棉铃虫E75基因及其在RNA介导的害虫防治应用的制作方法

本发明涉及昆虫生长生殖调控与生物技术领域，尤其涉及一种棉铃虫e75基因及其在rna介导的害虫防治应用。

背景技术

棉铃虫helicoverpaarmigera(hübner)是一种世界性分布、多食性的重要农业害虫之一，危害棉花、玉米、小麦、番茄等多种作物，造成巨大的经济损失。转基因bt(bacillusthuringiensist)棉的广泛应用有效的控制棉铃虫的危害，但是棉铃虫对转bt棉花的抗性问题也在显著增加，与此同时棉铃虫对其它非转基因作物的危害也在逐年加剧。因此，随着社会的不断发展，迫切需要有新的害虫防治方法结合或替代bt作物以实现现代农业的可持续发展。

rna干扰(rnainterference,rnai)是几年来发现的一种重要基因沉默手段，该技术通过双链rna(dsrna,double-strandedrna,双链核糖核酸)高效特异性降解对应序列的mrna，由于使用rnai技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。目前该技术在植保领域已成为新的害虫防治手段，其利用昆虫自身基因片段，通过rnai抑制昆虫体内生长发育或生化代谢中关键基因的表达，以控制害虫为害。在2007年，已有文章报道利用转基因技术表达靶标害虫致死基因的dsrna来控制害虫(baumetal.,2007.controlofcoleopteraninsectpeststhroughrnainterference.nat.biotechnol.25,1322-1326；maoetal.,2007.silencingacottonbollwormp450monooxygenasegenebyplant-mediatedrnaiimpairslarvaltoleranceofgossypol.natbiotechnol.25(11):1307-1313；luoetal.,2017.atransgenicstrategyforcontrollingplantbugs(adelphocorissuturalis)throughexpressionofdouble-strandedrnahomologoustofattyacyl-coenzymeareductaseincotton.newphytol.215(3):1173-1185.)，2017年还有科学家发现将将干扰保幼激素结合蛋白juvenilehormonebindingprotein(jhbp)与bt毒素结合可以更好地防治棉铃虫(nietal.,2017.next-generationtransgeniccotton:pyramidingrnaiandbtcountersinsectresistance.plantbiotechnolj.15(9):1204-1213.)，rnai技术凭借其抗虫专一性、对非靶标生物无杀伤作用和对环境无毒无害的优势，在农业植保防治领域具有广阔的发展前景，而实现基于rnai害虫有效控制的关键问题是筛选害虫特异性及对其生长发育有明显抑制作用的靶标基因。

昆虫的生长发育、蜕皮、变态、滞育、生殖、多型现象等生理过程以及行为反应等都离不开激素的参与，昆虫激素已成为杀虫剂研究与开发的一个重点领域，不同于以往作用于神经系统的传统杀虫剂，其作用毒性低、污染少、对天敌和有益生物影响小，有助于可持续农业的发展、有利于无公害绿色食品生产、有益于人类健康。

蜕皮激素，是由前胸腺合成的包含27个碳原子的甾醇类激素，在昆虫体内以20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20e)的形式存在，蜕皮激素诱导幼虫蜕皮、幼虫的化蛹以及蛹到成虫的羽化，同时对绝大多数昆虫的生殖功能有一定促进作用。昆虫蜕皮激素转录因子(transcriptionfactor)在调控蜕皮及变态过程的相关基因表达时起着重要作用，是蜕皮相关基因的典型的表达产物，e75是一种的激素诱导因子基因，该基因含有核受体家族基因的保守功能域(billasetal.,2009.thestructureandfunctionofecdysonereceptor.inecdysone:structuresandfunctions(smagghe,g.,ed.),pp.335–360.springer,berlin)，目前已有文献公开e75基因在昆虫的发育变态及生殖发挥重要作用。由于蜕皮激素是昆虫调节昆虫生长发育的重要激素，且为昆虫特有，故针对蜕皮激素分子作用途径作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发新型的杀虫剂，应用于害虫防治具有很大的潜力。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题在于提供一种棉铃虫e75基因及其在rna介导的害虫防治应用，以解决上述背景技术中的缺点。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

