一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途。
背景技术：
草鱼出血病(grasscarphemorrhage)是一种由草鱼呼肠孤病毒(grasscarpreovirus，gcrv)引起的危害草鱼养殖的病毒性传染病，主要引起患病草鱼鱼种各器官、组织不同程度的充血、出血症状，并因此得名。1970年首次发现，此后相继在我国湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等省、市、自治区各养殖区流行，还可感染青鱼、鲫鱼、麦穗鱼等多种鱼种。由于草鱼出血病危害鱼类种类多，流行范围广，发病季节长(每年6月下旬到9月底为主要流行季节)，死亡率高达85％，对水产养殖带来巨大危害和经济损失。gcrv隶属水生呼肠孤病毒属(aquareoviridae，aqrv)，是中国分离的第一种鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。gcrv病毒属于aqrv的c群，为二十面体对称的球形体，成熟病毒直径为70-80nm，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条dsrna组成。主要通过呼吸道感染宿主，具有高度传染性和致死性。gcrv主要危害10cm左右的草鱼鱼种(4-5月龄)，通过鱼鳃进入鱼体，前3天为潜伏期，第四天后开始发病，侵染草鱼肝脏、肾脏、肠道、肌肉等组织，5-7天后出现明显充血、出血症状。目前，免疫接种仍是防治该病毒性疾病最有效的途径，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、dna疫苗等。蛋白酶抑制剂、rna干扰技术、免疫增强剂也取得一定的进展和应用。譬如，中国水产科学研究院珠江水产研究所通过多代培养、减毒研制的弱毒活疫苗已实现商品化并得到广泛应用，使草鱼出血病在一定程度上得到了控制。近年来，基因工程制备亚单位疫苗和核酸疫苗为综合防治草鱼出血病提供了新方法。亚单位疫苗具有滴度高、抗体出现早、持续时间长等优点，具有胸腺依赖性免疫原的性质。核酸疫苗也称基因疫苗，以其抗原性强、改造方便、保护时间长、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。贡成良等也构建了带有草鱼出血病病毒结构蛋白vp6基因的重组杆状病毒bmnpv-iivp6并接种至五龄家蚕幼虫或蛹，再将五龄家蚕幼虫或蛹冷冻干燥制备的冻干粉与鱼饲料均匀混合获得口服疫苗。枯草芽孢作为口服型疫苗载体，具有很多常规疫苗载体不可比拟的优点：它属于革兰阳性菌，不产生毒素，生物安全性高，稳定性极好，是常用的益生菌之一，已用作为人的功能性食品、动物饲料添加剂等。此外，枯草芽孢有独特的免疫学特性，口服的芽孢在动物肠道能被肠道相关淋巴组织识别，发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的淋巴组织，增加分泌型(siga)抗体分泌，提高免疫识别能力，并诱导t、b淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，通过淋巴细胞再循环活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫系统。枯草芽孢杆菌有完善的分泌系统，能将外源重组蛋白直接分泌至培养液中，大大减少了表达产物的分离纯化步骤，已应用于许多重组蛋白的表达。枯草芽孢杆菌芽孢生产成本低，生长快速，对营养要求低，适于现代工业发酵生产。生产的重组芽孢疫苗，稳定性高，方便储存、运输，并可以作为食品添加剂使用。因此枯草芽孢杆菌已作为益生菌得到广泛应用畜牧业和渔产业，特别是作为添加剂，不仅克服了抗生素对消化道内其它微生物菌群的不良影响，而且避免了抗生素长期使用的毒副作用、抗药性和耐药性，并能促进禽畜及鱼类的生长，增强动物防病抗病能力，提高饲料的消化、吸收利用率和转化率，提高养殖业产量。由于枯草芽孢作为疫苗载体所具有独特优势，被认为是最有前景的口服疫苗载体并开始应用于病原微生物疫苗的研制。现有灭活疫苗、弱毒活疫苗使草鱼出血病在一定程度上得到了控制，但在野外应用中其逐一注射方式仍有一定局限性，对鱼体也会造成损伤。同时灭活疫苗、弱毒活疫苗也存在毒力返祖的安全性隐患。与之相比，口服疫苗具有实施方便，不受时间、地点和鱼体大小的限制，对鱼无损伤等优点。虽然枯草芽孢杆菌具有良好的微生物疫苗研究价值，但是基因工程操作过程中低转化率和遗传不稳定性限制了其在工业发酵生产中的广泛应用。大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒的构建和应用技术可以提高枯草芽孢杆菌转化成功率，简化基因工程操作步骤，有利于枯草芽孢杆菌作为疫苗载体的应用推广。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与用途。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc和草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白，所述草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白的氨基酸序列对应于如seqidno.8所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。