一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法与流程

本发明属于植物基因工程育种领域，具体涉及一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法。

背景技术

水稻(oryzasatival.)是一年生禾本科植物，草本稻属的一种，也是稻属中作为粮食的最主要最悠久的一种。水稻是世界四大粮食作物之一，同时又是植物遗传学研究的重要模式植物之一。水稻的生产及其相关产业直接关系到国计民生。和我国其他农作物一样，水稻在种植生产过程中也面临着诸如农药污染严重、水资源短缺、土地盐碱化等一系列问题。近年来，水稻转基因技术在实现上述育种目标的进程中发挥着重要的作用。转基因技术是指利用现代分子生物学方法分离克隆目标性状基因，然后通过相应的转化手段将其导入到受体生物中并且能持续稳定遗传并表达，从而改良受体生物原有的性状或赋予其新的性状。

水稻遗传转化的主流方法为农杆菌介导的遗传转化法，其优点为操作简便、转化系统稳定、外源基因拷贝数较低等。l993-1994年，农杆菌介导的水稻遗传转化研究取得了重大突破，研究者首次通过农杆菌介导获得了转基因水稻植株。由于农杆菌介导的遗传转化方法主要是通过诱导愈伤的组织培养方法实现，而水稻组织培养的基因型依赖性很强，同时水稻组织培养再生体系仍普遍存在再生率低、重复性差、基因型依赖强、培养条件烦琐等问题，在很大程度上限制了利用基因工程手段对水稻的遗传改良。因此，亟需一种简便、高效的水稻遗传转化方法，这对水稻分子生物学研究和遗传改良具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有转化技术的不足，提供一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括以下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡60-72小时，取出，再浸入体积浓度为5％-8％次氯酸钠水溶液中，放置15-18分钟，用无菌水漂洗2-4次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于28-30℃培养36-48小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因bar的农杆菌储存液200-300μl，加入到2-5ml灭菌的lb液体培养基中，置于25-28℃摇床中，150-200r/min，进行活化培养24-28h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1-1.5ml活化的农杆菌菌液加入到25-30ml灭菌的lb液体培养基中进行扩大培养，至od600＝0.3-0.4的扩大培养的菌液，取25-30ml扩大培养的菌液置于灭菌的50ml离心管中，5000-8000r/min，25-28℃离心8-10min，收集菌体，将菌体重悬于50-100ml浓度为200-250μm乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，28-30℃培养；

(4)筛选，pcr检测：

长高至5-7cm后移栽至水田中生长；当小苗在水田中长出4-7片新叶，用浓度为150-180mg/l草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再pcr检测，鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻。

生长基质优选为质量比3：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩的混合物。

本发明的优点：

本发明的方法是利用带有裸露生长点的水稻胚芽作为遗传转化受体，从而建立的水稻遗传转化体系的方法，不需要组织培养过程，可直接转到营养土中进行培养，即可获得高频的再生水稻植株，该方法取材方便快捷，不需要经过周期较长的组织培养阶段，无严格的灭菌要求，操作简单、再生率高、生长周期短，用于水稻基因工程操作，对于水稻品质改良具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为带有1-2cm胚芽的水稻个体示意图。

图2为水稻外植体与农杆菌共培养。

图3为穴盘中再生的水稻植株。

图4为移栽的水稻植株。

图5为成活的水稻植株。

图6为一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法获得的转bar基因的小站稻pcr检测电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

含有目的基因bar的农杆菌储存液的制备：

c58农杆菌感受态购自武汉淼灵生物科技有限公司；

质粒pcambia3301(含有基因bar)购自武汉淼灵生物科技有限公司；

将保存的c58农杆菌感受态从-80℃拿出，放在冰上，取出4μl质粒pcambia3301与c58农杆菌感受态100μl混匀，冰浴15min，放入冰上预冷的电击杯中，1500v，电击转化。将菌液吸入1.5ml离心管中，加入400μllb液体培养基，于28℃振荡培养3h，5000r/min，28℃，离心收集菌体，弃上清，重悬菌体，涂板于28℃暗培养3天，筛选出转化成功的含有目的基因bar的农杆菌，加入25％灭菌甘油水溶液，得到含有目的基因bar的农杆菌储存液。

lb液体培养基成分如下:10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l氯化钠，ph为7.0；余量为水。

固体lb培养基成分如下:10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l氯化钠，15g/l琼脂ph为7.0，余量为水。

各实施例的水稻品种以小站稻品种为例，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括如下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡66小时，取出，再浸入体积浓度为7％次氯酸钠水溶液中，放置16分钟，用无菌水漂洗3次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于29℃培养42小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体(见图1)，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因bar的农杆菌储存液250μl，加入到3ml灭菌的lb液体培养基中，置于26℃摇床中，180r/min，进行活化培养26h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1.2ml活化的农杆菌菌液加入到28ml灭菌的lb液体培养基中进行扩大培养，至od600＝0.3的扩大培养的菌液，取28ml扩大培养的菌液置于灭菌的50ml离心管中，7000r/min，27℃离心9min，收集菌体，将菌体重悬于80ml浓度为230μm乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，29℃培养，所述生长基质为质量比3：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩的混合物(见图2)；

(4)筛选，pcr检测：

长高至5-7cm(见图3)后移栽至水田中生长(见图4)；当小苗在水田中长出4-7片新叶(见图5)，用浓度为170mg/l草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再pcr检测。

pcr检测的具体步骤是：

采用ctab法提取抗性植株的基因组dna，进行目的基因(bar)的pcr检测，目的基因检测的上下游引物序列分别为：

上游：atgccagttcccgtgcttga；(seqidno.1)