棉铃虫e75基因，包括如seqidno:1所示的核苷酸序列、如seqidno:2所示的氨基酸序列及如seqidno:3所示的靶标基因序列，具体序列如下：

seqidno:1

seqidno:2

seqidno:3

taatacgactcactatagggaacgggactccatacaaagtggcgccaatgcaaggttccttgtggattctacttttaaattcgccgaacgcatgaactctatgaacttaacagatgcagaaatcggtctattctgcgctatagtgctcatcactccggacaggccgggacttcgcaatgtagaactcgtggaaagaatgcatgcgcgtctgaaggcatgcctgcaaactgtggtcgcccagaacagacctgaccgaccaggtttcctcagagaactaatggacaccctccccgacctccgcactctcagcacacttcatactgagaagctagtagttttccgaactgaacacaaggaattactacggcagcagatgtggaccgatgaagagggtgtgatgtcgtggggagattccggcgctgacgagtcagcacgcagccccattgggtctgtgtccagcagcgaatccctatagtgagtcgtatta。

棉铃虫e75基因的dsrna制备方法，具体步骤如下：

(1)根据棉铃虫e75氨基酸序列特征，选择特征结构域，设计e75基因的上游引物如seqidno:4所示和下游引物如seqidno:5所示：

seqidno:4taatacgactcactatagggaacgggactccatacaaagt

seqidno:5taatacgactcactatagggattcgctgctggacacaga；

(2)以含有核苷酸序列seqidno:1的质粒为模板，运用步骤(1)所述的上游引物与下游引物进行pcr扩增获得含有seqidno:3的dna片段，该片段含有t7启动子，核苷酸序列长度为487bp；

(3)对含有seqidno:3的dna片段滴加菌液培养，而后提取菌质粒；

(4)以步骤(3)获得的菌质粒为模板，运用步骤(1)所述的上游引物与下游引物进行pcr扩增，得pcr产物；

(5)通过dna产物纯化试剂盒对步骤(4)所得pcr产物进行纯化后，进一步使用hiscribe^tmt7quickhighyieldrnasynthesiskit(neb，e2050s)试剂盒按照说明书经体外反转录合成dsrna。

本发明还提供一种棉铃虫e75基因在rna介导的害虫防治方面应用，所述rna介导中，合成的dsrna通过显微注射方式进入棉铃虫体内。

所述dsrna注射体积为2μl，注射浓度为5μg/μl，注射部位是棉铃虫的第8节与第9节的腹间节间膜。

所述的棉铃虫为5龄棉铃虫。

本发明获得棉铃虫e75基因，是昆虫生长发育的关键激素诱导基因，针对该基因选择一个含有seqidno:3的靶标片段，进而合成dsrna；而后将合成的dsrna通过显微注射的方式导入到棉铃虫5龄幼虫体内，以绿色荧光蛋白(gfp)合成dsrna介导注射的个体为阳性对照，以注射无菌水的个体为空白对照，统计注射后的棉铃虫畸形率和化蛹率，观察表型；同时利用荧光定量pcr方法分析该基因的沉默效果。

有益效果：本发明以棉铃虫含有seqidno:3基因作为干涉靶标基因，对棉铃虫进行注射干扰，沉默基因的转录表达，在棉铃虫e75基因表达受抑制后，棉铃虫蜕皮变态过程受破坏，有效降低棉铃虫的化蛹率，进而控制控制其种群数量；研究基础好，前瞻性高，且害虫产生抗性的风险低，为创制新型生物杀虫剂及植物抗虫基因工程提供理论基础。

