本发明涉及echinulin的制备方法，属于化学分析技术领域。
背景技术：
echinulin，即3s,6s,3-[[2-(1,1-二甲基-2-丙烯)-5,7-二(3,3-二甲基丙烯基)-1h-吲哚-3-基]甲基]-6-甲基-2,5-哌嗪二酮，casno：1859-87-6，分子量：461.64，是一种环二肽类化合物，其化学结构如下：
既往的研究表明，echinulin具有广泛的生理活性，如抗病毒、抗结核、抗氧化、抗炎症、增强免疫、降血压等等。目前，该化合物主要由单一菌种，如aspergilluschevalieri，eurotiumcristatum，aspergillusveriecolor等，通过纯菌种培养，从发酵产物中分离提取得到，存在单菌纯菌种培养条件苛刻、发酵产物中结构类似物多、纯化工序繁多、分离纯化难度较大等缺点。因此，开发原料易得、工艺简单的echinulin的制备方法，具有重要意义。
大曲是用来酿酒的一种原料，是以小麦等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，让自然界各种微生物在上面生长而制成的，不需要进行单一菌种纯化、培养等复杂操作。在大曲的制作过程中，复杂的微生物群体利用其产生的各种酶系，对原料中的蛋白质、氨基酸等进行代谢，生成小分子肽类化合物(以酰胺键形成的一类化合物)。蒸馏白酒时，来自于大曲中的小分子肽类化合物在共沸、夹带等作用下可能会被带入到酒体之中，使得白酒产品具有一定的保健功效。分离大曲中具有生理活性的小分子肽类化合物，可为进一步探索白酒中健康功能因子奠定基础，为阐明“适度饮酒有利于健康”这一观点提供理论依据，对白酒产品的市场推广有着重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供echinulin的制备方法，以解决现有的echinulin制备方法原料不易得到、制备工艺复杂等问题。
本发明提供了echinulin的制备方法：从大曲中分离得到。
进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：
a、取大曲，粉碎，有机溶剂提取，浓缩，得到大曲浸膏；
b、将大曲浸膏进行硅胶正相柱层析，收集含有echinulin的洗脱液，浓缩，得到粗品；
c、将粗品进行葡聚糖凝胶柱层析，收集含有echinulin的洗脱液，浓缩，即得echinulin。
本发明首先选用有机溶剂将大曲中的微量目标物质提取出来，同时要避免淀粉、糖类、蛋白质等大曲的主要成分进入到提取液中。
然后，采用硅胶正相柱层析，其原理是根据化合物的极性不同进行分离，从而达到分离纯化echinulin的目的。
采用葡聚糖凝胶柱层析，其原理是根据化合物的分子量大小不同进行分离，分子量大的化合物先流出，分子量小的化合物后流出。
要想从成分复杂的大曲中分离出高纯度的echinulin，必须将上述分离手段结合起来，以上a、b、c三个步骤缺一不可。
进一步地，所述有机溶剂为醇系溶剂或乙酸乙酯。
优选地，所述醇系溶剂为甲醇。
本发明采用醇系溶剂或乙酸乙酯作为提取溶剂，能将大曲中的echinulin充分提取出来，同时能避免淀粉、糖类、蛋白质等成分进入到提取液中。在优选的实施方案中，甲醇和乙酸乙酯的沸点较低，减压浓缩时无需设置太高的温度，既能避免目标化合物被高温破坏，又能节省时间，便于溶剂回收。
进一步地，所述有机溶剂为甲醇时，满足以下至少一项：
甲醇用量为大曲重量的2～4倍；
提取温度为15～40℃；
提取次数为2～4次；
提取时间为每次5～15天。
优选地，提取温度为20℃。
经过考察，甲醇用量为大曲重量的2～4倍最佳，既能充分提取出大曲中的echinulin，又不至于造成溶剂的浪费。
提取温度为15～40℃最佳，既能充分提取出大曲中的echinulin，又不会造成溶剂挥发严重、损失过多。
提取次数为2～4次，每次提取时间为5～15天最佳，既能充分提取出大曲中的echinulin，又能够避免杂质过多地进入提取液，给后续的分离纯化带来困难。
进一步地，所述有机溶剂为甲醇时，步骤a还包括如下步骤：提取液浓缩后加水分散均匀，再加入石油醚进行萃取，浓缩石油醚相，即得大曲浸膏。
优选地，于60℃分散均匀。
当使用甲醇作为提取溶剂时，大曲中多种不同极性的杂质都能溶解于其中，因此，本发明采用极性较小的石油醚对浓缩后的提取液进行萃取，将极性偏小的化合物萃取出来，以减小后续的分离难度。
当使用乙酸乙酯作为提取溶剂时，乙酸乙酯的极性比甲醇小，提取液中的强极性化合物就会少很多，因此不需要石油醚萃取这一步。
进一步地，所述有机溶剂为乙酸乙酯时，满足以下至少一项：
乙酸乙酯用量为大曲重量的2～4倍；
提取温度为15～40℃；
提取次数为2～4次；
提取时间为每次5～15天。
优选地，乙酸乙酯用量为大曲重量的3倍。
优选地，提取温度为30℃。
优选地，提取次数为3次。
进一步地，步骤b满足以下至少一项：
所述的硅胶为100～300目正相硅胶；
将大曲浸膏与正相硅胶按重量比1:1均匀搅拌；
以石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮为洗脱试剂；