下游：accatcgtcaaccactacat；(seqidno.2)

pcr反应体系为：1μl基因组dna，2.5μl10×pcrbuffer，1μldntps(2.5μm)，1utaq酶，加灭菌水至总体积为25μl。pcr反应程序为：94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，33个循环；72℃8min。

得到bar基因(seqidno.3，629bp)的目标序列(seqidno.4，411bp，seqidno.3中横线表示序列)。

seqidno.3

cttgtcgatcgactctagctagaggatcgatccgaaccccagagtcccgctcatcaaatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggtaccggcaggctgaagtccagctgccagaaacccacgtcatgccagttcccgtgcttgaagccggccgcccgcagcatgccgcggggggcatatccgagcgcctcgtgcatgcgcacgctcgggtcgttgggcagcccgatgacagcgaccacgctcttgaagccctgtgcctccagggacttcagcaggtgggtgtagagcgtggagcccagtcccgtccgctggtggcggggggagacgtacacggtcgactcggccgtccagtcgtaggcgttgcgtgccttccaggggcccgcgtaggcgatgccggcgacctcgccgtccacctcggcgacgagccagggatagcgctcccgcagacggacgaggtcgtccgtccactcctgcggttcctgcggctcggtacggaagttgaccgtgcttgtctcgatgtagtggttgacgatggtgcagaccgccggcatgtccgcctcggtggcacggcggatgtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtcgatcgacagatctgcgaaag

图6一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法获得的转bar基因的小站稻(简称转基因植株)pcr检测电泳图:

泳道1为marker，泳道2-22为转基因植株，泳道23为非转基因对照，泳道24为质粒pcambia3301阳性对照，泳道25为水阴性对照。

鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻(12、14、17为转基因植株)。

表1小站稻转bar基因实验结果

结果：利用本发明的快速的水稻成熟胚原位转基因方法，对小站稻进行了农杆菌转化。三次生物学重复(共450颗种子)获得347再生植株，除草剂筛选出具有抗性植株134株。转基因阳性植株经pcr检测，证明5株为阳性植株，转化率为3.7％。

实施例2

一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括如下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡60小时，取出，再浸入体积浓度为5％次氯酸钠水溶液中，放置18分钟，用无菌水漂洗2次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于28℃培养48小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因bar的农杆菌储存液200μl，加入到2ml灭菌的lb液体培养基中，置于25℃摇床中，150r/min，进行活化培养28h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1ml活化的农杆菌菌液加入到25ml灭菌的lb液体培养基中进行扩大培养，至od600＝0.3的扩大培养的菌液，取25ml扩大培养的菌液置于灭菌的50ml离心管中，5000r/min，25℃离心10min，收集菌体，将菌体重悬于50ml浓度为250μm乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，28℃培养，所述生长基质为质量比3：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩的混合物；

(4)筛选，pcr检测：

长高至5-7cm后移栽至水田中生长；当小苗在水田中长出4-7片新叶，用浓度为150mg/l草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再pcr检测，检测方法同实施例1，鉴定得到2株成熟胚原位转基因阳性水稻。

实施例3

一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括如下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡72小时，取出，再浸入体积浓度为8％次氯酸钠水溶液中，放置15分钟，用无菌水漂洗4次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于30℃培养36小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因bar的农杆菌储存液300μl，加入到5ml灭菌的lb液体培养基中，置于28℃摇床中，200r/min，进行活化培养24h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1.5ml活化的农杆菌菌液加入到30ml灭菌的lb液体培养基中进行扩大培养，至od600＝0.4的扩大培养的菌液，取30ml扩大培养的菌液置于灭菌的50ml离心管中，8000r/min，28℃离心8min，收集菌体，将菌体重悬于100ml浓度为200μm乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，30℃培养，所述生长基质为质量比3：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩的混合物；

(4)筛选，pcr检测：

长高至5-7cm后移栽至水田中生长；当小苗在水田中长出4-7片新叶，用浓度为180mg/l草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再pcr检测，检测方法同实施例1，鉴定得到4株成熟胚原位转基因阳性水稻。

序列表

<110>天津大学

<120>一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgccagttcccgtgcttga20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accatcgtcaaccactacat20

<210>3

<211>629

<212>dna

<213>streptomyceshygroscopicus

<400>3

cttgtcgatcgactctagctagaggatcgatccgaaccccagagtcccgctcatcaaatc60

tcggtgacgggcaggaccggacggggcggtaccggcaggctgaagtccagctgccagaaa120

cccacgtcatgccagttcccgtgcttgaagccggccgcccgcagcatgccgcggggggca180

tatccgagcgcctcgtgcatgcgcacgctcgggtcgttgggcagcccgatgacagcgacc240

acgctcttgaagccctgtgcctccagggacttcagcaggtgggtgtagagcgtggagccc300

agtcccgtccgctggtggcggggggagacgtacacggtcgactcggccgtccagtcgtag360

gcgttgcgtgccttccaggggcccgcgtaggcgatgccggcgacctcgccgtccacctcg420

gcgacgagccagggatagcgctcccgcagacggacgaggtcgtccgtccactcctgcggt480

tcctgcggctcggtacggaagttgaccgtgcttgtctcgatgtagtggttgacgatggtg540

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<210>4

<211>411

<212>dna

<213>streptomyceshygroscopicus

<400>4

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ctcggtacggaagttgaccgtgcttgtctcgatgtagtggttgacgatggt411