一种用于检测人类SEPTIN9甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测人类septin9甲基化突变的多重荧光pcr检测试剂盒。
背景技术：
：septin9是septin基因家族成员之一，与细胞分裂、细胞极化、胞吐作用、细胞迁徙、dna修复等多种细胞功能有关。研究表明，septin9基因在结直肠肿瘤组织中高度甲基化，其甲基化异常是结直肠癌重要的表观遗传学改变。通过检测外周血血浆中septin9基因的甲基化状态，能够有效的提高早期结直肠癌的检出率，提高患者的生存率。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测人类septin9甲基化突变的多重荧光pcr检测试剂盒。本发明的技术方案如下：一种用于检测人类septin9甲基化突变的多重荧光pcr检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由septin9-f和septin9-r组成，依次包括如seqidno01和02所示的序列；第一检测探针为septin9-p，包括如seqidno03所示的序列；第二检测引物对由actb-f和actb-r组成，依次包括如seqidno04和05所示的序列；第二检测探针为actb-p，包括如seqidno06所示的序列；该多重荧光pcr检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×pcr缓冲液、mgcl2、dntps、taq酶、模板和h2o；上述模板的dna甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光pcr检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。在本发明的一个优选实施方案中，所述第一荧光报告基团为fam，所述第一荧光猝灭基团为bhq1，所述第二荧光报告基团为hex、rox或vic，第二荧光猝灭基团为bhq1。进一步优选的，所述septin9-f如seqidno01所示。进一步优选的，所述septin9-r如seqidno02所示。进一步优选的，所述septin9-p如seqidno03所示。进一步优选的，所述actb-f如seqidno04所示。进一步优选的，所述actb-r如seqidno05所示。进一步优选的，所述actb-p如seqidno06所示。上述引物及探针具体序列如下表所示：引物和探针序列(5-3)septin9-ftatgttggattttgtggttaacacseptin9-rtttattagttattatgtcggatttcacseptin9-p-famfam-aaggtgggtgttgggttggttgt-bhq1actb-ftatttagagtgtaggtgtgtggagatactb-raacaaaaacctaacccctaaaccactb-phex-ccccaccctctaaaactactcaatatca-bhq1本发明的有益效果：本发明以人类septin9甲基化突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地测septin9甲基化突变，且对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段dna依然具有与新鲜组织样品dna同样的扩增和检测能力。附图说明图1为本发明实施例2中检测septin9甲基化突变阴性的样品检测曲线图。图2为本发明实施例2中检测septin9甲基化突变阳性的样品检测曲线图。图3为本发明实施例2中的荧光pcr的反应条件图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测人类septin9甲基化突变的多重荧光pcr检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中第一检测引物对由septin9-f和septin9-r组成，依次如seqidno01和02所示；第一检测探针为septin9-p，如seqidno03所示；第二检测引物对由actb-f和actb-r组成，依次如seqidno04和05所示；第二检测探针为actb-p，如seqidno06所示；该多重荧光pcr检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1xpcr缓冲液、mgcl2、dntps、taq酶、模板和h2o；上述模板的dna甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；该多重荧光pcr检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。所述第一荧光报告基团为fam，所述第一荧光猝灭基团为bhq1，所述第二荧光报告基团为hex、rox或vic，第二荧光猝灭基团为bhq1。上述引物及探针具体序列如下表1所示：表1引物和探针序列(5-3)septin9-ftatgttggattttgtggttaacacseptin9-rtttattagttattatgtcggatttcacseptin9-p-famfam-aaggtgggtgttgggttggttgt-bhq1actb-ftatttagagtgtaggtgtgtggagatactb-raacaaaaacctaacccctaaaccactb-phex-ccccaccctctaaaactactcaatatca-bhq1本发明(包括下述实施例)的上述模板的dna甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化，具体如下：1.