优选地，所述草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白的氨基酸序列如seqidno.11所示，具体为：mgnvqtnnttvningdgnsfgaesgmqstaapeimlspgklnpnglawmkvagsgtgpgspqivhatdgspycyippdamssmeksagavnlweplfaaifetcstvnvsdftdefsayvgvsepealkkyiekgvfmstsqaknffgtlgqrmarikgwsedirtaaamipvdtphgsvtcdwksllrfwdenlpvdnvckqyqnavyevalkiypalragnsgsllsdvvgvlaggaagttasgvsmvegvtrneqvsriltsadvdiltssapvpvsalrtppvelsyqpsalsakttpwlvrypgttaiektfdvgttskttyylsmgnsgggdlmidlkrlpacgleyslrgipiiydtnltaaklakvtpallmlqtakplsaeitaadiqaitplvvgtdklntlvttgfgnirnitdfsmsaiwepetvsaagnyylwptvigdasmtsdwgtistslangrlrvapldlthalhkgnvvesivpsdvlgnaspeemrsalpadvltafkaklttvasvvgralnpndsahapssgtvlgplaienkaqskpkpvsdlwiaarrgvnlfvaspsaslqtgvpvmgdssvltsltggattalntgdmgtpsleatakraarvaggllrqrvmdkltrywppps。进一步优选地，所述草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白的编码核苷酸序列如seqidno.8所示，具体为：atgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttag。优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc的氨基酸序列对应于如seqidno.7所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。更优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc的氨基酸序列如seqidno.12所示，具体为：mgyykkykeeyytvkktyykkyyeydkkdydcdydkkyddydkkyydhdkkdydyvveykkhkkhy。进一步优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc的编码核苷酸序列如seqidno.7所示，具体为：atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactac。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列中含有如seqidno.9示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。进一步优选地，所述融合蛋白的编码核苷酸序列中含有如seqidno.9所示的核苷酸序列。如seqidno.9所示的核苷酸序列具体为：atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttaggagctc。优选地，如seqidno.9示核苷酸序列所编码的氨基酸序列为：mknrlfilicfcviclflsfgqpffpsmiltvqaakstrriikrsknkggvymgyykkykeeyytvkktyykkyyeydkkdydcdydkkyddydkkyydhdkkdydyvveykkhkkhyklmgnvqtnnttvningdgnsfgaesgmqstaapeimlspgklnpnglawmkvagsgtgpgspqivhatdgspycyippdamssmeksagavnlweplfaaifetcstvnvsdftdefsayvgvsepealkkyiekgvfmstsqaknffgtlgqrmarikgwsedirtaaamipvdtphgsvtcdwksllrfwdenlpvdnvckqyqnavyevalkiypalragnsgsllsdvvgvlaggaagttasgvsmvegvtrneqvsriltsadvdiltssapvpvsalrtppvelsyqpsalsakttpwlvrypgttaiektfdvgttskttyylsmgnsgggdlmidlkrlpacgleyslrgipiiydtnltaaklakvtpallmlqtakplsaeitaadiqaitplvvgtdklntlvttgfgnirnitdfsmsaiwepetvsaagnyylwptvigdasmtsdwgtistslangrlrvapldlthalhkgnvvesivpsdvlgnaspeemrsalpadvltafkaklttvasvvgralnpndsahapssgtvlgplaienkaqskpkpvsdlwiaarrgvnlfvaspsaslqtgvpvmgdssvltsltggattalntgdmgtpsleatakraarvaggllrqrvmdkltrywppps(seqidno.13)。