一种VEGF-A单克隆抗体及试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种vegf‐a单克隆抗体及vegf‐a蛋白检测试剂盒。

背景技术

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)是一种具有高度生物活性的一种二聚体阳离子糖蛋白。vegf家族包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e、vegf－f和胎盘生长因子(placentalgrowthfactor，plgf)。人类vegf-a基因定位于6p21.3，由8个外显子和7个内含子构成，全长14kb。通过基因转录的mrna不同剪接方式(alternativesplicing)，编码出4种主要异构体，它们为vegf121，vegf165，vegf189和vegf206，分别由121、165、189和206个氨基酸组成。vegf121、vegf145、vegf165三种单体是分泌性蛋白质，可以从细胞浆中分泌到细胞外。vegf145和vegf165可以和所有内皮细胞的kdr/flk-1受体结合。vegf165是vegf家族最主要的异构体，也是生理活性最强的vegf异构体，研究最为广泛，相应的报导也最多。

vegf是主要介导血管生成(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis)的异构体，它是一种强大的特异的内皮细胞有丝分裂素，介导内皮细胞的增殖、出芽、迁移和管腔形成。1994年，kondonishida等首次证实癌症和vegf关系，根据folkman假设实体瘤如果没有新的血管生成，由于受氧和其他营养成分供应的限制，其大小不会超过1-3mm³。血管内皮生长因子(vegf)是促进肿瘤血管新生的关键性的蛋白因子。此外，越来越多的临床实验也表明，血管内皮细胞功能障碍是实体肿瘤形成的一个重要特点。2004年2月26日，美国罗氏公司生产的通过抑制vegf-a作用机制的肿瘤治疗药物阿瓦斯汀获得fda的批准。

靶向治疗药物贝伐单抗(bevacizumab)是vegf的人源化单抗，能与vegf‐a各亚型及活性降解产物结合。人源化的贝伐单抗后来被genentech公司商品化，商品名为avastin。鉴于贝伐单抗在治疗转移性结直肠癌临床实验中的显著疗效，于2004年被美国食品与药物管理局(fda)批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，成为世界上首个获准上市的vegf抑制剂，目前，fda已批准贝伐单抗用于转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌的一线治疗。除此之外，贝伐单抗在肝癌、胃癌、食管癌等其他恶性肿瘤的应用也取得令人鼓舞的结果。2013年，美国roche/genentech公司正在进行vegf‐a检测试剂盒的临床试验，其美国fda临床试验批准号为nct01663727。近年来研究表明，肿瘤患者血清中vegf浓度与肿瘤疾病进展及治疗效果评价和疾病转归等方面有重要关系，在疾病的诊断及预测疾病治疗等方面存在很大的应用价值。

近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。

现有技术中针对vegf/vegfr通路靶向药物监测及疗效评估的产品目前国内尚属空白，同类产品其特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能，基于此，我们开发了vegf‐a测定试剂盒(化学发光法)及其制备方法。

技术实现要素：

为了克服现有中的上述问题，本发明提供了一种vegf‐a单克隆抗体，具有较高的亲和力，在体外具有良好的生物学活性；开发前景广阔。

一种vegf‐a单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列为：metalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallysphemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleuvalaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelysprosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspgluglyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnilemetargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserpheleuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaargglngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphevalglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspserargcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcysasplysproargargleuasn；

轻链可变区氨基酸序列为：serserasngluhisglyprovallysargserserglnserthrleugluargsergluglnglnileargalaalaserserleuglugluleuleuargilethrhissergluasptrplysleutrpargcysargleuargleulysserphethrsermetaspserargseralaserhisargserthrargphealaalathr。

进一步地，本发明还提供了编码上述轻链可变区和重链可变区氨基酸序列的多核苷酸。

进一步地，本发明还提供了包含上述多核苷酸的重组dna表达载体，所述重组dna表达载体中包含编码vegf-a单克隆抗体重链可变区、轻链可变区和和抗体恒定区的dna序列。