以石油醚/乙酸乙酯，v/v，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1的比例进行梯度洗脱，或者，以石油醚/丙酮，v/v，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1的比例进行梯度洗脱。
本发明优选100～300目正相硅胶，既能达到较好的纯化效果，又能保证分离的速度。
以石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮为洗脱试剂，并通过调整洗脱液的梯度，能够将大曲浸膏中的不同化合物从极性弱到极性强逐步洗脱下来。
进一步地，步骤c满足以下至少一项：
所述的葡聚糖凝胶为sephadexlh-20；
以氯仿-甲醇和/或甲醇为洗脱试剂。
优选地，所述氯仿-甲醇洗脱试剂中氯仿：甲醇的体积比为1：1。
本发明采用葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱进行层析，以氯仿-甲醇和/或甲醇为洗脱试剂进行洗脱，使得sephadexlh-20既具有凝胶过滤作用，又有反向分配的作用，分子量大、极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，分子量小、极性小的化合物保留强，后被洗脱下来。同时，上述方案使用的溶剂量很少，分离效率高，成本低。
进一步地，所述的制备方法还包括重结晶的步骤，满足以下至少一项：
重结晶溶剂为甲醇或石油醚-乙酸乙酯；
重结晶次数为2～4次。
进一步地，所述大曲为小麦中温曲。
优选地，所述大曲为浓香型纯小麦中温曲。
所述小麦中温曲是以含有小麦的原料制备得到，控制曲坯品温35～60℃。
所述浓香型纯小麦中温曲是完全以小麦为原料制备得到的，控制曲坯品温不超过35～60℃。
本发明提供了echinulin的制备方法，将多种层析技术相结合，首次从大曲中分离制备出echinulin，主要具有以下优势：
1、原料易得：现有制备echinulin的主要方法为：首先将特殊单菌种，如aspergilluschevalieri，eurotiumcristatum等，接种到经过高温高压灭菌的特定的培养基中，在一定的条件下进行发酵，然后从大量的发酵液中分离出echinulin，制备echinulin的原料不易得；本发明则直接以酿酒所用大曲为原料分离制备echinulin。
2、制备分离方法简便，产物纯度高：通过单菌种发酵来获得环二肽echinulin时，发酵液中环二肽echinulin的同系物很多，要想制备分离纯度较高的目标产物，步骤繁琐，难度特别大；本发明从大曲中分离echinulin，大曲中没有目标物的同系物，技术路线成熟明确，高效精准，所制备的echinulin纯度高。
附图说明
图1为实施例1所得echinulin的esi质谱图；
图2为实施例1所得echinulin的一维核磁共振氢谱图；
图3为实施例1所得echinulin的一维核磁共振碳谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明提供了一种制备echinulin的新方法：从酿酒原料大曲中分离得到。
发明人在探索白酒中健康功能因子的过程中，首次发现酿酒原料大曲中存在echinulin，为从大曲中分离制备echinulin提供了可能，也为该化合物的大量获得提供了新的方法。
进一步地，本发明创造性地将硅胶正相柱层析、葡聚糖凝胶柱层析等多种分离技术相结合，从成分复杂的大曲中首次分离得到了纯度在98％以上的
echinulin。采用质谱、核磁等检测手段对纯品目标化合物进行了定性分析，确定该化合物为echinulin。
目前，尚未见大曲中存在echinulin的相关报道，更未见从大曲中分离制备出echinulin的报道。
实施例1采用本发明方法制备echinulin
(1)取浓香型纯小麦中温曲(完全以小麦为原料制备得到，控制曲坯品温35～60℃)10kg，粉碎，加入20kg甲醇，于20℃提取2次，每次15天，提取液过滤，经减压浓缩得到大曲粗提物。向大曲粗提物中加入10l蒸馏水，于60℃分散均匀，于分液漏斗中加入10l石油醚萃取3次，收集石油醚相，经减压浓缩后得到大曲浸膏120g。
(2)将大曲浸膏与100目正相硅胶按重量比1:1均匀搅拌，进行硅胶正相柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱试剂，以20:1，10:1，5:1，2:1，1:1(石油醚/乙酸乙酯，v/v)的比例进行梯度洗脱，每个比例洗脱4升；将2:1洗脱部分分段收集，进行薄层层析分析(石油醚/丙酮，3:1，v/v)，将rf值为0.25的样品合并，进行减压干燥，得到组分q-5。
(3)将步骤(2)得到的组分q-5过葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱试剂，以1:1(氯仿/甲醇，v/v)的比例进行洗脱，洗脱液经薄层层析分析(石油醚/丙酮，3:1，v/v)，将rf值为0.25的样品合并，减压干燥，得到q-5-4；将组分q-5-4进一步过葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱层析，以甲醇为洗脱试剂进行洗脱，洗脱液经薄层层析分析(石油醚/丙酮，3:1，v/v)，将rf值为0.25的样品合并，减压干燥。