附图说明

图1为本发明的最佳实施例中的棉铃虫e75基因的功能结构域分布示意图。

图2为本发明的最佳实施例中的dsrna琼脂糖凝胶电泳结果示意图。

图3为本发明的最佳实施例中的注射有e75基因mrna表达示意图。

图4为本发明的最佳实施例中的注射有e75基因dsrna的棉铃虫异常表型示意图。

图5为本发明的最佳实施例中的注射有e75基因dsrna的棉铃虫化蛹率示意图。

附图标注：

图2中，a为e75-dsrna电泳图，b为gfp-dsrna电泳图；

图3中，ck:注射无菌水的空白组，dsgfp：注射gfp-dsrna的对照组，dse75：注射e75-dsrna的实验组；

图5中，ck:注射无菌水的空白组，dsgfp：注射gfp-dsrna的对照组，dse75：注射e75-dsrna的实验组。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实验室前期对不同龄期的棉铃虫进行转录组测序，以获取大量棉铃虫基因序列，而后利用生物信息学技术及相关在线软件对棉铃虫转录组进行分析，再通过利用ncbiblast等在线程序，获取棉铃虫e75基因的cdna序列，如seqidno:1所示；

根据棉铃虫e75基因的cdna序列，利用在线蛋白质翻译软件expasy-translatetool将核苷酸序列进行翻译，氨基酸序列如seqidno：2所示；

供试昆虫

棉铃虫为江西农业大学室内用人工饲料饲养，饲养温度为27±2℃，相对湿度为70±5％，光照为14:10(l:d)；

实施例1获取棉铃虫e75基因的cdna序列

1、提取棉铃虫总rna

棉铃虫总rna提取的整个过程在无菌操作台内进行，所用试剂及耗材均是无rnaase，具体步骤如下：

1)收集新鲜的棉铃虫组织，然后加入至用液氮冷冻过的无菌组织研磨器内，迅速加入1ml的trizol试剂，充分研磨组织，再利用无rna酶的枪头将匀浆液转移至无rnaase的1.5ml离心管中进行离心处理后，冰浴静置5～10min；离心管转速12000rpm，温度4℃，离心时间10min；

2)将步骤3)中离心后的上清液(约900μl)转移至新的无rna酶离心管中；

3)在步骤2)的无rna酶离心管上清液中加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置3～5min；

4)将步骤3)中装有氯仿的无rna酶离心管进行离心处理，离心管转速12000rpm，温度4℃，离心15min，离心后分层，采用200μl的无rnaase枪头分步吸取上层水相(约400-500μl)转移至新的无rna酶1.5ml离心管中；

5)在步骤4)新的无rna酶的1.5ml离心管中加入500μl异丙醇，震荡混匀，室温放置10min沉淀rna；

6)对步骤5)中的离心管进行离心处理后，采用枪头吸干离心的上清液，并将上清液转移至新的无rna酶1.5ml离心管中，加入1ml预冷的75％乙醇，缓慢吸打，以吹起白色沉淀；离心管转速12000rpm，离心时间10min，温度4℃；

7)将步骤6)中装有白色沉淀的离心管进行离心处理，离心管转速7500rpm，离心时间5min，温度4℃，而后吸干离心后的上清液，并在无菌操作箱内干燥10min，注意不要干燥过度，以免rna难以溶解；

8)用25μl的无rnase水溶解步骤7)中的沉淀，以获得rna溶液；

9)取1μl步骤8)获得的rna溶液用无菌水稀释至10μl，其中5μl用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测步骤8)中所得rna提取的完整性，5μl用紫外分光光度计测定步骤8)中所得rna浓度，剩余rna用于后续cdna的合成。

实施例2棉铃虫e75基因靶标片段的克隆及dsrna的制备

i、设计特异性引物

根据e75基因特征，选取该基因dna结合区上的基因片段，通过注射法研究其对昆虫的影响，dna结合区是调控昆虫激素核受体转录的重要区域，在昆虫激素调节功能中发挥重要作用，因此选取这段靶标序列，观察该基因沉默后对棉铃虫发育变态的影响；选用的对照基因为绿色荧光蛋白gfp基因，由于gfp基因在昆虫体内并不存在，故大量的研究将其作为对照基因合成dsrna；

