一种含有ECRG4mRNA的外泌体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种含有ecrg4mrna的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma，oscc）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，探索安全高效的治疗方案是医学研究的热点。人食道癌相关基因4（esophagealcancerrelatedgene4，ecrg4)是运用mrna差异显示技术，从正常人食道上皮克隆的具有广泛肿瘤抑制功能的肿瘤抑制基因。ecrg4广泛分布在人体多种组织器官，包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰腺等。在食道癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌等许多肿瘤的发生过程中，ecrg4表达量明显下调，并且其表达水平与肿瘤病人的预后呈正相关。实验证明：恢复ecrg4的表达在体外可抑制胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞的增殖及迁移，并在体内抑制多种移植瘤的生长及转移。因此，通过基因运送技术提高肿瘤细胞ecrg4的表达量，将具有潜在的治疗价值。

外泌体(exosome)是细胞分泌的，直径约30-150nm的膜性小体。人体内几乎所有的细胞都能分泌外泌体，外泌体也存在于所有体液中。外泌体的形成过程如下：细胞中的内含体的膜内陷，同时选择性地包裹胞浆中的蛋白质，脂质，及mirna、mrna、dna、lncrna等核酸并形成膜性小体，当内含体与细胞膜融合时，膜性小体被释放到胞外进入体循环，该膜性小体即为外泌体。外泌体通过与受体细胞结合，将外泌体的内容物释放到受体细胞，从而介导‘细胞-细胞’之间的信号传递及遗传物质的交换，进而影响受体细胞疾病的发生发展过程。研究发现，外泌体通过一种类似于病毒侵入细胞的高效机制进入受体细胞，并且外泌体具有良好的生物分布和生物相容性，天然，稳定，纳米尺寸，可穿透生物屏障，低免疫源性，还可以携带单一或随意组合的治疗制剂，是理想的基因运送载体。

本发明前期研究发现，人血清外泌体中含有全长的ecrg4mrna，并且口腔鳞癌病人血清外泌体中ecrg4mrna的表达量显著低于健康人，提示血清外泌体中ecrg4mrna表达量的降低与肿瘤的发生关系密切，提高血清外泌体中ecrg4mrna具有潜在的肿瘤抑制作用。但外源的mrna直接进入血液中很容易被血液中的核酸酶降解，因此需要借助于基因运送载体。目前，传统的基因运送载体主要包括病毒载体或非病毒载体系统，存在着载体毒性、失靶现象、低效基因运送、体内生物半衰期短及引起炎症和免疫反应等缺陷，严重影响基因治疗的安全性和有效性，需要寻找开发一种更加安全、高效的基因运送载体。由于外泌体具有天然稳定，纳米尺寸，无免疫原性，无细胞毒性，能越过生物屏障等优良特性，外泌体作为基因运送载体将具有巨大的应用价值。

由于外泌体是细胞自身分泌的，并在形成过程中选择性包裹胞浆中的信号分子，但其选择性机制并不清楚。因此，如何将有治疗价值的基因载入外泌体是一个技术难点。将外源基因装载到外泌体中，主要有以下四种方法：（1）电穿孔法：将体外合成的外源基因通过电穿孔的方式导入外泌体中；（2）反复冻融法：将外泌体与外源基因混合后反复冻融将其包装到外泌体中；（3）直接转染法：采用转染试剂如lipofectamine直接将体外合成的外源基因转染到外泌体中；（4）间接转染法：将外源基因克隆到表达载体中，转染外泌体“发生细胞”，使目的基因在“发生细胞”过表达，胞浆中过表达的外源基因在外泌体的发生过程中就被包装到外泌体中。

前三种方法主要通过一定的刺激因素改变外泌体的物理结构，从而使外泌体被动装载外源基因，这种方法存在着改变外泌体形态结构的巨大风险，并且包装效率有限。而第4种方法由于每种基因在不同细胞中的表达方式、效果、限制因素等的不同，要将不同基因载入外泌体，需要根据基因的种类、“发生细胞”的种类及培养方法、培养环境等进行针对性选择，才可能得到装载基因数量多、表达稳定性好，相容性好、适用性好的外泌体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种装载有大量ecrg4mrna的外泌体，并提供了该外泌体的具体制备方法和在基因治疗上的相关应用。本发明外泌体中装载有大量ecrg4mrna，并能将其运送至受体细胞，从而能显著提高受体细胞中ecrg4的表达水平，进而抑制肿瘤细胞增殖/生长、血管新生、炎症反应相关基因的表达；同时，由于该外泌体与受体细胞的相容性很好，不会引起受体的免疫反应和炎症反应，能显著降低基因治疗的毒副作用；尤其是该外泌体能显著抑制口腔鳞癌的增殖生长，也可用于抑制食道癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞的生长；对肿瘤治疗具有积极作用。

为达到上述发明目的，本发明提供了一种外泌体，该外泌体装载有过表达ecrg4基因的细胞生成的ecrg4mrna；其中，所述的ecrg4mrna包括了完整的ecrg4编码基因。

