本发明属于均相荧光免疫分析技术领域，具体涉及一种穴状螯合剂及其制备方法。
背景技术
均相免疫分析是一种不需通过反复冲洗来分离结合与游离标记物，在液相中可直接测量的分析方法。此方法操作简便，快速，易于实现自动化操作，故长期以来成为免疫分析方法学研究追求的主要目标之一。
boguslaski等曾用荧光染料代替酶标记均相免疫分析方法。但液相产生raman散射及其大分子产生的300-600nm的本底荧光，与测量荧光波长大部分相重叠，且其荧光寿命在1-50ns，降低了信/噪比，使分析的灵敏度降低。均相免疫分析的灵敏度还有一个限制因素是其测量信号依赖加入启动剂或淬灭剂产生的测量信号或清除测量信号，这种机制难以提供足够强的测量信号。
将能量转移的理论与时间分辨荧光免疫分析(trfia)技术相结合，称之为均相trfia,为解决上述两个问题提供了新的途径。
均相trfia具备了高灵敏性及高度稳定性分析特点。而要达到这些要求的关键是“理想”的螯合剂。这样的螯合剂的三重态能量水平要高，其发射波长要与受体激发波峰相重叠，此外也要具备通常稀土螯合剂的特点，如高发光效率，动力稳定性，与稀土离子高强度结合能力，排除水分子和淬灭的能力以及以生物大分子偶联后尽可能保持其生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种穴状螯合剂及其制备方法，该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性，荧光寿命长。
本发明首先提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：
其中，r1选自oh、nh2、
n选自1～10的整数；
r2选自h、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基。
优选的是，所述的n选自2～5的整数；
优选的是，所述的r2选自h、甲氧基、氨基或羧基。
优选的是，所述穴状螯合剂的结构式如式ⅰ至iii所示：
本发明还提供穴状螯合剂的制备方法，该方法包括：
步骤一：将溶剂、n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺、li2co3加入到反应瓶中，回流0.5-1.5h，然后滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯溶液,继续后反应30-50h,冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸,进行柱层析分离得第一中间体；
步骤二：将溶剂、步骤一得到的第一中间体加入到反应瓶中，再将eucl3溶液加入，搅拌回流，继续反应20-40h，冷却至室温，得到第二中间体；
步骤三：将步骤二得到的第二中间体在碱性条件下水解，或者加入胺类化合物反应，得到穴状螯合剂。
优选的是，所述步骤一中n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺与6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯摩尔比为1:(1～2.5)。
优选的是，所述步骤二中溶剂为甲醇。
优选的是，所述步骤二中第一中间体与eucl3摩尔比为1:(1～3)。
优选的是，所述步骤三的碱性水解条件为3～6h。
优选的是，所述的步骤三的反应温度为-30～0℃，反应时间为4～10h。
本发明的有益效果
本发明提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示，所述的穴状结构的螯合剂,在吡啶4位上引入单连接基团用于蛋白质标记，该结构有利于减少标记过程的非特异性反应，从而提高检测体系的灵敏度。该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性、有合适的激发波长、发射波长，能与稀土离子实行能量转移的三重态和允许在螯合剂和生物分子之间形成共价连接的功能基团，并具有较长的荧光寿命。实验结果表明：本发明的螯合剂激发光谱波长范围为258-356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰595、611nm，615nm，荧光寿命﹥800μs。
本发明还提供了一种穴状螯合剂的制备方法，该制备方法简单、原料易得，将制备得到的螯合剂标记牛血清白蛋白(bsa)标记物的激发光谱、发射光谱及荧光寿命，为螯合剂用于均相时间分辨荧光免疫分析提供了依据。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的c4的质谱图；
图2为本发明实施例1制备得到的螯合剂c6的质谱图；
图3为本发明实施例5制备的螯合剂c6水溶液的荧光光谱；
图4为本发明实施例5制备得到的螯合剂c6的荧光寿命图；
图5为本发明实施例14制备得到的bsa-c8标记物的荧光光谱；
图6为本发明实施例14制备得到的bsa-c8标记物的荧光寿命图。
具体实施方式
本发明首先提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：