(4)将步骤(3)所得到的目标化合物溶解于甲醇中，重结晶2次，得到纯品化合物85mg，经hplc分析，含量为98％。
采用质谱(hr-esi-ms)分析步骤(4)得到的纯品化合物，所测结果：[m+na]+为484.11，见图1；采用核磁1h-nmr(400mhz,cdcl3)分析步骤(4)得到的纯品，数据为δ8.05(1h,s),7.13(1h,s),6.80(1h,s),6.07(1h,dd,j＝17.2,10.8hz),5.97(1h,s),5.66(1h,s),5.42(1h,t,j＝7.9hz),5.34(1h,t,j＝7.9hz),5.16(1h,d,7.2hz),5.14(1h,s),4.40(1h,brd,j＝7.9hz),4.10(1h,dd,j＝14.0,7.2hz),3.64(1h,dd,j＝14.8,4.0hz),3.52(2h,d,j＝7.2hz),3.38(2h,d,j＝7.2hz),3.19(1h,dd,j＝14.4,12.0hz),1.87(3h,s),1.80(3h,s),1.74(6h,s),1.52(3h,d,j＝6.8hz),1.50(6h,s)，见图2；13c-nmr(100mhz,cdcl3):δ168.5,167.9,146.0,141.6,134.1,133.2,132.5,131.8,129.2,124.6,123.6,123.1,123.0,115.3,112.6,104.3,54.8,51.0,39.2,34.4,31.2,29.4,27.7,27.6,25.5,25.4,19.6,17.7,17.6，见图3。以上波谱数据证明该化合物是echinulin，即：3s,6s,3-[[2-(1,1-二甲基-2-丙烯)-5,7-二(3,3-二甲基丙烯基)-1h-吲哚-3-基]甲基]-6-甲基-2,5-哌嗪二酮。
实施例2采用本发明方法制备echinulin
(1)取浓香型纯小麦中温曲(完全以小麦为原料制备得到，控制曲坯品温35～60℃)10kg，粉碎，加入30kg乙酸乙酯，于30℃提取3次，每次5天，提取液过滤，经减压浓缩后得到大曲浸膏220g。
(2)将大曲浸膏与300目正相硅胶按重量比1:1均匀搅拌，进行硅胶正相柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱试剂，以20:1，10:1，5:1，2:1，1:1(石油醚/丙酮，v/v)的比例进行梯度洗脱，每个比例洗脱6升；薄层层析分析(石油醚/丙酮，3:1，v/v)，将含有rf值为0.25样品的部分合并后减压干燥，得到组分a4。
(3)将上述步骤(2)中得到的组分a4进一步过葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱试剂，以1:1(氯仿/甲醇，v/v)的比例进行洗脱，薄层层析分析(石油醚/丙酮，3:1，v/v)，将含有rf值为0.25样品合并，减压干燥。
(4)将步骤(3)中得到的目标化合物溶解于石油醚/乙酸乙酯混合液中，重结晶4次，得到纯品化合物120mg，经hplc分析，含量达到98％以上。
采用质谱(hr-esi-ms)分析步骤(4)得到的纯品化合物，所测结果：[m+na]+为484.11；采用核磁1h-nmr(400mhz,cdcl3)分析步骤(4)得到的纯品，数据为δ8.05(1h,s),7.13(1h,s),6.80(1h,s),6.07(1h,dd,j＝17.2,10.8hz),5.97(1h,s),5.66(1h,s),5.42(1h,t,j＝7.9hz),5.34(1h,t,j＝7.9hz),5.16(1h,d,7.2hz),5.14(1h,s),4.40(1h,brd,j＝7.9hz),4.10(1h,dd,j＝14.0,7.2hz),3.64(1h,dd,j＝14.8,4.0hz),3.52(2h,d,j＝7.2hz),3.38(2h,d,j＝7.2hz),3.19(1h,dd,j＝14.4,12.0hz),1.87(3h,s),1.80(3h,s),1.74(6h,s),1.52(3h,d,j＝6.8hz),1.50(6h,s)；13c-nmr(100mhz,cdcl3):δ168.5,167.9,146.0,141.6,134.1,133.2,132.5,131.8,129.2,124.6,123.6,123.1,123.0,115.3,112.6,104.3,54.8,51.0,39.2,34.4,31.2,29.4,27.7,27.6,25.5,25.4,19.6,17.7,17.6，以上波谱数据证明该化合物是环二肽echinulin，即：3s,6s,3-[[2-(1,1-二甲基-2-丙烯)-5,7-二(3,3-二甲基丙烯基)-1h-吲哚-3-基]甲基]-6-甲基-2,5-哌嗪二酮。