本发明提供了一种外泌体，该外泌体通过过表达ecrg4基因的细胞分泌而形成，其内装载有大量的ecrg4mrna，通过外泌体与受体细胞的优异相容性，能将装载的大量ecrg4mrna运送至受体细胞，显著提高受体细胞中ecrg4的表达量，从而能显著抑制肿瘤细胞的生长和增殖；且不会引起受体的免疫反应和炎症反应；因此，装载有大量ecrg4mrna的外泌体的出现对探索基因治疗肿瘤的方法具有极大的促进和指导作用。

上述外泌体，其中，所述过表达ecrg4的细胞为ecrg4基因被大量的转录和翻译，因此ecrg4基因表达产物超过正常水平的细胞。

上述外泌体中装载的ecrg4mrna量不低于常规外泌体的1000倍；外泌体中ecrg4mrna的含量越高，则对受体细胞中ecrg4表达水平的增强作用越好，对肿瘤细胞的抑制效果越好；所述常规外泌体是指未过表达ecrg4基因的正常细胞分泌的外泌体。

上述外泌体，其中，优选的，所述的过表达ecrg4的细胞为ecrg4-hek293细胞系；该细胞系能稳定的过表达ecrg4，从而分泌得到含有大量ecrg4mrna的外泌体。

其中，优选的，所述的ecrg4-hek293细胞系是通过以下制备方法制备得到的：

a、plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒构建：提取总rna，用逆转录pcr扩增ecrg4基因，将ecrg4基因装载到plvx-ires-zsgreen1载体上，得到plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒；

b、慢病毒的制备：用含有pmd2.g、pspax2和plvx-ires-zsgreen1-ecrg4三种质粒的第一混合液对hek293t细胞进行转染；培养转染后的hek293t细胞，收集培养液，对培养液进行处理得到包装有ecrg4基因的慢病毒；

c、ecrg4-hek293细胞系的建立：用含有慢病毒、dmem培养基和聚凝胺的第二混合液对hek293细胞进行感染；将感染后的hek293细胞进行培养，通过细胞分选，得到ecrg4-hek293细胞系。

通过上述方法制备得到的ecrg4-hek293细胞系能持续稳定的过表达ecrg4，过表达稳定性更好，得到的外泌体中ecrg4mrna的含量更高，从源头上解决了含有大量ecrg4mrna的外泌体的来源问题，有利于含有ecrg4mrna的外泌体的大规模，标准化生产。

其中，优选的，步骤a中，提取总rna的方法为：用trizol法从人体细胞中提取得到总rna。

其中，优选的，步骤a中，在用逆转录pcr扩增ecrg4基因时，所采用的ecrg4引物是以人ecrg4基因序列（genbank:af325503.1）为模板设计的，上游引物包含xhoi酶切位点，下游引物包含bamhi酶切位点。上游引物碱基序列为：5’-atgactcgagtgctcgcgccccgccgccatg-3’；下游引物碱基序列为：5’-tcatggatcctgtggcaagtcatggttagt-3’。

其中，步骤a中使用的慢病毒载体plvx-ires-zsgreen1是包含有zsgreen1编码基因的双顺反子载体。zsgreen1是第三代绿色荧光蛋白，是亮度最高的荧光蛋白，便于细胞转染效率的监测和流式分选阳性细胞。plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒以双顺反子的形式同时表达zsgreen1荧光蛋白和ecrg4基因，zsgreen1荧光蛋白的表达可作为目的基因表达的间接“指示剂”，并且zsgreen1荧光蛋白不与目的蛋白融合，不影响目的蛋白的正常表达，不影响目的蛋白的正常结构和功能。

其中，优选的，步骤a中，将ecrg4基因载入到plvx-ires-zsgreen1载体上的方法为：将ecrg4基因及plvx-ires-zsgreen1载体都用xhoi和bamhi进行双酶切后，用t4dna连接酶进行连接。

其中，优选的，步骤a中，用细菌转化的方法对plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒进行增殖；具体的方法为：将plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒。

其中，优选的，步骤b中，在对hek293t细胞进行转染前2-6h，可换成无抗生素的dmem培养基（含10%fbs）对hek293t细胞进行培养，能使细胞处于更好的生长状态，从而提高转染效果。

其中，优选的，步骤b中，在用第一混合液对hek293t细胞进行转染时，可用lipofectamine2000进行转染；该优选既能保证较高的转染效率，又能降低转染试剂对细胞活力的影响。

其中，步骤b中，所述的pmd2.g和pspax2均为慢病毒组装质粒；所述的plvx-ires-zsgreen1-ecrg4为ecrg4编码质粒；优选的，所述的第一混合液中pmd2.g、pspax2与plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的质量比为2：3：4；在该质量比情况下，hek293t细胞的转染性显著增加，得到的病毒滴度最高，对hek293细胞的感染效果最好，表达量最大，得到的外泌体中装载的ecrg4mrna数量显著增加。