其中，r1选自oh、nh2、
n选自1～10的整数；优选为2～5的整数；
r2选自h、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基，优选为h、甲氧基、氨基或羧基。
按照本发明，所述穴状螯合剂的结构式如式ⅰ至iii所示：
按照本发明，所述的螯合剂结构为联吡啶穴状螯合剂,在吡啶4位上引入蛋白质连接基团，有利于减少反应体系对荧光的淬灭，从而提高检测系统的灵敏度。该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性、水溶性、有合适的激发波长、发射波长，能与稀土离子实行能量转移的三重态和允许在螯合剂和生物分子之间形成共价连接的功能基团，并具有较长的荧光寿命。
本发明还提供穴状螯合剂的制备方法，该方法包括：
步骤一：将溶剂、n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺、li2co3加入到反应瓶中，回流0.5-1.5h，然后滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯的溶液,继续后反应30-50h,冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸,进行柱层析分离得第一中间体；
所述的溶剂优选为乙腈，所述的n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺与6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯摩尔比优选为1:(1-2.5)；更优选为1:(1.5-2)。所述的滴加时间优选为1-2.5h；具体反应如下：
步骤二：将溶剂、步骤一得到的第一中间体加入到反应瓶中，再将eucl3溶液加入，搅拌回流，继续反应20-40h，冷却至室温，得到第二中间体；
所述步骤二中溶剂优选为甲醇，所述的第一中间体与eucl3摩尔比优选为1:(1～3)，更优选为1：2；反应如下：
步骤三：将步骤二得到的第二中间体在碱性条件下水解，或者加入胺类化合物反应，得到穴状螯合剂。
按照本发明，所述的碱性条件下水解优选为：将第二中间体溶于ch3oh后加入反应瓶中，搅拌的状态下加入1-2mol/l的lioh水溶液进行水解，所述的水解时间优选为3-6h，更优选为3.5h，将反应液用甲醇清洗后倒入烧杯中在80-90℃加热蒸干，得黄色固体水洗烘干，再用甲醇、四氢呋喃溶解析出，真空干燥，获得螯合剂。
按照本发明，所述的加入胺类化合物进行反应，优选是将第二中间体溶于极性溶剂中，然后加入胺类化合物进行反应，所述的反应温度优选为-30～0℃，反应时间优选为4～10h；将反应产物进行离心、干燥，用hplc-ms分离纯化。所述的第二中间体和胺类化合物的摩尔比优选为1：(1～15)，更优选为1：(5～6)；所述极性溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种。反应如下：
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，实施例中涉及到的原料均为商购。
实施例1螯合剂式ⅰ的制备
将化合物n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺0.338mmol及li2co3(3.387mmol)溶于乙腈267ml,升温至回流1h，在1.0h内缓慢滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯(0.339mmol)的乙腈溶液67ml，回流反应30h后，冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸得粗产物,通过柱层析分离得产物第一中间体c4，产率为51.5％；
将第一中间体化合物c4(7.91×10-5mol)、甲醇30ml、eucl3(2.32×10-4mol)甲醇溶液加入到反应瓶中，搅拌回流23h，冷却至室温，氮气吹干，得到47mg白色沉淀物第二中间体c5，无需纯化，干燥备用；
将第二中间体化合物c5(7.01×10-5mol)溶于10mlch3oh中,分步加入1mol/l的lioh·h2o的水溶液0.50ml，搅拌反应6h，将反应液加热至85℃，蒸干得固体，水洗后烘干，用甲醇溶解固体，再加入四氢呋喃，溶液析出乳白色絮状物，再用四氢呋喃清洗后真空烘干，获得25.7mg乳黄色固体即c6螯合剂式ⅰ，产率47.6％。
图1为实施案例1合成的化合物c4的质谱，ms(70ev)m/z(％):(m+na)+＝655.3与化合物c4加na的分子量理论值加和相符。
图2为实施案例1合成的化合物c6的质谱图，c6的分子量理论值是771.1，ms(70ev)m/z(％):(m+dhb-1)+＝923.1、(m+dhb-2)+＝924.1、(m+dhb)+＝925.1、(m+dhb+1)+＝926.1、(m+dhb+2)+＝927.1与螯合剂加激发基质(dhb)的质量理论值相符。
实施例2螯合剂式ⅰ的制备
