本发明涉及(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)或(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)或两者的混合物、(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)或(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)或两者的混合物等腙类化合物对尿素酶的抑制活性以及在抗胃溃疡、抗十二指肠溃疡、抗胃炎中的应用。
背景技术：
目前随着社会发展以及人们生活方式的变化，由于吸烟、饮酒、情绪紧张、药物刺激、幽门螺旋杆菌感染等因素引起的消化性溃疡发病率逐渐增高，成为一种常见病和多发病，给患者带来极大的痛苦。
质子泵抑制剂(protonpumpinhibitors,ppis)是目前治疗消化性溃疡最先进的一类药物(lih,mengl,liuf,etal.h+/k+-atpaseinhibitors:apatentreview.expertopintherpatents,2013,23:99–111)。胃酸是引起消化性溃疡及其他消化性疾病的重要因素之一，迅速强效地抑制胃酸分泌是目前治疗消化性溃疡的重要手段。胃酸分泌的最后步骤是胃壁细胞内质子泵(h+,k+-atp酶)驱动细胞内h+与小管内k+交换。ppis作用于关键靶点h+,k+-atp酶，阻断了胃酸分泌的最后通道，所以能抑制组胺、乙酰胆碱、胃泌素和食物刺激等各种因素引起的酸分泌，并且抑酸作用强，特异性高，持续时间长久(许国铭，钟捷.质子泵抑制剂——基础与临床.上海:上海科技教育出版社，2004)。
但使用质子泵抑制剂进行抑酸治疗后，消化性溃疡很容易卷土重来，反复发作。1984年澳大利亚科学家巴里·马歇尔(barryjmarshall)和罗宾·沃伦(j.robinwarren)提出幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，hp)涉及胃炎和消化性溃疡的病因学，并获得2005年诺贝尔生理学或医学奖。幽门螺旋杆菌是寄居在人体胃部的一种革兰氏阴性菌，是胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的主要治病因子，并被世界卫生组织列为导致胃癌的主要因素。幽门螺旋杆菌非常容易感染，我国普通人群中hp检出率相当高，hp感染率达55％(胡伏莲.幽门螺杆菌感染的流行病学.中国医刊，2007,42(2)：17-18)。超过90％的十二指肠溃疡和80％左右的胃溃疡是hp所致。目前治疗幽门螺旋杆菌感染通常采用三联疗法(1种质子泵抑制剂或胶体铋剂+2种抗生素)或四联疗法(1种质子泵抑制剂+胶体铋剂+2种抗生素)。但该疗法服药时间较长，容易产生上腹胀痛、抗生素耐药等副作用，并且用药成本较高。
幽门螺旋杆菌中的尿素酶(urease)是一种能催化尿素分解成氨气和二氧化碳的水解酶,使胃酸中氨浓度增加，从而中和部分胃酸并在细菌表面形成一层接近中性的液膜，为幽门螺旋杆菌提供适宜的微环境,进而使幽门螺旋杆菌能够在胃部强酸性的环境下存活下来(krajewskab.ureasesi.functional,catalyticandkineticproperties:areview.jmolcatalbenzym,2009,59(1):9-21)。因此，尿素酶近年来已成为抗幽门螺旋杆菌药物设计的重要靶点。如果将质子泵抑制剂和尿素酶抑制剂合二为一，发明新型的尿素酶和质子泵双重抑制剂，将不失为一条新的治疗途径。
2018年she等报道了(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇类化合物对质子泵的作用机理和较好的抑制活性(shexx,dongq,luohj,etal.moleculardocking,bindingfreeenergyanalysis,andbiologicalevaluationofbisabolonalonehydrazonecarboxamidesash+,k+-atpasereversibleinhibitors.medchemres,2018,27(1):332-340)。
本发明以计算机辅助药物设计为指导，筛选出尿素酶抑制剂(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)或(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)或两者的混合物、(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)或(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)或两者的混合物等腙类化合物，并测定了对尿素酶的抑制活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型高活性尿素酶抑制剂(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)或(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)或两者的混合物、(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)或(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)或两者的混合物，该类化合物的结构式为：
1、(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)和(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)的混合物(各占50％)的结构鉴定
白色固体；m.p.114-116℃；ms(esi)m/z:291.19(m+na)+；ir:νmax/cm-1(kbr)3456,2955,2868,1639,1462,1385,1165,1098,1038,985；1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:5.08(s,1h),4.23–4.10(m,1h),3.44(dd,j＝6.9,5.3hz,1h),2.89(d,j＝9.1hz,1h),2.71(d,j＝9.2hz,1h),2.59–2.45(m,1h),2.16–1.94(m,2h),1.69(dd,j＝22.3,8.7hz,1h),1.62–1.44(m,7h),1.38(s,1h),1.32(s,3h),1.29–1.21(m,3h),1.02(d,j＝6.3hz,3h),0.90(dd,j＝6.4,2.4hz,7h)；13cnmr(cdcl3,100mhz)δ:152.89,86.75,80.13,76.42,52.84,39.52,36.13,36.02,33.24,28.28,26.72,26.35,24.40,22.57,22.47,21.99.