其中，步骤b中，对hek293t细胞的转染是指用转染的方法使hek293t细胞能够被ecrg4基因慢病毒感染的过程；优选的，转染方法包括脂质体转染法、磷酸钙转染法或电穿孔转染法中的一种；最优选的，转染方法为脂质体转染法；通过对转染方法的优选，可以降低转染试剂存在的细胞毒性，使细胞保持健康的生长状态，提高病毒包装效率。

其中，优选的，步骤b中的第一混合液的配制方法包括：取体积比为10~30：1的opti-mem培养基与lipofectamine2000混匀得到溶液a；取与溶液a中等量的opti-mem培养基，加入质粒pmd2.g、pspax2和plvx-ires-zsgreen1-ecrg4，三种质粒质量比为2：3：4，混匀得到溶液b；将溶液a与溶液b混匀既得第一混合液；通过优选，可提高第一混合液的转染性和稳定性。

其中，步骤b中所述的培养液是指细胞在培养基中培养完成后，除去细胞及细胞碎片后剩下的液体，是包含有慢病毒的培养液。

其中，优选的，步骤b中的转染后的hek293t细胞培养方法包括：将转染后的hek293t细胞培养6-12h后，换用dmem培养基进行培养，继续培养30-48h完成培养；通过优选，转染后的hek293t细胞生长状态更好。

其中，优选的，步骤b中，培养液的离心温度为0-8℃，离心速度为1500-2500g，离心时间为5-10min；最优选的，离心温度为4℃，离心速度为2000g，离心时间为7min；通过对离心条件的优选，能够去除培养液中残余的细胞及细胞碎片，使得到的病毒液纯度更高，感染效果更好。

其中，优选的，步骤c中，第二混合液中聚凝胺的浓度为6-10μg/ml；最优选的浓度为8μg/ml，优选的聚凝胺浓度可以降低聚凝胺的细胞毒性，显著提高病毒的感染效率；聚凝胺浓度过高，对细胞的毒性将增大，会影响细胞的活力，甚至造成细胞大量死亡；聚凝胺浓度过低，其提高病毒感染效率的作用将显著降低。

其中，优选的，步骤c中，用第二混合液对hek293细胞进行2次感染；通过2次感染，能够显著的提高病毒感染效率；感染效率高，则阳性细胞比例高，分选的时间短、效率高，对细胞活力的影响小，才能使hek293细胞中ecrg4的过表达效果最佳，分泌的外泌体中ecrg4mrna的含量最大。

其中，优选的，步骤c中，每次感染后的hek293细胞在进行培养之前，还要进行离心处理，离心速度为1800rpm，离心温度为室温，离心时间为45min；离心处理有助于病毒颗粒与细胞表面相结合，可以进一步显著提高病毒的感染效率。

其中，优选的，在对hek293细胞进行第2次感染前，要将经过第一次感染后的hek293细胞在不含病毒的培养基中培养12-24h；通过培养，可修复第一次感染对hek293细胞造成的影响，使经过第一次感染的hek293细胞恢复旺盛的生长状态，对第二次感染的效率提高具有显著效果。

其中，优选的，步骤（c）中，所述的细胞的分选是指采用流式细胞术分选得到gfp绿色荧光阳性的细胞，该gfp绿色荧光阳性细胞的总和即为ecrg4-hek293细胞系。

其中，优选的，步骤b、c中细胞的培养条件为：温度37℃，co2浓度为5%，通过优选，细胞在培养过程中能保持正常稳定的生长速度和生理状态。

其中，步骤b和c中，进行传代培养的培养基是指能为hek293细胞的生长和维持提供必需营养的培养基；优选的，所述的培养基包括dnem或rpmi-1640中的一种，最优选的，所的培养基为dnem（含10%fbs，1%青链霉素双抗）；通过优选，培养得到的细胞生长速度快，形态正常，转染效率高。

为达到上述发明目的，进一步的，本发明还提供了一种含有ecrg4mrna的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1、制备过表达ecrg4的细胞；

2、将过表达ecrg4的细胞在无血清的dmem中进行培养，培养完成后收集培养液；

3、将步骤2收集到的培养液进行分离提纯，得到含有ecrg4mrna的外泌体。

上述含有ecrg4mrna的外泌体的制备方法，利用过表达ecrg4的细胞能在细胞内转录生成大量ecrg4mrna，并在该细胞的细胞膜内陷形成外泌体时会主动载入ecrg4mrna的原理；通过对过表达ecrg4的细胞的培养，使细胞在生长和增殖过程中大量分泌含有ecrg4mrna的外泌体到培养基中；再经分离提纯，得到装载有大量ecrg4mrna的外泌体；该制备方法操作简单、稳定可靠，适合大规模，标准化生产。

上述含有ecrg4mrna的外泌体的制备方法，其中，优选的，步骤2中过表达ecrg4的细胞培养至密度80%，用pbs清洗2次后，再换成无血清的dmem培养基；优选的操作可去除残留的培养基血清中的外泌体，提高细胞分泌的外泌体的纯度。