进一步地，本发明提供了包含上述vegf‐a单克隆抗体的检测试剂盒。该试剂盒制备方法是：以nunc化学发光反应板为反应支持物，将vegf‐a单克隆抗体用0.5mpbs稀释至2.5ug/ml，以100ul/孔包被至化学发光空白板中，4℃下24小时后，用0.9％nacl洗板3次，加入含有1％bsa的0.5molpbs封闭，4℃下12小时后甩干。

本发明具有以下优点：

(1)本发明的vegf‐a单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性。

(2)包含有vegf‐a单克隆抗体的检测试剂盒检测方法简便、准确性强、成本低。

(3)将vegfa165与vegf‐a多抗建立vegf‐a蛋白检测试剂盒可作为vegf/vegfr通路肿瘤靶向药物的监测工具。

附图说明

图1是vegfa165抗体剂量‐反应体系示意图。

图2是vegfa165抗体质控血清检测散点图。

图3是采用本发明试剂盒检测两组tace术前后血清vegf动态变化情况示意图。

具体实施方式

借助于下述具体实施方式可更好地理解本发明，然而，这些具体实施方式仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

实施例1

一、vegf‐a抗原的制备：

(1)根据genbank数据库中人vegf-a(kt768148.1)的序列设计一对引物，上游引物为vp：5’-atgaactttctgctctcttgggtaca-3’，引入xhoi酶切位点；下游引物为vp：5’-gcagatgtgacaagccaaggcggtg-3’，引入ecori酶切位点，通过rt-pcr方法从人肝细胞中提取总rna，然后反转录成cdna，以cdna为模板，用pyrobestdna聚合酶进行vegf-a基因特异性扩增。扩增后的pcr产物进行凝胶回收，回收的vegf-a基因与ppic9k质粒分别进行xhoi和ecori酶切，t4连接酶连接回收后的目的片段，连接产物转化dh5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/ml)抗体筛选出阳性克隆，体取质粒并经酶切和测序鉴定。

(2)ppic9k‐vegf‐a表达载体经stui线性化、电转化至感受态的毕赤酵母gs115(his4)，涂布含g418的md平板筛选高拷贝的转化子，待菌落长出，挑选单克隆菌株进行pcr鉴定，将pcr结果为阳性的克隆以质粒ppic9‐kal/gs115(his4)转化至毕赤酵母细胞，在7.5l培养罐内高密度细胞5g4发酵，以1％‐2％的甲醛诱导表达vegf‐a。发酵上清液经phenylsephadexg‐25凝胶过滤层析，heparinsepharoseff肝素亲和层析，sephacryls‐100凝胶过滤层析，得到充足人vegf‐a蛋白，表达水平为50mg/l，进行sds‐page电泳鉴定，纯化后的vegf‐a蛋白纯度98％。

二、vegf‐a多抗的制备及标记

(1)用雄性新西兰白兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物，一周后开始免疫。使用vegf‐a抗原作为免疫原；免疫模式采用足下注射及背部4‐6点皮下注射，免疫佐剂使用弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂，分四次免疫动物，每次取vegf‐a抗原1mg将等量的弗氏完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内充分乳化30‐60分钟后后足皮下注射，每次间隔两周。取耳静脉血检测效价，clia达到1:50000进行劲动脉放血，离心取血清。利用deae离子交换纯化，所得抗体溶液达98％以上。

(2)vegf‐a多抗用0.5molpbsph7.5稀释1mg/ml，配置ez‐link^tmsulfo‐nhs‐lc‐lc‐biotin货号21338生物素试剂10mm，标记多抗与生物素，摩尔比1:20；室温反应1小时，pd10脱盐柱过柱，收集并保存。