将化合物n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺(0.338mmol)及li2co3(3.387mmol)乙腈液,升温至回流1h后，在1.0h内缓慢滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯(0.507mmol)的乙腈溶液，反应35h，冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸得粗产物,过柱层析分离得产物第一中间体c4，产率为53.9％。
将第一中间体化合物c4(7.91×10-5mol)与绝对甲醇30ml、eucl3(1.58×10-4mol)甲醇溶液加入到反应瓶中，搅拌并升温至回流，继续反应23h，冷却至室温，氮气吹干杯中液体，得到47mg白色沉淀物第二中间体c5。
将第二中间体化合物c5(7.01×10-5mol)溶于10mlch3oh的反应瓶中,搅拌的状态下加入1mol/l的lioh·h2o的水溶液0.25ml，搅拌后再加入少部分lioh·h2o水溶液，继续反应5h结束。将反应液倒入烧杯中，电热炉上加热,升温至86℃，蒸干得黄色固体，水洗固体后烘干。用甲醇溶解固体，再用四氢呋喃加入到溶液中，析出乳白色絮状沉淀，去除上清液，所剩沉淀用少量四氢呋喃清洗，放于真空烘箱中烘干，获得25.7mg乳黄色固体即c6螯合剂式ⅰ，产率47.6％。
实施例3螯合剂式ⅰ的制备
将化合物n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺(0.338mmol)及li2co3(3.387mmol)乙腈溶液,升温至回流1h后，在1.0h内缓慢滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯(0.676mmol)的乙腈溶液，反应40h结束，冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸得粗产物,通过柱层析分离得产物第一中间体c4，产率为54.2％；
将第一中间体化合物c4(7.91×10-5mol)与绝对甲醇30ml、eucl3(8.13×10-5mol)甲醇溶液加入到反应瓶中，搅拌回流反应23h，冷却至室温，氮气吹干液体，得到47mg白色沉淀物第二中间体c5。
将第二中间体化合物c5(7.01×10-5mol)溶于10mlch3oh的反应瓶中,搅拌的状态下分步加入1mol/l的lioh·h2o的水溶液0.50ml继续反应4h结束。将反应液升温至80-90℃，蒸干得黄色固体，水洗后烘干，再用甲醇溶解，再加入四氢呋喃，使溶液析出乳白色沉淀，去除上清液，所剩沉淀用四氢呋喃清洗，真空干燥，获得乳黄色固体螯合剂式ⅰ，产率47.6％。
实施例4螯合剂式ⅰ的制备
将化合物n,n',n,n'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺(0.338mmol)及li2co3(3.387mmol)溶于乙腈,升温至回流1h后，在1.0h内缓慢滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯(0.845mmol)的乙腈溶液67ml，反应45h结束，冷却至室温，抽滤，旋蒸得粗产物,通过柱层析分离得产物第一中间体c4117.2mg，产率为54.8％；
将第一中间体化合物c4(7.91×10-5mol)与绝对甲醇30ml加入到瓶中，再将eucl3(2.32×10-4mol)甲醇溶液加入到反应瓶中，搅拌回流反应在30h，冷却至室温，氮气吹干杯中液体，得到47mg白色沉淀物第二中间体c5；
将第二中间体化合物c5(7.01×10-5mol)溶于10mlch3oh的反应瓶中,搅拌的状态下分步加入1mol/l的lioh·h2o的水溶液0.50ml继续反应3h结束，将反应液加热至80-90℃，蒸干得固体，水洗后烘干。用甲醇溶解，再用四氢呋喃加入到溶液中，使溶液析出白色沉淀，去除上清液，所剩沉淀用四氢呋喃清洗，真空烘干，获得25.7mg乳黄色固体即螯合剂式ⅰ，产率47.6％。
实施例5螯合剂式ii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例1；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，0℃下缓慢加入0.5mmol乙二胺，持续搅拌4h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到化合物c7螯合剂式ii。
实施例5制备得到的c7的质谱(c39h36eun10o)：883.17(m+2cl-)+；元素分析理论值(c39h36eun10o,％)：c57.60,h4.45,n17.24。实际分析结果为：c57.60,h4.49,n17.21。
实施例6螯合剂式ii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例2；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，-5℃下缓慢加入0.35mmol乙二胺，持续搅拌6h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式ii,产率37.6％
