一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法与流程

本发明属于植物分子生物学和农业技术领域，具体地涉及一种创制智能不育系的方法，更具体地涉基于毒性解毒基因在智能不育系中的应用。

背景技术：

杂种优势利用是现代农业生产中的一个重大技术突破与成果。杂交所产生的杂种优势是指两个有遗传基础差异的亲本的杂交后代在多种形状上优于两亲本的现象。发展和利用可以控制的授粉系统是杂种优势利用发展的关键。以不育系为基础的杂种优势利用技术已经在水稻、玉米、小麦等农作物中广泛的应用。雄性不育系以不育基因的遗传方式和在细胞中的定位可分为细胞核雄性不育系和细胞质雄性不育系以及核质互作不育系。而雌性不育表型多种多样，不育机理较为复杂，比较典型的植物雌性不育特征如子房干瘪、种子发芽率低和无花柱和柱+头等。科学家们发现并鉴定出了众多不育基因，如pair2、udt1、osgamyb、osfms2和ptb1等，这让直接在分子层面上利用不育基因成为了可能。

随着现代生物科学技术的不断发展，将遗传稳定的不育基因利用起来，保持和繁殖不育系，并最终生产不含转基因成分的不育系和杂交种成为了杂交水稻发展新的重要方向。与传统杂交育种和常规转基因育种相比，智能不育系技术有着如下优势：1.所利用不育基因是农作物普遍存在，可以将所有遗传背景的农作物都创制成智能不育系，资源利用率超过95％，这解决了常规育种传统的常规杂交育种存在着资源利用率低、育种周期长等瓶颈问题。2.被转入的基因被限制，不能传播到其它作物，杂交后代植株中也不含外源的转基因元件，不存在转基因生物安全问题。

近年来，智能不育系技术正刚刚起步并迅速发展，已有玉米多控不育技术、美国杜邦先锋的srt技术、水稻智能不育技术等。玉米多控不育技术以玉米隐形核不育系为基础，建立了不受光温敏影响的玉米隐形核不育材料的有效繁殖技术体系。玉米srt技术综合利用了转基因技术、花粉败育技术和荧光蛋白色选技术，恢复不育系的育性并能有效繁殖。而水稻智能不育技术借鉴了玉米srt技术，实现了用转基因手段生产非转基因的不育系种子和杂交稻种子。所以新的可用于智能不育系创制的育性恢复、花粉败育、筛选标记3种遗传工具的的发现和更新，成为了智能不育系研究的重要方向。

近年来水稻远缘杂种不育分子机理及应用有了较大的突破，发现了如qhms7位点的毒性基因orf2/解毒基因orf3等通过毒性-解毒机制导致作物育性改变的基因位点。这些基因通过控制雌雄配子的发育和功能影响植株育性。这类影响远缘杂交育性的关键基因在远缘杂交不育分子机理研究上有重大理论研究意义的同时，在智能不育系的应用中也有着广阔的空间和巨大的潜力。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用基因工程手段使解毒基因沉默；将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒和筛选标记基因表达盒3个连锁的表达盒构建载体，通过转基因技术转入作物隐性细胞核雄性或雌性不育系，获得智能雄性或雌性不育系，应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖和作物杂交种的机械化制种。

优选地，所述解毒基因包括但不限于qhms7位点的orf3基因，所述解毒基因序列如seqidno.1所示。所述育性恢复基因包括但不限于野生型雄性不育或雌性不育基因。所述筛选标记基因包括但不限于荧光标记基因、颖壳颜色基因等。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因沉默方法包括但不限于反义技术、rna干扰等。

优选地，所述应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖是用于作物隐性细胞核雄性或雌性不育系的繁殖。所述应用于作物杂交种的机械化制种是用于利用雌性不育的作物杂交种的机械化制种。所述作物为单子叶作物或双子叶作物，所述单子叶作物或双子叶作物包括但不限于水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒等。

下面对本发明作进一步说明：

本发明提供了一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法：

(1)将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒、筛选标记基因表达盒插入水稻表达载体；

(2)将步骤1所制备的构建体转入雄性不育/雌性不育材料，产生第一植株；

(3)第一植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性雄性/雌性不育植株，另一半为含有外源构建体的第一植株。

步骤1所述的外源构建体包含：

a)第一核苷酸序列，当其表达时，会抑制含有该核苷酸序列的雄性配子的形成或功能；

b)第二核苷酸序列，其包含突变后会导致植株花粉不育或雌性不育的核苷酸序列，当在不育植株中表达时其将恢复所述植株的正常花粉或雌性器官发育；

c)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。

在本发明中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第一核苷酸序列为解毒基因沉默，序列如seqidno.1所示，其中解毒基因包括但不限于qhms7位点的orf3基因。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物花粉中表达。

在本发明中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列为育性恢复基因，包括但不限于雄性或雌性不育基因的野生型。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在植物雄性或雌性器官中表达。