三、vegf‐a单克隆抗体的制备

(1)小鼠免疫：培养稳定表达的5g4细胞，离心后用pbs(ph7.4)重悬，免疫3只雌性bala/c小鼠，每只balb/c小鼠皮下注射5×10⁶细胞，连续3次，每次间隔2周，第4次免疫后7d，用clia法检测抗血清效价，取效价最高的小鼠，脾内注射1×10⁵个细胞加强免疫，3d后取小鼠脾脏，研磨，并对脾细胞计数待用。

(2)细胞融合与抗体制备：取脾细胞与骨髓细胞sp2/0按细胞计数6:1的比例融合，peg1200诱导，融合后加到铺好的饲养层的96孔板培养一周后用hat培养基半量换液，clia方法筛选阳性细胞株。用间接clia法筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有效稀释法克隆化后，选择i株vegf‐aab持续分泌阳性率98％以上的杂交瘤细胞4c5并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前i周，小鼠腹腔注射500μl液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至1×10⁹/l，每只小鼠腹腔注射500μl，1周后小鼠腹部明显肿胀，消毒下腹部皮肤后，抽取腹水，所得腹水3000r/min，收集上清。

(3)选用ge公司proteing纯化柱纯化腹水；用20mmpb缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用ph2.70.1mol甘氨酸盐酸缓冲液进行洗脱，用含有ph8.71moltris缓冲液的ep管收集，0.05mmpb透析，浓缩冻存。

四、单克隆抗体应用筛选

(1)包被前述方法制备好的单克隆抗体，以0.5mpbs稀释抗体至1‐5ug/ml。100ul每孔包被至化学发光空白板中，4℃过夜后，0.9％nacl洗3次，加入含有1％bsa每孔150ul封闭，4℃过夜后甩干备用。

(2)筛选最优单抗：稀释制备的抗原按比例稀释8个梯度(0、10、50、100、200、400、1000、2000pg/m)，依次加入前述制备好的化学发光板中，每孔50ul，再加入生物素化多抗及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃温育1h，pbst洗涤5次，加入化学发光底物液，避光反应检测发光值；对比不同单抗包被化学发光板下校准品的线性相关系数r值，以vegf‐a浓度为横坐标x值，rlu值为纵坐标y值。最终挑选具有良好线性，评价指标最好的单克隆抗体vegfa165。单抗隆抗体作为夹心法clia检测方法的评价标准应同时满足s0rlu值＜100，s5/s0(p/n)最大，30例质控血清检出率大于90％等条件。

vegfa165抗体剂量‐反应体系示意图如图1所示。

vegfa165抗体质控血清检测散点图如图2所示。

五、杂交瘤中单克隆抗体基因调取与制备

(1)用trizol试剂提取5×10⁶的杂交瘤细胞4c5的总rna，再以oligodt为引物，amv逆转录酶逆转录温度37℃15min，合成得到cdna。以合成cdna为模板，针对rna序列的引物和基因特异性引物gsp进行巢式pcr扩增，pcr的条件均为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后再于72℃延伸10min。

(2)将pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取并回收目的凝胶条带，调取目的基因，连接到pgem‐t载体中，ecori酶切鉴定阳性的重组质粒，进行dna序列的测定分别获得vl和vh基因序列。

vh(重链可变区序列)

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metalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallysphemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleuvalaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelysprosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspgluglyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnilemetargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserpheleuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaargglngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphevalglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspserargcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcysasplysproargargleuasn；

vl(轻链可变区序列)

locusaep6097371aa

serserasngluhisglyprovallysargserserglnserthrleugluargsergluglnglnileargalaalaserserleuglugluleuleuargilethrhissergluasptrplysleutrpargcysargleuargleulysserphethrsermetaspserargseralaserhisargserthrargphealaalathr。