其中，优选的，步骤2中过表达ecrg4的细胞在无血清的dmem培养基中培养时间为36-60h；最优选的，培养时间为48h；培养时间过短，细胞生成的外泌体数量少，分离产量低，培养时间过长，细胞活力会明显降低，细胞死亡增加，会有更多的细胞碎片以及细胞死亡相关的小分子结构分泌到培养基中，使外泌体的质量和纯度下降。

上述含有ecrg4mrna的外泌体的制备方法，其中，优选的，步骤3中，对培养液的分离提纯方法包括：a、将培养液在4℃，200g的条件下离心10min，取上清液备用；b、将a中得到的上清液在4℃，3000g的条件下离心10min，取上清液备用；c、将b中得到的上清液在4℃，10000g的条件下离心30min，取上清液备用；d、将c中得到的上清液在4℃，100000-160000g的条件下离心70-120min，取沉淀备用；e、在d中得到的沉淀中加入pbs重悬沉淀，并在4℃，100000-160000g的条件下离心70-120min，沉淀为含有ecrg4mrna的外泌体；其中，最优选的，步骤d、e中离心速度为120000g，离心时间为90min；通过优选，可去除细胞培养基中的死细胞、细胞碎片和大分子蛋白颗粒，得到的外泌体纯度更高。

上述含有ecrg4mrna的外泌体的制备方法，其中，优选的，步骤2、3中细胞的培养条件为：温度37℃，co2浓度为5%，通过优选，细胞在培养过程中能保持正常稳定的生长速度和生理状态。

其中，步骤2、3中所述的培养液是指将细胞培养完成后，除去细胞后剩下的液体。

更进一步的，本发明还提供了一种含有ecrg4mrna的外泌体的应用；该外泌体在治疗肿瘤中的应用，该外泌体能显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长，对肿瘤的治疗具有积极作用。

含有ecrg4mrna的外泌体可用于治疗口腔鳞癌，也可用于结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌或脑胶质瘤的治疗。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明外泌体通过过表达ecrg4基因的细胞分泌而成，其内装载有超过常规外泌体的ecrg4mrna，并能将装载的大量ecrg4mrna运送至受体细胞，能显著提高受体细胞中ecrg4的表达量。

2、本发明外泌体在制备过表达细胞的的过程中，通过对pmd2.g、pspax2与plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的质量比的优选、对聚凝胺浓度的优选、对细胞的二次感染，能显著提高外泌体中装载的ecrg4mrna量，使外泌体中装载的ecrg4mrna达到常规外泌体的1000倍或以上，对肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用显著。

3、本发明制备得到的ecrg4-hek293细胞能持续稳定的过表达ecrg4，得到的外泌体中ecrg4mrna的含量高，从源头上解决了本发明外泌体的来源问题，有利于本发明外泌体的大规模，标准化生产，并可推广到其他有治疗潜力的基因的装载、运送及规模化、标准化生产。

4、本发明外泌体可用于治疗肿瘤疾病，能显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长，对肿瘤疾病的治疗具有积极作用。

附图说明：

图1为ecrg4基因检测图（（a）100bpladder表示dna分子量marker；ecrg4frag表示ecrg4部分基因片段；ecrg4mrna表示ecrg4编码基因；（b）controls表示健康人血清外泌体中ecrg4mrna表达水平；patients表示口腔鳞状细胞癌病人血清外泌体中ecrg4mrna表达水平）。

图2为本发明实施例1和对比例1中被感染后的hek293细胞系的鉴定结果图（（a）为实时定量pcr结果统计图，（b）为westernblot结果图；ecrg4hek293表示实施例1中ecrg4-hek293细胞系，vectorhek293表示对比例1中vector-hek293细胞系）。

图3为本发明实施例1中制备的外泌体的形态及粒径检测结果图（（a）为透射电镜下观察的外泌体形态结构图；（b）为纳米颗粒追踪分析技术（nta）检测的外泌体粒径分布图）。

图4为本发明实施例1和对比例1中制备得到的外泌体的特征检测结果图；（（a）外泌体标志性蛋白westernblot检测结果图；（b）表示外泌体中ecrg4mrna含量检测结果，ecrg4-exo表示实施例1中制备得到的外泌体，vector-exo表示对比例1中制备得到的外泌体）。

图5为tca8113摄取本发明实施例1中制备的外泌体后的结果图（dapi表示细胞核；ecrg4-exo表示实施例1中提取的外泌体；α-actin表示细胞肌动蛋白；merge表示荧光叠加的效果图）。

图6为tca8113细胞摄取本发明实施例1和对比例1中外泌体后，细胞内ecrg4基因表达量的检测图（ecrg4-exo表示tca8113细胞加入实施例1中的外泌体，vector-exo表示tca8113细胞中加入对比例1中的外泌体）。