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列中含有如seqidno.10所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。进一步优选地，所述融合蛋白的编码核苷酸序列中含有如seqidno.10所示的核苷酸序列。如seqidno.10所示的核苷酸序列具体为：tgagttgtttttataatcttgtatatttagatattaaacgatatttaaatatacatcaagatatatatttgggtgagcgattccttaaacgaaattgagattaaggagtcgattttttatgtataaaaacaatcatgcaaatcattcaaatcatttggaaaatcacgatttagacaatttttctaaaaccggctactctaatagccggttaagtggtaatttttttaccacccctcaaccagaattaagttttgatgctatgacaatcgttgggaatttgaacaaaactaacgctaaaaagctatctgattttatgagtacagagccacaaataaggctttgggatatattacaaacaaagtttaaagctaaagcacttcaagaaaaggtttatatcgaatatgacaaagtaaaagcagatagttgggatagacgtaatatgcgtgttgaatttaatccaaataaactcacacatgaagaaatgctttggttaaaacaaaatattatcgactacatggaagatgacggttttacgaggttagatttagcttttgattttgaagatgatttgagtgattactacgcaatgactgataaagcagttaagaaaactattttttatggtcgtaatggtaagccagaaacaaaatattttggtgttcgtgacagtgatagatttattagaatttataataaaaaacaagaacgtaaagataacgccgatgttgaagttatgtctgaacatttatggcgtgtagaaattgaattgaaaagagatatggttgattactggaatgattgctttgatgatttacacattttgaaacccgattggacaacaccagaaaaagtaaaagaacaagcaatggtttatttgttactgaatgaagaaggcacgtggggaaaacttgaaagacatgctaaatataaatacaagcaattgattaaagaaatatctccaattgatttaacggaattaatgaaatcgactttaaaagagaatgaaaagcaattgcaaaaacagattgatttttggcaacgtgaatttagattttggaagtaaaataagttttattttataaaaattgctgattcagtataattaatatttacggggtgacataacgtatgaaaaaatcagaggattattcctcctaaatataaagatttaaaatttaggaggaaattatatatgacttttaatattatcaaattagaaaattgggatagaaaagaatattttgaacactattttaaccagcaaactacgtatagcattactaaagaaattgatattactttgtttaaagatatgataaaaaagaaaggatatgaaatttatccttctttgatttatgcaattatggaagttgtaaataaaaataaagtgtttagaacaggaattaatagtgagaataaattaggttattgggataagttaaatcctttgtatacagtttttaataagcaaac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ataacaagtaagtatgtacttggtgttttagtagttttaactgtttaccagataatacaaatgcttaaataaaaaaagacttgatctgattagaccaagtcttttgatagtgttatattaataacaaaataaaaaggagtcgctcacgccttgaccaaagtttgtgaacgacatcattcaaagaaaaaaacac。