本发明属于生物发酵工程技术领域，涉及一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法。
背景技术：
普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，由麦芽三糖经 α-1，6-糖苷键反复连接而形成的的高分子直链多糖 。由于普鲁兰多糖含有众多羟基基团，因此具有较强的吸水性，其吸水膨胀，溶解能力极好。同时普鲁兰多糖无毒、安全、耐热 、耐盐、耐酸碱、粘度热稳定性好、可塑性强、可成膜且隔气性佳透湿性强而且还具有附着性、粘附性、分解性，可改善物性保持水分、成形性、纺纱性等特性。因此普鲁兰多糖已广泛应用于化妆品、医药，食品、化工、环保、农药、轻工和化工等领域。国家卫生部已发布普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味料和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。
果葡糖浆是由植物淀粉水解和异构化制成的淀粉糖晶。生产果葡糖浆不受地区和季节限制，设备比较简单，投资费用较低。因为它的组成主要是果糖和葡萄糖；故称为“果葡糖浆”。果葡糖浆是与蔗糖一样可广泛应用在食品及饮料行业。随着我国2000年糖业政策的调整，蔗糖价格开始上涨，果葡糖浆代替蔗糖应用于食品及工业中的性价比优势逐渐显露出来，国内一些大的淀粉糖企业开始果葡糖浆的生产，果葡糖浆在中国的发展迎来了一次难得的机遇。但是如何利用果葡糖浆替代蔗糖进行普鲁兰多糖的生产是目前需要解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法。本发明利用F55型的果葡糖浆对原有配方中的蔗糖进行了替换。不仅可以提高普鲁兰多糖的产量而且可以降低生产的成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养2-3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养25-30个小时；
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以2-3％接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.02MPa，通风量0.5vvm，培养80-88个小时；
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。
作为优选的技术方案，本发明可以采用以下技术措施：
按质量分数计，斜面培养基组成：新鲜马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水。
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
发酵培养基组成：MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。 将蔗糖以160 g/L-260 g/L的果葡糖浆进项替换。
进一步地，提取时加入2倍体积的乙醇应为预冷的无水乙醇。采用预冷的无水乙醇可使普鲁兰多糖的提取效果更好，能使普鲁兰多糖提取的更加充分。
本发明的有益效果及优点在于：
微生物在生长过程中利用的糖类物质都需要分解成单糖进行利用，出芽短梗霉在发酵产普鲁兰多糖时，将蔗糖降解为葡萄糖和果糖利用。而果葡糖浆主要是由果糖和葡萄糖组成，与蔗糖作为碳源相比果葡糖浆作为碳源省去了由二糖分解成单糖的过程，消耗较少的能量就能进入到普鲁兰多糖的合成途径。因而这可能是果葡糖浆能提高出芽短梗霉发酵产普鲁兰多糖的重要原因。
具体实施方式：
对比例1
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养2-3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.02MPa，通风量0.5vvm，培养80-88个小时；
发酵培养基组成：蔗糖90g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为56 g/L。
实施例1
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.02MPa，通风量0.5vvm，培养80个小时；
发酵培养基组成：果葡糖浆160g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。 果葡糖浆为F55型的果葡糖浆；
（5）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为59 g/L，与对比例一相比，普鲁兰多糖产量提高，说明以果葡糖浆替代蔗糖作为碳源可行。
实施例2
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养2-3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.02MPa，通风量0.5vvm，培养80-88个小时；
发酵培养基组成：果葡糖浆180g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。 果葡糖浆为F55型的果葡糖浆；
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为60 g/L，其产量与对比例一产量要高，但从原料上看，生产相同质量的普鲁兰多糖，用果葡糖浆比用蔗糖要便宜。
实施例3
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养2-3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.02MPa，通风量0.5vvm，培养88个小时；
发酵培养基组成：果葡糖浆200g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为62 g/L，与对比例一相比，普鲁兰多糖的产量提高了9.67%。
实施例4
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.002MPa，通风量0.5vvm，培养80个小时；
发酵培养基组成：果葡糖浆230 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。 果葡糖浆为F55型的果葡糖浆；
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为64 g/L，与对比例一相比，普鲁兰多糖的产量提高了12.5%。
实施例5
一种以果葡糖浆作为碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃冰箱中的PDA斜面菌种，于28℃生化培养箱中培养3小时，制备活化后的斜面种子；
本发明利用的菌株为出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans），该菌株已经于2012年12月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号码CGMCC NO.7055。
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，28℃，摇床转速180rpm培养28个小时；
种子培养基组成：蔗糖90 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 2.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、酵母浸粉 4.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。
（3）发酵罐发酵培养：按照发酵培养基体积计量，以3％的接种量，将步骤（2）中制备的种子液接种于发酵培养基中，控制发酵温度28℃，罐压0.002MPa，通风量0.5vvm，培养80-88个小时；
发酵培养基组成：果葡糖浆260 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、NaCl 3.5 g/L、蛋白胨 6.0 g/L，余量为水。pH调至6.2，121 ℃灭菌 20 min。 果葡糖浆为F55型的果葡糖浆；
（4）提取：发酵结束后，将所得发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分搅拌，4℃静置24小时使普鲁兰多糖充分沉淀，过滤后用无水乙醇再次冲洗，烘干即得到普鲁兰多糖粗产品。经计算得普鲁兰多糖粗多糖的产量为64.5g/L，与对比例一相比，普鲁兰多糖的产量提高了15.1%。
以上各实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，本领域的技术人员应当理解其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，若他人对以上实施例作任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。