图7为本发明实施例1和对比例1中外泌体抑制tca8113细胞增殖检测结果图（（a）表示加入对比例1中外泌体的tca8113细胞周期检测结果；（b）表示加入实施例1中外泌体的tca8113细胞周期检测结果；（c）为加入两种外泌体后，用cck8检测的tca8113细胞增殖结果统计图）。

图8为本发明实施例1和对比例1中外泌体抑制a549细胞增殖检测结果图（（a）表示加入对比例1中外泌体的a549细胞周期检测结果；（b）表示加入实施例1中外泌体的a549细胞周期检测结果；（c）为加入两种外泌体后，用cck8检测的a549细胞增殖结果统计图）。

图9为本发明实施例1和对比例1中外泌体抑制tca8113细胞内相关基因表达的实时定量pcr检测结果图（ecrg4-exo表示加入实施例1中外泌体的tca8113细胞；vector-exo表示加入对比例1的外泌体的tca8113细胞）。

图10为接种了采用本发明实施例1和对比例1中外泌体处理过的tca8113细胞的裸鼠的生长状况对比图（（a）为试验期间裸鼠平均体重增长曲线；（b）为试验期间裸鼠平均摄食量统计图；ecrg4-exo表示接种了采用实施例1中外泌体处理过的tca8113细胞的裸鼠；vector-exo表示接种了采用对比例1中外泌体处理过的tca8113细胞的裸鼠）。

图11为本发明实施例1和对比例1中外泌体抑制裸鼠移植瘤生长结果图（（a）为接种了采用实施例1中外泌体处理过的tca8113细胞的荷瘤裸鼠；（b）为接种了采用对比例1中外泌体处理过的tca8113细胞的荷瘤裸鼠；（c）为裸鼠肿瘤生长曲线统计图；（d）为24天后剥离的裸鼠移植瘤；（e）为裸鼠移植瘤重量统计图；ecrg4-exo表示接种了采用实施例1中外泌体处理过的tca8113细胞的裸鼠，vector-exo表示接种了采用对比例1中外泌体处理过的tca8113细胞的裸鼠）。

图12为本发明实施例中慢病毒感染后的hek293细胞荧光图（（a）为实施例1中慢病毒感染后的hek293细胞荧光图；（b）为实施例2中用慢病毒1次感染法感染后的hek293细胞萤光图；（c）为实施例3中hek293细胞荧光图；（d）为实施例4中hek293细胞荧光图，dapi表示细胞核，ecrg4表示ecrg4过表达的阳性细胞，merge表示荧光叠加的效果图）。

图13为本发明实施例1和实施例2中慢病毒感染后的hek293细胞流式细胞术检测图（（a）为实施例1中慢病毒感染后的hek293细胞流式检测图；（b）为实施例2中慢病毒感染1次后的hek293细胞流式检测图，p2表示ecrg4过表达的阳性细胞）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

1、plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒构建：用trizol法提取人脐静脉内皮细胞总rna，用逆转录pcr扩增ecrg4基因，ecrg4基因及plvx-ires-zsgreen1载体都用xhoi和bamhi进行双酶切并用t4dna连接酶连接后，转化到大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，用双酶切及dna测序鉴定。其中ecrg4引物是以人ecrg4基因序列（genbank:af325503.1）为模板设计的，上游引物包含xhoi酶切位点，下游引物包含bamhi酶切位点。上游引物碱基序列为：5’-atgactcgagtgctcgcgccccgccgccatg-3’；下游引物碱基序列为：5’-tcatggattctgtggcaagtcatggttagt-3’。

2、细胞准备：复苏hek293t细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿，次日用lipofectamine2000转染，包装慢病毒，转染前2h换为无抗生素的dmem培养基；

3、慢病毒制备：配制包含450μl的opti-mem和18μl的lipofectamine2000的溶液a；配制包含450μl的opti-mem，2μg的质粒pmd2.g，3μg的质粒pspax2和4μg的质粒plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的溶液b；将溶液b加入溶液a中，轻柔混匀得第一混合液，室温静置5min后，将第一混合液加入步骤1得到的hek293t细胞中，置于37℃，5%co2的恒温培养箱中，6h后用pbs冲洗2次，换为dmem培养基，36h后收集培养夜，在温度为4℃、速度为2000g的条件下离心7min，取上清即为病毒液；

4、ecrg4-hek293细胞系的建立：复苏hek293细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿；次日，将步骤2得到的病毒液与dmem培养基按3：1的体积比混合均匀后，并加入聚凝胺，使聚凝胺的浓度为8μg/ml，得到第二混合液；将第二混合液加入到hek293细胞中，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养12h，在hek293细胞中再次加入第二混合液，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养48h后进行流式细胞术分选，得到ecrg4-hek293细胞系；

5、外泌体的生成：接种ecrg4-hek293细胞系在10cm培养皿中，数量为2.2×10⁶，培养至细胞密度约80%，用pbs清洗细胞2次，换成无血清的dmem培养基，培养48h后收集培养液；