在本发明中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第三核苷酸序列为荧光蛋白基因、颖壳颜色等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为end2或ltp2等在愈伤组织/种子或胚乳中特异表达的启动子。

在本发明中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列至第六核苷酸序列已于发明专利公开(专利号：zl201410116096.8)。

本发明还提供了一种新的替代花粉败育基因的方法，所述方法包括对如qhms7等通过毒性解毒机制调控花粉功能的基因，通过突变的技术手段使得花粉败育。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用反义rna、rnai等基因沉默手段产生。在本发明中，所述解毒基因沉默包括但不限于qhms7位点的解毒基因orf3沉默。举例而言，目前已经发现某些水稻品种同时携带有毒的orf2和解毒的orf3，花粉因有orf3的保护而存活，缺乏orf3的保护，花粉将死亡，从而表现雄性不育。

本发明所述的第一核苷酸序列为利用上述方法使花粉败育的核苷酸序列，所述序列如seqidno.1所示。第一核苷酸序列可被构建成表达盒插入转化进细胞中的任何载体中。扩增上述核苷酸片段的全长或任意片段的引物对也是本发明保护的范围。含有第一核苷酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明的保护范围。优选的细胞是作物细胞，优选是水稻细胞。所述作物细胞中包含的本发明第一核苷酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，使得本发明第一核苷酸存在于植物细胞中的。

本发明还提供了一种繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法，所述方法包括：

(1)将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒、筛选标记基因表达盒插入水稻表达载体；

(2)将步骤1所制备的构建体转入雄性不育/雌性不育材料，产生第一植株；

(3)第一植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性雄性/雌性不育植株，另一半为含有外源构建体的第一植株。

步骤1所述的外源构建体包含：

a)第一核苷酸序列，当其表达时，会抑制含有该核苷酸序列的雄性配子的形成或功能；

b)第二核苷酸序列，其包含突变后会导致植株花粉不育或雌性不育的核苷酸序列，当在不育植株中表达时其将恢复所述植株的正常花粉或雌性器官发育；

c)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。

在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法中所提到的第一核苷酸序列为解毒基因沉默，序列如seqidno.2所示，其中解毒基因包括但不限于qhms7位点的orf3基因。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物花粉中表达。

在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列为育性恢复基因，包括但不限于雄性或雌性不育基因的野生型。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在植物雄性或雌性器官中表达。

在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法中所提到的第三核苷酸序列为荧光蛋白基因、颖壳颜色等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为end2或ltp2等在愈伤组织/种子或胚乳中特异表达的启动子。

在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列至第六核苷酸序列已于发明专利公开(专利号：zl201410116096.8)。

本发明还提供了一种构建体，其特征在于所述构建体包含：

a)第一核苷酸序列，当其表达时，会抑制含有该核苷酸序列的雄性配子的形成或功能；

b)第二核苷酸序列，其包含突变后会导致植株花粉不育/雌性不育的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的正常花粉/雌性器官发育；

c)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。

在本发明中，上述构建体中所提到的第一核苷酸序列为解毒基因沉默，序列如seqidno.2所示，其中解毒基因包括但不限于qhms7位点的orf3基因。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物花粉中表达。

在本发明中，上述构建体中所提到的第二核苷酸序列为育性恢复基因，包括但不限于雄性或雌性不育基因的野生型。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在植物雄性或雌性器官中表达。

在本发明中，上述构建体中所提到的第三核苷酸序列为荧光蛋白基因、颖壳颜色等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为end2或ltp2等在愈伤组织/种子或胚乳中特异表达的启动子。

在本发明中，上述构建体中所提到的第二核苷酸序列至第六核苷酸序列已于发明专利公开(专利号：zl201410116096.8)。

本发明还提供了一种利用智能不育系的机械化制种方法，所述方法包括将隐性核雌性不育植株与雄性不育植株混播，以制备杂交种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为为智能不育系的创制提供了新的遗传工具。

附图说明

图1外源构建体pof3(智能雄性不育)/pfs5(智能雌性不育)的载体图；

图2携带图1中外源构建体的荧光种子和不携带外源构建体的非荧光种子表现为1:1分离；

图3雄性不育系/雌性不育系的繁殖方法流程图。

具体实施方式

实施例1：

下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：设计rnai片段，利用rnai技术获得orf3基因沉默表达盒。

1.1rnai片段的获得

利用rnai在线分析工具sidirectversion2.0分析orf3基因的cdna序列，选取一段20-50bp的非保守编码序列作为靶序列(ccgtggaaaagggagtttcatat(seqidno.2))。根据靶位点序列，一条两端分别加上kpni和xhoi酶切位点，另一条两端加上psti和bamhi酶切位点，合成该rnai片段。将所选取的靶序列以正向和反向分别连接在中间载体pb-3dlinker的3dlinker片段的两端。再用限制性内切酶kpni和psti酶切pb3d-rnai载体获得orf3基因rnai干扰载体片段。