优选地，如seqidno.10示核苷酸序列所编码的氨基酸序列为：mknrlfilicfcviclflsfgqpffpsmiltvqaakstrriikrsknkggvymgyykkykeeyytvkktyykkyyeydkkdydcdydkkyddydkkyydhdkkdydyvveykkhkkhyklmgnvqtnnttvningdgnsfgaesgmqstaapeimlspgklnpnglawmkvagsgtgpgspqivhatdgspycyippdamssmeksagavnlweplfaaifetcstvnvsdftdefsayvgvsepealkkyiekgvfmstsqaknffgtlgqrmarikgwsedirtaaamipvdtphgsvtcdwksllrfwdenlpvdnvckqyqnavyevalkiypalragnsgsllsdvvgvlaggaagttasgvsmvegvtrneqvsriltsadvdiltssapvpvsalrtppvelsyqpsalsakttpwlvrypgttaiektfdvgttskttyylsmgnsgggdlmidlkrlpacgleyslrgipiiydtnltaaklakvtpallmlqtakplsaeitaadiqaitplvvgtdklntlvttgfgnirnitdfsmsaiwepetvsaagnyylwptvigdasmtsdwgtistslangrlrvapldlthalhkgnvvesivpsdvlgnaspeemrsalpadvltafkaklttvasvvgralnpndsahapssgtvlgplaienkaqskpkpvsdlwiaarrgvnlfvaspsaslqtgvpvmgdssvltsltggattalntgdmgtpsleatakraarvaggllrqrvmdkltrywppps(seqidno.14)。本发明的第二方面，提供了一种制备前述融合蛋白的方法，包括如下步骤：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得目的基因以及载体质粒进行连接，获得重组质粒；(3)将步骤(2)所得重组质粒导入感受态细胞，转化；(4)筛选阳性克隆，并将正确的重组质粒转化宿主感受态细胞；(5)诱导表达融合蛋白。优选地，步骤(1)中，所述目的基因的核苷酸序列含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc的编码核苷酸序列和草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白的编码核苷酸序列。优选地，步骤(1)中，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc的编码核苷酸序列如seqidno.7所示。所述草鱼呼肠孤病毒vp4蛋白的编码核苷酸序列如seqidno.8所示。进一步优选地，步骤(1)中，所述目的基因的核苷酸序列如seqidno.9所示，具体为：atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttaggagctc。优选地，步骤(2)中，所述载体质粒为peb03质粒。所述peb03质粒为现有技术中已有质粒。例如可参考文献“productionofn-acetyl-d-neuraminicacidbyuseisofanefficientsporesurfacedisplaysystem”。优选地，步骤(3)中，所述感受态细胞为dh-5α感受态细胞。优选地，步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为枯草芽孢杆菌wb600感受态细胞。优选地，步骤(5)中，所述诱导采用dsm芽孢培养基诱导。本发明的第三方面，提供了前述融合蛋白在制备草鱼出血病口服疫苗中的用途。本发明的第四方面，提供了一种草鱼出血病口服疫苗，含有前述融合蛋白。优选地，所述草鱼出血病口服疫苗还含有疫苗载体，所述疫苗载体选用枯草芽孢杆菌芽孢。进一步优选地，所述草鱼出血病口服疫苗还含有鱼肝油和饲料。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤。且较已有疫苗对鱼体抵抗草鱼出血病具有更好免疫保护效果。附图说明图1：载体酶切产物回收纯化后跑胶鉴定，其中，泳道1：peb03-cotc-pmy；泳道2和3：经hindiii、saci酶切后的peb03-cotc载体；泳道4：dnamarker。图2：目的片段的回收纯化后跑胶鉴定，其中，泳道1：dnamarker；泳道2和3：s6目的片段。图3：pcr扩增鉴定peb03-cotc-s6重组质粒。图4：sds-page检测融合蛋白peb03-cotc-vp4表达情况。图5：westernblotting检测融合蛋白peb03-cotc-vp4表达情况。图6：免疫荧光检测融合蛋白peb03-cotc-vp4表达情况。图7：流式细胞术检测融合蛋白peb03-cotc-vp4表达情况。图8：口服疫苗投喂策略。图9：elisa测定草鱼血清和肠粘液中特异性抗体水平。图10a：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中il-4/13a的mrna水平表达情况。图10b：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中il-4/13b的mrna水平表达情况。图10c：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中csf1r的mrna水平表达情况。图10d：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中baff的mrna水平表达情况。