取0.5μl修饰剂c溶液加至修饰剂a溶液中，并将溶解完全的修饰剂b溶液全部加至修饰剂a溶液中，震荡混匀，配制成修饰缓冲液，避光放置待用。2.取基因组dna2gg，于1.5mlep管中，并以纯化水补足体积至36μl。3.加入4μl修饰剂c溶液，置于37℃金属浴或水浴锅保温反应，静置10min；或置于室温反应15min。4.加入600μl上述新鲜配制的修饰缓冲液，置于65℃金属浴或水浴锅，避光反应2小时。5.加入600μl吸附缓冲液，轻微涡旋振荡10s，轻微离心，室温静置3min。6.加入-20℃预冷的无水乙醇300μl，轻柔颠倒混匀，静置3min，轻微离心。7.转移液体至硅胶吸附柱中，8000rpm离心30s，硅胶吸附柱每次最多可加入溶液750μl，弃去滤液，随后将剩余溶液转移至硅胶吸附柱中，8000rpm离心30s，弃去滤液。(注：为提高吸附效率，离心后可将滤液再次转移至硅胶吸附柱中，重复过柱)8.向硅胶吸附柱中加入500μl漂洗液i(使用前检查是否已加入无水乙醇，需加入10ml常温无水乙醇)，8000rpm离心30s，弃去滤液。9.向硅胶吸附柱中加入500μl漂洗液ii(使用前检查是否已加入无水乙醇，需加入18ml常温无水乙醇)，8000rpm离心30s，弃去滤液。10.重复上述步骤8操作。11.空离硅胶吸附柱，12000rpm离心2min，将硅胶吸附柱转移至新的1.5mlep管中，打开硅胶吸附柱管盖，室温自然晾干3～5min。12.向硅胶吸附柱正上方滴加50μl洗脱&溶解缓冲液(枪头切勿触碰到吸附膜，悬空加入)，室温静置5min，12000rpm离心2min，收集滤液至1.5ml离心管中。(注：为提高回收效率，可将洗脱液体再次转移至硅胶吸附柱，进行二次洗脱)13.加入5.5μl上述修饰剂c溶液，室温放置5min。加入50μl中和试剂，室温静置5min，用于中和碱溶液，最后获得本发明的模板。上述各试剂的具体组分如下表2所示：表2实施例1本发明以人类septin9甲基化突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地检测septin9甲基化突变，而且检测突变的能力高达1％。野生型细胞系的基因组dna为野生型模板，以septin9甲基化突变质粒为阳性对照模板，建立多重荧光pcr检测septin9甲基化突变的反应体系。此方法主要包括以下步骤：(1)根据cosmic数据公布的人类septin9区的野生型基因序列和甲基化突变基因序列，设计高特异性修饰性引物和特异性荧光探针。(2)多重荧光pcr扩增反应体系配制并上机检测。(3)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需要的循环次数ct值作为结果判断的标准。步骤(1)中根据cosmic数据公布的人类septin9的野生型基因序列和甲基化突变基因序列，设计高特异性修饰引物和特异性荧光探针，详见实施例1的表1。步骤(2)的多重荧光pcr扩增反应体系如下表3所示：表3以上试剂组分：1×pcr缓冲液，mgcl2，taq酶，dntp均购自中国大连宝生物公司。所述荧光pcr的反应条件是95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测fam和hex荧光信号。步骤(3)检测fam和hex荧光信号的ct值，是采用mx3000p荧光pcr扩增仪或mx3005p荧光pcr扩增仪或abi7500荧光pcr扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光pcr扩增仪显示的ct值判断结果：检测反应体系的fam和hex荧光强度，以hex信号达到设定阈值(ct＞18)时表明上样dna量在允许范围内，fam信号结果可信；以fam达到设定的阈值时所需要的循环次数ct值作为阴阳性判断的标准，ct值为0或30：阴性；ct小于30：阳性。检测septin9甲基化突变阴性的样品的结果如图1所示，检测septin9甲基化突变的样品的结果如图2所示实施例2本实施例中以septin9甲基化突变为例来分析本发明的多重荧光pcr检测septin9甲基化突变的方法。实验用2个质粒，分别为septin9甲基化阴性质粒和septin9甲基化阳性质粒质粒；25份正常一代测序验证过的甲基化阴性样本，25份一代测序验证septin9甲基化阳性的临床结直肠癌石蜡切片样品。利用上述荧光pcr检测septin9区甲基化的方法包括以下步骤：(1)样品处理和模板提取质控：样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用qiagen公司组织dna提取试剂盒提取基因组dna，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用qiagen公司石蜡包埋dna提取试剂盒提取基因组dna，具体步骤按试剂盒操作说明。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l，ph8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用tris-hcl溶液(10mmol/l，ph8.0)调整dna浓度到100ng/μl或2ng/μl作为pcr扩增的模板。