利用primerpremier5.0软件，参照rna引物的设计原则设计特异性引物，设计的特异性引物序列如表1所示：

表1特异性引物

ii、制备dsrna

a)以含有seqidno:1的质粒为模板，采用高保真dna聚合酶进行pcr扩增，pcr反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸5min；pcr反应体系共25μl，包括：浓度为400ng/μl的质粒模板1μl，浓度为10μm的上下游引物各0.5μl，dntp(10μm)0.5μl，5×buffer5μl，dnapolymerase0.5μl以及无菌水17μl，获得的pcr产物经过胶回收后纯化后亚克隆转化至大肠杆菌中并测序，测序结果如seqidno:3所示；

b)将步骤a)中测序正确的大肠杆菌菌液扩大培养，在玻璃试管中加入5ml菌液，温度37℃，摇菌转速200rpm的条件下培养16h，而后提取菌质粒；

c)按照表1中对应的上下游引物序列，以步骤b)得到的菌质粒为模板进行pcr扩增，pcr的反应体系为50μl，反应条件与步骤a)所述一致，取扩增后的pcr产物1μl，加入4μl的无核酸酶水进行稀释，然后采用浓度为1％的琼脂糖凝胶检测pcr片段的长度；

d)将步骤c)中得到的pcr产物使用dna产物纯化试剂盒进行纯化后，再取1μl纯化的产物加入4μl的无核酸酶水进行稀释，然后使用浓度为1％的琼脂糖凝胶检测纯化后产物的条带单一性，同时采用微量紫外分光光度计测定纯化后的pcr产物浓度，利用纯化后的产物作为dsrna的体外转录模板；

e)按照hiscribe^tmt7quickhighyieldrnasynthesiskit(neb，e2050s)试剂盒的使用说明转录合成并纯化得到棉铃虫e75基因的dsrna(如seqidno:3所示)溶液，取1μl合成转录的dsrna采用无核酸酶水稀释10倍，一方面进行dsrna的浓度测定，一方面用1％的琼脂糖凝胶检测合成的dsrna的纯度和质量，最后将获得的dsrna溶液浓度稀释到5μg/μl，保存于-80℃冰箱备用；

同时按照上述方式合成并纯化获得gfp-dsrna溶液作为阴性对照。

实施例3验证棉铃虫e75-dsrna抑制棉铃虫变态发育

1、显微注射棉铃虫e75基因的dsrna

选取5龄1d、大小均一、健康状况一致的棉铃虫幼虫，设置注射dsgfp的对照组和注射dse75的实验组，注射前将棉铃虫幼虫在冰上麻醉，然后利用微量注射器将体外合成的dsrna顺着第8节与第9节之间的腹部节间膜注射至棉铃虫幼虫的体腔，dsrna的注射量为10μg/头，每组注射90头，设置3个生物学重复；注射完毕后，将棉铃虫幼虫置于人工饲料的12孔板内饲养；

2、检测棉铃虫e75基因沉默效果

在dsrna注射后0-96h内，每隔24h取样进行基因沉默效果检测，对照组和实验组各取4头，设置3个生物学重复；解剖棉铃虫，提取棉铃虫的总rna并反转录成cdna，使用qrt-pcr技术检测目的基因e75表达量的变化情况，以β-actin作为内参基因校正样本cdna的差异，结果显示在e75基因dsrna注入48h后出现最大的沉默效果达到75.8％(p＝0.002)，而且该沉默效果在其后可以维持至少24h，如图3所示；

3、注射dsrna后棉铃虫发育情况观察

在注射dsrna后发现，e75基因的dsrna处理的实验组棉铃虫无法正常蜕皮，如图3所示，其中对照组为蜕皮正常的棉铃虫，处理组为蜕皮不正常的棉铃虫，蜕皮不正常率高达55％，从而验证e75基因的表达对棉铃虫蜕皮的影响；