图10e：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中cd4l的mrna水平表达情况。图10f：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中mhc-ii的mrna水平表达情况。图10g：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中cd8的mrna水平表达情况。图10h：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中foxp3的mrna水平表达情况。图10i：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中il-1β的mrna水平表达情况。图10j：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中tnf-α的mrna水平表达情况。图10k：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中tgf-β的mrna水平表达情况。图10l：qrt-pcr检测免疫6周后脾、头肾、肾和后肠组织中ifn-i的mrna水平表达情况。图11：qrt-pcr检测免疫6周后脾和肾组织中rig-i、mda5、lgp2、tlr3、tlr7、tlr8、tlr9、tlr21、tlr22、ips-1、irf3、irf7、nf-κb、mx1、mx2和mx3的mrna水平表达情况。图12：gcrv攻毒后生存率。图13：gcrv攻毒后脾、肾、肠、肝和肌肉组织中病毒载量的检测。具体实施方式在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。本发明所涉及术语解释统计分析spss16.0软件用于本研究中数据的统计学分析。实验结果均以均值±标准差表示，实验组与对照组比较采用t-test分析，p值小于0.05表明两组数据具有显著性差异。实施例1草鱼出血病口服疫苗的制备一、枯草芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭表达系统的构建含s6目的片段的重组质粒pvax1-s6由中国水产科学院珠江水产研究所前期构建保存并提供，经测序鉴定无误后进行下一步实验；含cotc目的片段的重组质粒peb03-cotc-pmy由本实验室前期构建保存并提供。采用同源重组的方法获得重组穿梭质粒peb03-cotc-s6，首先用hindiii、saci酶将pmy片段从重组质粒peb03-cotc-pmy(含hindiii、saci酶切位点)上切下，再将s6目的片段连接至线性化载体peb03-cotc上获得重组穿梭质粒peb03-cotc-s6。同时将重组质粒peb03-cotc作为阴性对照。化学转化法分别将穿梭表达质粒peb03-cotc-s6和peb03-cotc转入枯草芽孢杆菌wb600中诱导表达。具体的：1.1重组穿梭质粒peb03-cotc-s6的构建1)设计相关引物序列s6-f1:aaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaac(seqidno.1)；s6-r1:aaatgagtggcaaagtgctagagctcctaagacggaggaggccagt(seqidno.2)；s6-f2:cctaccagtggataatgtatgcaaac；(seqidno.3)；s6-r2:ggtatatcttcagtgctacctcatatacagcattttg(seqidno.4)；peb03-t5-f:atgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaag(seqidno.5)；peb03-t5-r:tgctaacgcaaaaaatgagtggcaaagtgc(seqidno.6)；2)线性化载体的获得反应体系如下：表1peb03-cotc-pmy～1ughindiii1usaci1u10×buffer3ulddh2o14ultotal30ul吹打混匀后，将反应体系置于37℃水浴锅孵育3h左右。然后按凝胶回收试剂盒说明书操作对以上的酶切产物进行回收纯化。结果如图1所示，经hindiii、saci酶切后的peb03-cotc载体是正确的。3)目的基因片段的获得首先pcr进行目的基因扩增，s6-i扩增体系如下表2所示：表2template：s6(质粒)1uls6-f1(10p)1uls6-r1(10p)1ul2xpcrmastermix6ulh2o11ultotal20uls6-ii扩增体系如下表3所示：表3扩增程序如下表4所示：表4然后对pcr产物进行跑胶回收纯化，结果如图2所示，s6目的基因片段大小与理论值(1953bp)相符。4)进行同源重组反应反应体系如下表5所示：表5peb03-cotc6uls63ulseamlesscloningkit1ultotal10ul体系配制完成后，吹打混匀，置于50℃处理30min，待反应完成后，置于冰水浴中冷却5min，直接转化或-20℃冻存。