将获得的orf3基因rnai干扰片段与花粉特异性表达启动子pg47相连接，获得orf3基因干扰表达盒。

1.2构建中间载体

(1)pcr体系：模板：1μl，buffer：5μl，dntp:4μl,h20:40μl，正向引物:5μl，反向引物:5μl。pcr程序：95℃10min，55℃10min，14℃5min。

(2)酶切连接：酶切反应底物：1μl，酶1:1μl，酶2:1μl，buffer：1μl，加ddh2o至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱30min。

(3)连接体系：插入片段：3μl，载体片段：1μl，t4-ligase：0.5μl，t4-buffer：1μl，加ddh2o至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱约2h左右。

(4)重组质粒转化

(5)菌检及质粒抽提验证

根据本实验室经验，构建的中间载体不需要经过菌检，可以直接挑斑摇菌，准确率达99％，然后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，把抽提的质粒各送2个单克隆，测序。

实施例2：解毒基因orf3沉默在智能不育系创制中的应用。

2.1智能不育表达载体的构建

在表达载体pcambia1300上，插入3个表达盒；orf3沉默表达盒、育性恢复基因表达盒、荧光筛选标记基因表达盒。orf3沉默表达盒元件包括：花粉特异性启动子pg47、orf3rnai片段；野生型育性基因表达盒携带有自身的启动子和终止子；红色荧光蛋白基因表达盒元件包括：玉米的种子特异性启动子end2、载体plj02上的rp编码序列、马铃薯的终止子pinⅱ(附图1)。所述载体分别命名为智能雄性不育载体pof3和智能雌性不育载体pfs5。所构建载体利用电激法导入农杆菌菌株eha105用于水稻遗传转化。

2.2转基因水稻的获得

智能雄性不育构建体pof3转入雄性不育植株，智能雌性不育构建体pfs5转入雌性不育植株。愈伤组织与农杆菌共培养2天后，从中挑选颜色鲜黄的转入选择培养基上培养一周，用体式荧光显微镜筛选带有红色荧光的转化愈伤组织，观察转化效率，筛选第15天对发荧光的愈伤组织进行第一次分切，将发荧光的细胞团切成0.1-0.2mm大小，转移至新的筛选培养基，筛选第30天，第二次分切，尽量分成独立转化的细胞团。筛选第45天，第三次分切。分切三次后的愈伤在筛选培养基上长至>0.2mm时，转移到分化培养基，分化苗长到4cm左右时转到生根培养基诱导生根，待小植株长至7-10cm左右时进行室内炼苗，3～4d后将其移栽到土壤中生长。

2.3转基因植株的分子检测

(1)使用植物总rna提取试剂盒(天根dp432)对t0代转基因水稻和野生型对照进行rna抽提，方法参考试剂盒说明书。

(2)t0代转基因水稻orf3基因的表达检测

以总rna为模板逆转录合成相应的cdna。以actin为内参基因，野生型植株为对照，用rt-pcr的方法对orf3进行半定量pcr检测。

actinf：gaagatcactgccttgctcc(seqidno.3)

actinr：cgataacagctcctcttggc(seqidno.4)

orf3-f：tcgagtaaaaggcgacgagt(seqidno.5)

orf3-r：gaaaacctcattgcctccaa(seqidno.6)

使用fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂(天根kr118),方法参考试剂盒说明书。

(3)southern印迹分析

取水稻总dna进行ecorⅰ酶切、电泳、转移至硝酸纤维素膜hybond-n。利用随机引物标记试剂盒(promega公司)和[α-32p]datp(北京亚辉公司)，随机引物法制备α-32p标记的rfp基因片段，作为分子探针，按照sambrook等分子克隆方法进行转化植株的southern杂交分析。

2.4转基因水稻植株的育性考察

(1)对经过分子鉴定的转基因植株考察花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的i2-ki染色后，观察其花粉粒情况。

(2)转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离分析

对上述实施例所得到的单拷贝转基因水稻植株所结t1代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(附图2)，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件整体表现良好，达到预期的目的。携带外源基因的荧光种子继续用于雄性/雌性不育系的繁殖(附图3)。

实施例3：隐性细胞核不育系的繁殖及杂交制种技术

该技术的核心思想是：以核隐性雄性/雌性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中。其中，解毒基因沉默可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；育性恢复基因可使转化受体的育性恢复；标记基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣。分拣出的非转基因种子即为雄性/雌性不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系自交结实，由此繁殖雄性/雌性不育系。在杂交制种过程中，雌性不育系授粉雄性不育系产生杂交种子，而雌性不育系自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以将雌性与雄性不育系混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。所述雄性/雌性不育系的繁殖方法如图3所示。

sequencelisting

<110>湖南杂交水稻研究中心

<120>一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>6546

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

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