如图4所示，棉铃虫e75基因表达受抑制后，蜕皮变态过程受破坏，棉铃虫的化蛹率降低；

综合上述的实验结果，将抑制昆虫生长发育相关基因转录本表达的人工合成物质或从植物筛选的化合物作为抑制剂，如对棉铃虫注射e75的dsrna，可实现害虫防治的目的。

序列表

<110>江西农业大学

<120>棉铃虫e75基因及其在rna介导的害虫防治应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1836

<212>dna

<213>helicoverpaarmigerae75基因核苷酸序列()

<400>1

atggtatcagacatgggagaagatttaccaatcctcaaggggatcctcaacggcgtggtg60

aaatatcacaatgcacccgtgcggttcggacgtgttccaaaacgcgagaaagcgcgcatc120

cttgcagcgatgcagcaatcctctacgtcacgagcaaatgagcaggctgcggccgcagag180

ctcgatgatgccccgagattgctggcgcgagtggtgcgcgctcacctcgacacctgcgag240

ttcacgcgagatcgtgtcgccgccatgcgcgcacgtgctcgcgactgtcccacctactcg300

caacccactctggcttgcccgctaaacccggcgccagagctacagtctgagaaggaattc360

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tcagcacgcagccccattgggtctgtgtccagcagcgaatccggcgaagccgtcggagac1020

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tccgtagatgaagaagcacttggcgtggctcatctagctcacaacggactcactgtaacc1140

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cgcgtcgtgcggccagcgccttccacccagccgccccagcatccgcaccccgccagcccg1500

gcgcacccggcgcactcgccgcgcccgctgcgcgcctcgctgtcctccacgcactccgtg1560

ctggccaagagcctgatggaggggccgcgcatgacgccggagcagctgaagcgcaccgac1620

atcatccagcagtacatgcggcgcggcgaggcgggagcgcccgagtgccccatgcgcacg1680

ggcggcctgctcacgtgctaccgcggcgcctcgcccgcgccgcagcccgtcatggcgctg1740

caggtggacgtgtcggacgccgacgcgccgctcaacctctccaagaagtcgccgtcgccg1800

ccgcgctccttcatgccacagatgttggaggcgtga1836

<210>2

<211>611

<212>helicoverpaarmigerae75基因氨基酸序列

<400>2

mvsdmgedlpilkgilngvvkyhnapvrfgrvpkrekarilaamqqsstsraneqaaaae60

lddaprllarvvrahldtceftrdrvaamrarardcptysqptlacplnpapelqsekef120

sqrfahvirgvidfaglipgfqlltqddkftllksglfdalfvrlicmfdaplnsiicln180

gqvmkrdsiqsganarflvdstfkfaermnsmnltdaeiglfcaivlitpdrpglrnvel240

vermharlkaclqtvvaqnrpdrpgflrelmdtlpdlrtlstlhteklvvfrtehkellr300

qqmwtdeegvmswgdsgadesarspigsvsssesgeavgdcgtpllaatlagrrrldsrg360

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iiqqymrrgeagapecpmrtgglltcyrgaspapqpvmalqvdvsdadaplnlskkspsp600

prsfmpqmlea612

<210>3

<211>487

<212>dna

<220>

<221>上游t7启动子

<222>(1??20)

<220>

<221>下游t7启动子

<222>(467??487)

<400>3

taatacgactcactatagggaacgggactccatacaaagtggcgccaatgcaaggttcct60

tgtggattctacttttaaattcgccgaacgcatgaactctatgaacttaacagatgcaga120

aatcggtctattctgcgctatagtgctcatcactccggacaggccgggacttcgcaatgt180

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cactctcagcacacttcatactgagaagctagtagttttccgaactgaacacaaggaatt360

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tgacgagtcagcacgcagccccattgggtctgtgtccagcagcgaatccctatagtgagt480

cgtatta487