6、外泌体的提取：将步骤4收集到的培养液在4℃，200g的条件下离心10min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃，3000g的条件下离心10min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃，10000g的条件下离心30min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃、120000g的条件下离心90min，取沉淀备用；在得到的沉淀中加入pbs重悬沉淀，并在4℃、120000g的条件下离心90min，沉淀即为含有ecrg4mrna的外泌体，并命名为ecrg4-exo。

7、外泌体的保存：在外泌体中加入适量pbs重悬，用bca蛋白浓度检测试剂盒定量，pbs体积为最初培养基体积的1%，-80℃保存。

实施例2

1、plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒构建：具体操作与实施例1相同。

2、细胞准备：具体操作与实施例1相同。

3、慢病毒制备：具体操作与实施例1相同。

4、ecrg4-hek293细胞系的建立：复苏hek293细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿；次日，将步骤2得到的病毒液与dmem培养基按3：1的体积比混合均匀后，并加入聚凝胺，使聚凝胺的浓度为8μg/ml，得到第二混合液；将第二混合液加入到hek293细胞中，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养48h后进行荧光观察及流式细胞术分选；

5、外泌体的生成：具体操作与实施例1相同。

6、外泌体的提取：具体操作与实施例1相同。

7、外泌体的保存：具体操作与实施例1相同。

经试验发现：实施例2步骤4对hek293细胞只采用了1次病毒感染处理，感染后的hek293细胞阳性细胞比例约54.8%，见图12（b）和图13（b）,实施例1中hek293细胞阳性细胞比例约为97.2%，见图12（a）和图13（a）。实施例2采用1次病毒感染处理的方法，细胞的阳性率显著降低，并且ecrg4的表达量也低于实施例1，不利于细胞的流式分选以及外泌体的提取。因此，采用2次感染方法能够极大的提高感染效率，加快稳定细胞株的建立，提高hek293细胞中ecrg4mrna及蛋白质的表达量，从而大大增加了外泌体中ecrg4mrna的含量。

实施例3

1、plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒构建：具体操作与实施例1相同。

2、细胞准备：具体操作与实施例1相同。

3、慢病毒制备：配制包含450μl的opti-mem和18μl的lipofectamine2000的溶液a；配制包含450μl的opti-mem，2μg的质粒pmd2.g，2μg的质粒pspax2和2μg的质粒plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的溶液b；将溶液b加入溶液a中，轻柔混匀得第一混合液，室温静置5min后，将第一混合液加入步骤1得到的hek293t细胞中，置于37℃，5%co2的恒温培养箱中，6h后用pbs冲洗2次，换为dmem培养基，36h后收集培养夜，在温度为4℃、速度为2000g的条件下离心7min，取上清即为病毒液；

4、ecrg4-hek293细胞系的建立：具体操作与实施例1相同。

5、外泌体的生成：具体操作与实施例1相同。

6、外泌体的提取：具体操作与实施例1相同。

7、外泌体的保存：具体操作与实施例1相同。

经试验发现：实施例3中，步骤3第一混合液中pmd2.g、pspax2与plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的质量比不是优选比例，制备得到的病毒液中携带ecrg4基因的慢病毒较少，病毒液的感染性降低，感染hek293细胞后，阳性细胞率（阳性细胞比例低于30%）及hek293细胞中ecrg4的表达量都显著低于实施例1（阳性细胞比例约为97.2%），见图12（a）、（c），对外泌体中ecrg4基因的装载量造成影响。因此，采用优选pmd2.g、pspax2与plvx-ires-zsgreen1-ecrg4的质量比例，能够极大的提高ecrg4病毒的滴度，增加hek293细胞的感染效率及ecrg4的过表达效果，从而分泌的外泌体中ecrg4mrna的含量最大。

实施例4

1、plvx-ires-zsgreen1-ecrg4质粒构建：具体操作与实施例1相同。

2、细胞准备：具体操作与实施例1相同。

3、慢病毒制备：具体操作与实施例1相同。

4、ecrg4-hek293细胞系的建立：复苏hek293细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿；次日，将步骤2得到的病毒液与dmem培养基按3：1的体积比混合均匀后，并加入聚凝胺，使聚凝胺的浓度为12μg/ml，得到第二混合液；将第二混合液加入到hek293细胞中，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养12h，在hek293细胞中再次加入第二混合液，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养48h后进行荧光检测；

5、外泌体的生成：具体操作与实施例1相同。

6、外泌体的提取：具体操作与实施例1相同。

7、外泌体的保存：具体操作与实施例1相同。

经试验发现：实施例4中，步骤4第二混合液中聚凝胺的浓度不是最佳浓度，与实施例1相比，第二混合液增加了细胞的毒性，hek293细胞死亡较多，病毒液的感染性降低。因此，得到的ecrg4-hek293细胞系中阳性细胞的比例（阳性细胞低于30%）显著少于实施例1（阳性细胞比例约97.2%），不利于阳性细胞的流式分选及外泌体提取。因此，采用优选的聚凝胺浓度能够极大的提高第二混合液的感染效率，从而使hek293细胞中ecrg4的过表达效果最佳，分泌的外泌体中ecrg4mrna的含量更大。