(2)荧光pcr扩增，配制反应体系：序号物料物料浓度用量(μl)11×pcr缓冲液1×102mgcl225mm83dntps10mm54septin9-f50μm0.155septin9-r50mm0.126septin9-p50mm0.157actb-f50mm0.158actb-r50mm0.159actb-p50mm0.110taq酶5u0.511h2o纯化水20.6812dna模板2ng/ul513总体积50所述荧光pcr的反应条件如图3所示，95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸10s，30个循环。(3)检测：采用mx3000p实时pcr扩增仪(stratagene公司)后30个循环退火阶段检测fam和hex荧光信号，一次可以检测94份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光pcr扩增仪显示的ct值判断结果：检测反应体系的fam和hex荧光强度，以hex信号达到设定阈值(ct＞18)时表明上样dna量在允许范围内，fam信号结果可信；以fam达到设定的阈值时所需要的循环次数ct值作为阴阳性判断的标准，ct值为0或30：阴性；ct小于30：阳性。前述25份一代测序验证过septin9甲基化阴性的样本经本发明的体系检测，只有阳性对照品有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光pcr的特异性。灵敏度分析：将甲基化突变质粒从10的4次方连续10倍梯度稀释，分别为10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反应加入5μldna。结果表明本发明的荧光pcr方法的灵敏度高，5拷贝dna基因组即可检出。选择性能力分析：固定每次pcr反应总dna用量，100ng/反应和10ng/反应。先将甲基化突变质粒dna和野生型细胞系dna浓度都调整为20ng/μl和2ng/μl。这样每个反应加5μl模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟dna模板。a：50％即为10的3次方甲基化突变细胞dna。b：30％取a液60μl后混入40μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。c：20％取a液40μl后混入60μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。d：15％取b液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。e：10％取c液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。f：5％取e液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。g：1％取f液20μl后混入80μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。h：0.5％取g液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。i：0.1％取h液20μl后混入80μl10的3次方甲基化突变细胞dna，震荡混均。结果表明本发明的荧光pcr方法的选择性检测能力为在10ng总dna中可以检出5拷贝的突变dna，检测能力为1％。重复性试验：每个反应分别加入突变甲基化质粒dna10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光pcr扩增，10次ct值相差不到0.1个循环。收集手术切除的结直肠癌标本共25例。对于甲基化突变，本发明检测结果与dna测序结果完全一致：25例样品中有6例发生septin9甲基化突变，19例均为野生型。本发明多重荧光pcr反应就可以同时检测septin9基因甲基化突变，因此本发明准、简单、快捷可满足突变的快速诊断。而且，多重荧光pcr方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光pcr灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品dna中含1％的突变dna即可检出。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。序列表<110>厦门飞朔生物技术有限公司<120>一种用于检测人类septin9甲基化突变的多重荧光pcr检测试剂盒<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>homosapiens<400>1tatgttggattttgtggttaacac24<210>2<211>27<212>dna<213>homosapiens<400>2tttattagttattatgtcggatttcac27<210>3<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>3aaggtgggtgttgggttggttgt23<210>4<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>4tatttagagtgtaggtgtgtggagat26<210>5<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>5aacaaaaacctaacccctaaacc23<210>6<211>28<212>dna<213>homosapiens<400>6ccccaccctctaaaactactcaatatca28当前第1页12