实施例7螯合剂式ii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例3；
将0.1mmol的c5溶于乙醇，-15℃下缓慢加入0.4mmol乙二胺，持续搅拌5.5h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式ii,产率37.6％。
实施例8螯合剂式ii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例4；
将0.1mmol的c5溶于乙醇，-20℃下缓慢加入0.3mmol乙二胺，持续搅拌6.0h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式ii，产率37.6％。
实施例9螯合剂式iii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例1；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，-10℃下缓慢加入0.6mmol对苯二胺，持续搅拌4h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到c8螯合剂式iii。
实施例9制备得到的c8的质谱(c43h36eun10o)：931.17(m+2cl-)+；
元素分析理论值(c43h36eun10o,％)：c60.10,h4.20,n16.23。实际分析结果为：c59.6,h4.21,n16.17。
实施例10螯合剂式iii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例2；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，-15℃下缓慢加入1.5mmol对苯二胺，持续搅拌7.0h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式iii,产率26.6％。
实施例11螯合剂式iii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例3；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，-20℃下缓慢加入0.4mmol对苯二胺，持续搅拌7.0h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式iii，产率27.6％。
实施例12螯合剂式iii的制备
第一中间体c4和第二中间体c5的制备同实施例4；
将0.1mmol的c5溶于甲醇，-25℃下缓慢加入0.4mmol对苯二胺，持续搅拌7.5h，反应完成后，离心，真空干燥，用hplc-ms分离纯化，得到螯合剂式iii，产率28.6％。
实施例13螯合剂式ⅰ的光谱特性
取实施例1制备得到的螯合剂，溶解后用二次蒸馏水稀释配成为1.00×10-6mol/l的溶液，所测荧光光谱的激发峰范围为258nm-356nm，最大激发波长为331nm，其荧光光谱特征峰593、616nm(5d0-7f1,5d0-7f2能级跃迁)，荧光寿命为512μs。
图3为本发明实施例1制备的螯合剂水溶液的荧光光谱激发光谱图(a图)和发射光谱图(b图)，由图3可知，激发峰范围为258nm-356nm，最大激发波长为331nm，荧光发射光谱峰593、616nm(5d0-7f1,5d0-7f2能级跃迁)
图4为本发明实施例1制备的螯合剂水溶液的荧光寿命图，荧光寿命为802μs。
实施例14螯合剂式iii标记牛血清白蛋白(bsa)及激发和发射光谱测定
向1mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)1ml溶液中加入0.4mgedc和0.6mgnhs,室温反应30min,加入1.4μlβ-巯基乙醇,用脱盐柱除去多余edc与nhs，并置换缓冲液为0.1mpbsph7.2-7.5保存。
取一定量bsa，按1：15摩尔比加入15倍摩尔量实施例9制备得到的螯合剂式iii，室温反应12h，4℃透析24小时，除去游离螯合剂，将螯合剂式iii标记物(c8-bsa)移取至ep管中，测定抗体浓度并保存。
取标记物c8-bsa，用水稀释后，放置样品池中,以337nm激发c8-bsa标记物，在611nm处为eu3+的特征吸收峰；得其激发和发射光谱如图5。
图5为本发明实施例14制备的标记物c5-bsa水溶液的c8-bsa荧光光谱。由图5可知，337nm为c8-bsa标记物的激发峰，611nm为c8-bsa标记物最大发射峰。
取标记物c8-bsa0.02ml到样品池中，以337.1nm为激发波长激发，获得的标记物c8-bsa水溶液荧光寿命为884μs，如图6。
图6为本发明实施例14制备的标记物水溶液的荧光寿命，由图6可知，标记物水溶液的荧光寿命为884μs。