对比例1

1、细胞准备：复苏hek293t细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿，次日用lipofectamine2000转染；转染前2h换为无抗生素的dmem培养基；

2、慢病毒制备：配制包含450μl的opti-mem和18μl的lipofectamine2000的溶液a；配制包含450μl的opti-mem，2μg的质粒pmd2.g，3μg的质粒pspax2和4μg的质粒plvx-ires-zsgreen1的溶液b；将溶液b加入溶液a中，轻柔混匀得第一混合液，室温静置5min后，将第一混合液加入步骤1得到的hek293t细胞中，置于37℃，5%co2的恒温培养箱中，6h后用pbs冲洗2次，换为dmem培养基，36h后收集培养液，在温度为4℃、速度为2000g的条件下离心7min，取上清即为病毒液；

3、vector-hek293细胞系的建立：复苏hek293细胞，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的dmem培养基（简称dmem培养基）于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，传代1-2次后，接种0.8×10⁶个细胞到6cm培养皿；次日，将步骤2得到的病毒液与dmem培养基按3：1的体积比混合均匀后，并加入聚凝胺，使聚凝胺的浓度为8μg/ml，得到第二混合液；将第二混合液加入到hek293细胞中，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养12h，在hek293细胞中再次加入第二混合液，在1800rpm、37℃的条件下离心45min，培养12h后换为dmem培养基，继续培养48h后进行流式细胞术分选，得到vector-hek293细胞系；

4、外泌体的生成：接种vector-hek293细胞在10cm培养皿中，数量为2.2×10⁶，培养至细胞密度约80%，用pbs清洗细胞2次，换成无血清的dmem培养基，培养48h后收集培养基；

5、外泌体的提取：将步骤4收集到的培养基在4℃、200g的条件下离心10min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃、3000g的条件下离心10min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃、10000g的条件下离心30min，取上清液备用；将得到的上清液在4℃、120000g的条件下离心90min，取沉淀备用；在得到的沉淀中加入pbs重悬沉淀，并在4℃、120000g的条件下离心90min，沉淀即为外泌体（vector-exo）。

6、外泌体的保存：在外泌体中加入适量pbs重悬，用bca蛋白浓度检测试剂盒定量，pbs体积为最初培养基体积的1%，-80℃保存。

实验例：

（1）ecrg4-hek293细胞系及ecrg4-exo鉴定

分别用实时定量pcr及westernblot检测实施例1中建立的ecrg4-hek293及vector-hek293细胞ecrg4mrna及蛋白质表达水平。结果显示，ecrg4-hek293细胞ecrg4mrna表达量是vector-hek293细胞的7.8×10⁵倍，见图2a。并且ecrg4-hek293细胞裂解液中检测到了清晰、浓重的ecrg4蛋白条带，分子量约17kda，而相同质量的vector-hek293细胞裂解液未检测到ecrg4蛋白质条带，见图2b。由此表明，实施例1中建立的ecrg4-hek293细胞系，ecrg4mrna及蛋白质都存在强烈的过表达，为外泌体装载ecrg4基因准备了良好的前提条件。

取等量的ecrg4-hek293及vector-hek293细胞，在无血清dmem培养基中培养48h，收集培养基提取外泌体，透射电镜结果显示，外泌体呈典型的“杯状”囊泡结构，粒径主要集中在93nm，见图3。westernblot结果显示，外泌体的阳性markercd9和alix的表达量明显高于细胞裂解液，外泌体的阴性markergrp94和calnexin的表达量显著低于细胞裂解液，见图3，并且，ecrg4-exo中ecrg4mrna表达量是vector-exo的1162倍，见图4。由此表明实施例1中提取的ecrg4-exo外泌体具有典型的外泌体的形态结构，并装载了高水平的ecrg4基因。

（2）外泌体转运ecrg4mrna的实验检测：

将实施例1中制备得到的ecrg4-exo加入celltracker^tmcm-dii(thermo,c7000)，终浓度1μg/ml，37℃孵育30min，4℃放置15min，转移到超速离心管中，4℃120000g离心90min，弃上清，沉淀溶于pbs溶液，转移至超速离心管，4℃120000g离心90min，弃上清，沉淀溶于pbs溶液，-80℃保存备用；tca8113细胞培养基为含10%fbs的rpmi-1640，tca8113细胞接种在细胞爬片上，密度约60%，6孔板中培养过夜，加入50μg的ecrg4-exo，培养12h；取出细胞爬片，用4%多聚甲醛室温固定15min，pbs清洗5min，加入预冷的无水甲醇，-20℃放置20min，pbs清洗5min，5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入anti-actin一抗（sigma）4℃孵育过夜，pbs清洗5min，重复3次，加入绿色荧光二抗（abcam），室温孵育1h，pbs清洗5min，重复3次，加入1%细胞核染料hoechst，室温孵育10min，pbs清洗5min，重复3次，封片剂封片，荧光显微镜检测。结果显示，红色荧光标记的ecrg4-exo能够通过tca8113细胞膜，进入到受体细胞，主要分布在胞浆中，围绕在细胞核周围，见图5。