2、(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)和(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)的混合物(各占50％)的结构鉴定
白色固体；m.p.99-101℃；ms(esi)m/z:289.17(m+na)+；ir:νmax/cm-1(kbr)3456,2955,2868,1639,1462,1385,1165,1098,1038,985；1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:5.12(s,2h),4.47(ddd,j＝14.9,9.9,5.1hz,2h),3.01(s,1h),2.68(d,j＝7.6hz,1h),2.59–2.46(m,1h),2.06–2.01(m,1h),1.94(t,j＝7.1hz,2h),1.76–1.48(m,6h),1.43(s,3h),1.26(d,j＝11.0hz,2h),1.04(d,j＝6.0hz,4h),0.88(dd,j＝4.2,2.5hz,6h)；13cnmr(cdcl3,100mhz)δ:160.52,152.00,94.72,78.45,78.29,51.62,37.47,33.72,32.49,28.78,26.73,26.62,22.36,22.19,21.73.
3、尿素酶抑制活性测定
(1)幽门螺旋杆菌菌株培养
将幽门螺旋杆菌接种在含有马血清(10％)的布氏肉汤培养基中，在微氧条件下在(85％n2，10％co2和5％o2)37℃培养24h。
(2)幽门螺旋杆菌尿素酶的制备
取培养好的幽门螺旋杆菌菌液，5000g4℃离心15min，收集幽门螺旋杆菌，用ph7.4的磷酸缓冲液洗涤3次，将幽门螺旋杆菌置于-80℃下保存24h，然后取出恢复至室温，加入3ml蒸馏水和蛋白酶抑制剂，超声1min，12000g4℃离心10min，上层清液经sephadexg-25层析柱除盐，往粗酶中加入等体积的甘油，并在4℃储存，用于活性测定。
(3)尿素酶半数抑制浓度测定
尿素酶的活性测试参照weatherburn报道的方法进行。具体步骤如下：在96孔板中加入25μl尿素酶溶液(10u/ml)，25μl受试化合物(浓度根据实验设定，用dmso-磷酸缓冲溶液配制)，在37℃下共培养30min，加入50μl含尿素25mmol的磷酸盐缓冲溶液，在37℃下共培养30min，然后加入50μla试剂(127mm苯酚和0.168mm硝普钠)和50μlb试剂(125mmnaoh和11.3mmnaocl)，在37℃下共培养30min，在620nm下测定吸光度值。另设空白组、正常对照组、阳性对照组(乙酰氧肟酸)，由此计算出抑制剂的抑制率及半数抑制浓度ic50。
(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)和(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)的混合物(各占50％)对尿素酶的ic50值为0.79μm，(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)和(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)的混合物(各占50％)对尿素酶的ic50值为0.78μm。
结论：(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)或(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)或两者的混合物、(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)或(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)或两者的混合物是一类新型高效的尿素酶抑制剂，可应用于胃溃疡、胃炎的治疗之中。
具体实施方式
实施例1：
在96孔板中加入25μl尿素酶溶液(10u/ml)，25μl(3r,3ar,6s,7as,e)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(1)和(3r,3ar,6s,7as,z)-4-肼-2-异戊基-3，6-二甲基八氢苯并呋喃-3-醇(2)的混合物(各占50％)(0.25μm、0.50μm、1.00μm、2.00μm、4.00μm，用dmso-磷酸缓冲溶液配制)，在37℃下共培养30min，加入50μl含尿素25mmol的磷酸盐缓冲溶液，在37℃下共培养30min，然后加入50μla试剂(127mm苯酚和0.168mm硝普钠)和50μlb试剂(125mmnaoh和11.3mmnaocl)，在37℃下共培养30min，在620nm下测定吸光度值。另设空白组、正常对照组、阳性对照组(乙酰氧肟酸)，计算出抑制剂对尿素酶的半数抑制浓度ic50为0.79μm，阳性对照组乙酰氧肟酸ic50为18.2μm。
实施例2：
在96孔板中加入25μl尿素酶溶液(10u/ml)，25μl(2z,3r,3ar,4e,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(3)和(2z,3r,3ar,4z,6s,7as)-4-肼-3，6-二甲基-2-(3-甲基丁烯基)八氢苯并呋喃-3-醇(4)的混合物(各占50％)(0.25μm、0.50μm、1.00μm、2.00μm、4.00μm，用dmso-磷酸缓冲溶液配制)，在37℃下共培养30min，加入50μl含尿素25mmol的磷酸盐缓冲溶液，在37℃下共培养30min，然后加入50μla试剂(127mm苯酚和0.168mm硝普钠)和50μlb试剂(125mmnaoh和11.3mmnaocl)，在37℃下共培养30min，在620nm下测定吸光度值。另设空白组、正常对照组、阳性对照组(乙酰氧肟酸)，计算出抑制剂对尿素酶的半数抑制浓度ic50为0.78μm，阳性对照组乙酰氧肟酸ic50为18.2μm。