将获得重链和轻链可变区基因序列和抗体的恒定区一起进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，将获得的轻链和重链基因分别克隆到pmd18‐t表达载体中。质粒分别提取100‐150ug的量，并去内毒素(＜1eu/mg)，将获得的2个质粒1:1共转染到50ml体积的悬浮的感受态tg1细胞中，转染试剂采用pei，质粒和pei的比值为1:2。转染3‐7天后，收集细胞上清，sds‐page检测抗体是否正确表达，proteina柱纯化，浓缩后获得合格的vegf‐a抗体vegfa165，纯度大于98％。

六、vegf‐a检测clia试剂盒的制备

(1)单抗包被：以nunc化学发光反应板为反应支持物，将筛选出的最优单抗vegfa165，用0.5mpbs稀释至2.5ug/ml。以100ul/孔包被至化学发光空白板中，4度24小时后，用0.9％nacl300ul/孔洗板3次，加入含有1％bsa的0.5molpbs/孔150ul封闭，4度12小时甩干备用。

(2)加样：稀释制备的vegf‐a抗原按比例稀释6个梯度(0、10、50、100、200、400、800pg/m)及待测血清样本，各50ul/孔加入包被vegfa165的包被板中，50ul/孔再加入生物素化vegf‐a多抗及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素(0.5mpbs，1:10000稀释)，37℃温育1h，pbst洗涤5次，除去未结合的vegf多抗及链霉亲和素‐辣根过氧化物酶。

(3)加入鲁米诺‐过氧化物化学发光底物50ul/孔，利用tzd‐cl‐200s化学发光免疫分析仪检测化学发光强度(rlu)。

七、vegf‐a检测试剂盒的性能

(1)vegf‐a检测试剂盒的分析性能

重复性：vegf‐a检测试剂盒的批内变异系数(cv)不大于10％；批间变异系数(cv)不大于15％；

分析灵敏度：试剂盒最低检出限不大于30pg/ml；

分析特异性：一定浓度特异性物质(fgf2、egf)检测结果不大于50pg/ml；

线性范围：在0‐800pg/ml浓度范围内，线性相关系数r不小于0.9900。

(2)vegf-a检测试剂盒的临床性能

开展20例临床诊断为原发性肝癌的患者，按1∶1随机分成实验组(a组)和对照组(b组)，a组给予常规tace加术前1天静脉滴注贝伐单抗(安维汀)200mg；对照组仅给予常规tace术。所有患者于tace术前1天、术后1天、3天、5天、7天及1个月抽血，用化学发光法定量检测血浆中vegf-a水平，tace术后1月复查肝脏增强ct/mri，根据mricist标准评估近期临床疗效。实验结果如图3和下表所示。

表2.两组tace术前后血清vegf数值(pg/l)

注：a组：实验组，贝伐珠单抗联合tace术；b组：对照组，单独行tace术；p1为同期a组与b组比较；p2为a组术后vegf数值与术前的比较；p3为b组术后vegf数值与术前的比较。＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。

图3是采用本发明试剂盒检测两组tace术前后血清vegf动态变化情况示意图。两组术后1天、3天、5天的血清vegf-a水平较术前逐渐增高，与术前比较均有统计学意义(p值分别为0.048、0.011、和0.036)，术后30天较术前无统计学差异(p＝0.298)。根据mricist标准评估tace术后1个月试验组：cr：0例、pr3例、sd：6例、pd：1次；总有效率(pr+cr+sd)：90％；对照组：cr：0例、pr：1例、sd：7例、pd：2例；总有效率：80％。两组患者术后均出现一过性肝功能异常，但差别无统计学意义(p＞0.05)，实验组应用贝伐单抗后均未出现明显贝伐单抗相关副反应，提示贝伐单抗联合tace治疗患者耐受性良好。

原发性肝癌患者tace术后血清vegf-a水平升高，联合应用贝伐珠单抗能够降低tace术后患者血清vegf-a升高的水平，血管内皮生长因子a(vegf-a)化学发光测定试剂盒能作为vegf靶向药物疗效评估的有效工具。

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<110>浙江众意生物科技有限公司

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