为了进一步证实ecrg4-exo外泌体能否将携带的ecrg4基因运送到tca8113细胞，本发明分别将ecrg4-exo和vector-exo加入到tca8113细胞，12h后收集细胞，进行实时定量pcr检测。结果显示，ecrg4-exo（实施例1）处理组的tca8113细胞中ecrg4mrna的表达水平是vector-exo（对比例1）处理组的29.48倍，见图6，充分证明了ecrg4mrna通过外泌体运送到了受体细胞。

（3）ecrg4-exo抑制舌癌细胞tca8113（口腔鳞癌）细胞增殖实验检测：

tca8113细胞接种于96孔板中，细胞数量为2000个/孔，培养24h，实验组加入2μgecrg4-exo（实施例1），对照组加入2μgvector-exo（对比例1），继续培养48h，每孔加入10μlcck-8溶液，37℃培养1h，检测450nm吸光度，spss进行数据统计分析。将tca8113细胞接种于6孔板，数量为0.3×10⁶/孔，培养过夜后，换成无血清的dmem培养基同步化培养12h后，换成dmem培养基，同时实验组（3孔）加入20ugecrg4-exo，对照组（3孔）加入20μgvector-exo，继续培养24h。胰蛋白酶消化细胞，pbs清洗一次，用70%乙醇，4℃固定过夜，细胞用pbs清洗2次，加入500μlpi/rnase染液（bd550825），用流式细胞仪进行检测。

结果显示，与对照组相比，ecrg4-exo处理组tca8113细胞增殖速度下降了58%，并且g0/g1期细胞数量明显高于对照组（ecrg4-exo组63.97%、对照组54.34%)，s期细胞数量低于对照组（ecrg4-exo组24.16%、对照组29.23%)，见图7，表明ecrg4-exo阻滞了tca8113细胞g0/g1→s期的过程。为了更加充分的证实ecrg4-exo的效果，本发明用相同的试验方法，在人肺癌细胞a549中进一步证实了，ecrg4-exo延缓了a549细胞s→g2期的过程（ecrg4-exo组11.83%、对照组16.04%)，最终导致a549细胞增殖速度降低42%，见图8。体外实验在细胞水平充分表明，ecrg4-exo有效的抑制了肿瘤细胞的增殖。

（3）炎症及血管新生相关基因表达的抑制实验：

将tca8113细胞接种于12孔板，密度为70%，培养过夜后，实验组（6孔）加入20ugecrg4-exo，对照组（6孔）加入20μgvector-exo，继续培养24h，收集细胞，提取总rna，用实时定量pcr2^-δδct法检测细胞增殖、血管新生及炎症相关基因nf-κbp50，il-1b,il-6,mcp1,cdk4,vefga的表达，见图9。结果显示，ecrg4-exo显著抑制了tca8113细胞nf-κbp50，il-1b,il-6,mcp1,cdk4,vefga的表达水平。

（4）裸鼠移植瘤生长抑制实验：

为了进一步验证ecrg4-exo在体内效果，本发明分别用ecrg4-exo和vector-exo对tca8113细胞进行预处理，然后取等量细胞皮下接种裸鼠，复制移植瘤模型，具体操作如下。

tca8113细胞种在10cm培养皿，培养至密度为80-90%，实验组加入400μgecrg4-exo，对照组加入400μgvector-exo，继续培养24h，胰蛋白酶消化后用pbs稀释至10⁷个/ml。6月龄雄性balb/c免疫缺陷型裸鼠随机分为2组，每组6只。两组细胞分别接种在裸鼠右前肢背部皮下，数量为10⁶个/只。细胞接种后的第3、6、9日，实验组裸鼠尾静脉注射100μgecrg4-exo，对照组裸鼠尾静脉注射100μgvector-exo，共注射三次。裸鼠接种细胞后的第2天开始用游标卡尺测量肿瘤最长径（l）、最短径（w），计算肿瘤体积（v），v=l×w²×0.5，同时记录饲料消耗量及裸鼠体重，每2日记录1次，直至第24天，处死裸鼠，剥离肿瘤，称重。数据以“平均值±标准差”表示，用spss19.0软件进行独立样本t检验分析。

统计结果显示两组裸鼠在试验期间平均体重及摄食量没有明显差异，见图10，但肿瘤尺寸差异明显。在第8、14、16、20、22、24天，ecrg4-exo组肿瘤体积显著低于vector-exo组(p<0.05)，见图11。裸鼠处死后，剥离肿瘤，实验组肿瘤尺寸明显小于对照组，经过统计分析，实验组肿瘤重量显著低于对照组(p<0.05)，见图11。本发明通过体外及体内试验，分别从分子水平，细胞水平和整体水平充分证实了ecrg4-exo显著抑制口腔鳞癌细胞及肿瘤的生长，且这一作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤血管新生及炎症反应相关基因表达来实现的。