后得到的天然产物，具有明显的抗肿瘤活性，可用于开发抗肿瘤药物。具体技术方案如下：一类蒽醌类化合物，结构式分别如下式(i)或下式(ⅱ)所示：所述蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；所述放线菌，采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的streptomycesrimosussubsp.paromomycinusnrrl2455；2)将所述种子液接种于大米培养基中，静置培养，经有机溶剂浸提后获得发酵产物粗提物；3)将所述发酵产物粗提物进行分离纯化，分别获得如式(i)或式(ⅱ)结构的蒽醌类化合物。本发明公开的两种蒽醌类化合物为从放线菌次级代谢产物中分离得到，其结构为天然产物中首次发现。两种化合物的成功提取为该类化合物的开发提供了新的资源。同时，放线菌在实验室环境下易于培养，可通过大规模发酵的方式富集该化合物。优选地，步骤1)中，所述的摇床培养的条件为：26～30℃下，150～250rpm摇床中培养3～5天；进一步优选在28℃下，180rpm的摇床中培养。优选地，步骤2)中，所述的大米培养基，由大米和海盐水(海盐水的质量浓度为25‰)配制而成，大米的质量和海盐水的体积之比为30g～50g：50ml～70ml；进一步优选为40g大米：60ml海盐水。所述的接种量为：每40g大米接种5～15ml种子液；进一步优选，每40g大米接种10ml种子液。优选地，步骤2)中，所述的静置培养的条件为：25～35℃，静置培养20～50天；进一步优选在28℃下静置培养30天。所述有机溶剂选自乙酸乙酯，经乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩得到粗提物。优选地，步骤3)中，所述分离纯化，具体为：(a)发酵产物粗提物使用硅胶柱色谱分离，填料为硅胶，先用甲醇体积百分数为0％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；将包含目的化合物的组分合并后，使用硅胶柱色谱纯化，再用甲醇体积百分数为50％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；(b)将包含目的化合物的组分合并后，使用凝胶柱色谱纯化，填料为羟丙基葡聚糖凝胶，并用甲醇体积百分数为50％的二氯甲烷-甲醇体系等度洗脱；(c)将包含目的化合物的组分合并后，使用高效制备液相色谱纯化；所述高效制备液相色谱的填料为十八烷基键合硅胶；采用甲醇体积百分数为70％～100％的甲醇-0.05％三氟乙酸水溶液进行梯度洗脱，洗脱时间为30min，收集洗脱产物得到如式(i)结构的蒽醌类化合物；采用甲醇体积百分数为80％的甲醇水溶液进行等度洗脱，收集洗脱产物得到如式(ⅱ)结构的蒽醌类化合物。采用上述的制备工艺可以高产率、高纯度的分别获得如式(i)、(ii)所示的蒽醌类化合物。本发明公开的蒽醌类化合物，结构特点是包括蒽环母核或者和c-3、c-4位的糖基取代。为进一步测试本发明制备的蒽醌类化合物的活性，采用人前列腺癌细胞株pc3细胞和人结肠癌细胞株sw620细胞对其进行活性评价，结果显示：具有式(i)结构的蒽醌类化合物对人前列腺癌细胞株pc3细胞的ic50值为2.1μm，对人结肠癌细胞株sw620细胞的ic50值为2.5μm；具有式(ii)结构的蒽醌类化合物对人前列腺癌细胞株pc3细胞的ic50值9.8μm，对人结肠癌细胞株sw620细胞的ic50值为大于10μm。说明两种蒽醌类化合物均对人前列腺癌细胞株pc3细胞和人结肠癌细胞株sw620细胞均具有显著的增殖抑制作用，因此可用来进一步研发抗肿瘤药物。因此，本发明还公开了上述蒽醌类化合物在制备治疗癌症药物中的应用，所述癌症包括前列腺癌、淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、神经细胞瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明公开了两种结构新颖的蒽醌类化合物，均由放线菌通过大米发酵及提纯后得到，其结构为天然产物中首次发现；该蒽环霉素类化合物具有明显的抗肿瘤活性，尤其是对于人前列腺癌细胞株pc3细胞和人结肠癌细胞株sw620细胞均具有显著的增殖抑制作用，可用于开发治疗癌症的药物。具体实施方式菌种来源本发明海洋放线菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)(北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼)的streptomycesrimosussubsp.paromomycinusnrrl2455，订购网址：http://www.china-cicc.org/。培养基高氏一号液体培养基：以发酵培养基1l计，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，加水至1l，调ph7.2。大米固体培养基：40g大米，60ml海盐水(25g海盐：1000ml水)。实施例11、种子液将链霉菌streptomycesrimosussubsp.paromomycinusnrrl2455接种于含有250ml高氏一号液体培养基的500ml锥形瓶中，在摇床中(28℃，180rpm)振荡培养3-5天，获得种子液。2、发酵以每瓶接种10ml的量将上述种子液接种到大米固体培养基中，在28℃条件下静置培养30天后终止发酵。3、粗提每瓶固体发酵物用ea(乙酸乙酯)约300ml浸泡过夜，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)。4、化合物分离(a)粗提物使用硅胶柱色谱纯化，然后用甲醇体积百分数为0％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；将包含目的化合物的组分合并后，使用硅胶柱色谱纯化，再用甲醇体积百分数为50％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；(b)将包含目的化合物的组分合并后，使用凝胶柱色谱纯化，并用二氯甲烷-甲醇(1:1)体系洗脱；(c)将包含目的化合物的组分合并后，使用高效制备液相色谱纯化获得所述蒽醌类化合物；填料为十八烷基键合硅胶；采用甲醇体积百分数为70％～100％的甲醇-0.05％三氟乙酸水溶液进行梯度洗脱，洗脱时间为30min，收集洗脱产物。将本实施例分离纯化到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms推测为c27h25no7([m+h]+,476.1710；理论值c27h26no7,476.1709)。结构式如下式所示。红外光谱吸收为：2933cm-1,1677cm-1,1583cm-1。该化合物的核磁共振数据如下表1所示，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz。表1实施例21、种子液将链霉菌streptomycesrimosussubsp.paromomycinusnrrl2455接种于含有250ml高氏一号液体培养基的500ml锥形瓶中，在摇床中(28℃，180rpm)振荡培养3-5天，获得种子液。2、发酵以每瓶接种10ml的量将上述种子液接种到大米固体培养基中，在28℃条件下静置培养30天后终止发酵。3、粗提每瓶固体发酵物用ea(乙酸乙酯)约300ml浸泡过夜，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)。4、化合物分离(a)粗提物使用硅胶柱色谱纯化，然后用甲醇体积百分数为0％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；将包含目的化合物的组分合并后，使用硅胶柱色谱纯化，再用甲醇体积百分数为50％～100％的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱；(b)将包含目的化合物的组分合并后，使用凝胶柱色谱纯化，并用二氯甲烷-甲醇(1:1)体系洗脱；(c)将包含目的化合物的组分合并后，使用高效制备液相色谱纯化获得所述蒽醌类化合物；填料为十八烷基键合硅胶；采用甲醇体积百分数为80％的甲醇水溶液进行等度洗脱，收集洗脱产物。将本实施例分离纯化到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms推测为c17h14o5([m+na]+,321.0730；理论值c17h14o5na,321.0739)。结构式如下式所示。红外光谱吸收为：3438cm-1,2928cm-1,1623cm-1。该化合物的核磁共振数据如下表2所示，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz。表2活性测试：采用srb方法检测实施例1-2分别纯化得到的两种蒽醌类化合物对人前列腺癌细胞株pc3细胞和人结肠癌细胞株sw620细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/ml，以100μl/孔铺于96孔培养板，co2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于co2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μl4℃冰箱预冷的10％的三氯醋酸(tca)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μlsrb溶液，室温放置20分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的srb用100μl/孔10mmol/ltris碱液(ph＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔od值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(od515给药孔/od515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度ic50。结果如下表3所示。表3细胞pc3(μm)sw620(μm)12.12.529.8>10本发明公开了一种蒽醌类化合物及其制备方法和应用。所述化合物为从一种放线菌中分离纯化获得，经鉴定为一种蒽醌类化合物。经实验证明该化合物对人前列腺癌细胞和人结肠癌细胞具有中等抑制作用，对人前列腺癌细胞株pc3细胞的ic50值分别为2.1和9.8μm，对人结肠癌细胞株sw620细胞的ic50值分别为2.5和>10μm。本发明化合物在制备治疗癌症的药物方面具有良好的应用前景。当前第1页12