5)反应产物转化、涂板5.1)取20ul反应液加入200uldh-5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min；5.2)加入900ullb培养基，37℃10min充分复苏，37℃摇菌45min；5.3)4℃4000rpm5min离心，重悬沉淀，取100ul菌液均匀涂布在含有壮观霉素的平板上，37℃倒置培养37℃过夜；6)克隆鉴定挑取8个单菌落于50ullb培养基中混匀，直接取1ul作为pcr模板。将pcr阳性菌落的剩余菌液接种至含有壮观霉素的lb培养基中培养过夜，提取质粒进行测序鉴定。根据测序结果可知，重组质粒的插入片段及酶切位点完全正确，s6目的片段与cotc目的片段成功连接。cotc目的片段的核苷酸序列如seqidno.7所示，具体为：atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactac。s6目的片段的核苷酸序列如seqidno.8所示，具体为：atgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttag。cotc-s6目的基因的核苷酸序列如seqidno.9所示，具体为：atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttaggagctc。1.2制备枯草芽孢杆菌感受态，并将重组穿梭质粒peb03-cotc-s6化学转化至枯草芽孢杆菌wb600具体步骤如下：1)挑取新鲜培养的枯草杆菌(wb600)单菌落接种于5mlgmi培养基，30℃180r/min摇床培养过夜；2)按10％接种量接种新鲜的5mlgmi培养基，37℃250r/min振荡培养3.5h；3)再按10％接种量接种5mlgmii培养基，37℃250r/min振荡培养90min；4)取1ml培养物，5000r/min离心5min。用1/10体积上清液重悬细菌，即为枯草杆菌感受态细胞；5)将适量连接产物加入感受态细胞中，混匀，37℃水浴静置30min，37℃摇床振荡培养2h；6)用含壮观酶素(10μg/ml)的lb培养固体培养基涂板，37℃倒置培养过夜；7)挑取新鲜培养的枯草杆菌(wb600)单菌落接种于5mlgmi培养基，30℃180r/min摇床培养过夜；8)按10％接种量接种新鲜的5mlgmi培养基，37℃250r/min振荡培养3.5h；9)再按10％接种量接种5mlgmii培养基，37℃250r/min振荡培养90min；10)取1ml培养物，5000r/min离心5min。用1/10体积上清液重悬细菌，即为枯草杆菌感受态细胞；11)将适量连接产物加入感受态细胞中，混匀，37℃水浴静置30min，37℃摇床振荡培养2h；12)用含壮观酶素(10μg/ml)的lb培养固体培养基涂板，37℃倒置培养过夜；13)菌液pcr及测序鉴定阳性克隆。菌液pcr鉴定如图3所示，充分说明了含有目的片段s6的重组质粒成功导入枯草芽孢杆菌wb600中。测序鉴定，充分说明了重组质粒的插入片段s6目的片段及酶切位点完全正确，且和cotc目的片段连接成功。编码融合蛋白的核苷酸序列含有如seqidno.10所示的核苷酸序列。如seqidno.10所示的核苷酸序列具体为：tgagttgtttttataatcttgtatatttagatattaaacgatatttaaatatacatcaagatatatatttgggtgagcgattccttaaacgaaattgagattaaggagtcgattttttatgtataaaaacaatcatgcaaatcattcaaatcatttggaaaatcacgatttagacaatttttctaaaaccggctactctaatagccggttaagtggtaatttttttaccacccctcaaccagaattaagttttgatgctatgacaatcgttgggaatttgaacaaaactaacgctaaaaagctatctgattttatgagtacagagccacaaataaggctttgggatatattacaaacaaagtttaaagctaaagcacttcaagaaaaggtttatatcgaatatgacaaagtaaaagcagatagttgggatagacgtaatatgcgtgttgaatttaatccaaataaactcacacatgaagaaatgctttggttaaaacaaaatattatcgactacatggaagatgacggttttacgaggttagatttagcttttgattttgaagatgatttgagtgattactacgcaatgactgataaagcagttaagaaaactattttttatggtcgtaatggtaagccagaaacaaaatattttggtgttcgtgacagtgatagatttattagaatttataataaaaaacaagaacgtaaagataacgccgatgttgaagttatgtctgaacatttatggcgtgtagaaattgaattgaaaagagatatggttgattactggaatgattgctttgatgatttacacattttgaaacccgattggacaacaccagaaaaagtaaaagaacaagcaatggtttatttgttactgaatgaagaaggcacgtggggaaaacttgaaagacatgctaaatataaatacaagcaattgattaaagaaatatctccaattgatttaacggaattaatgaaatcgactttaaaagagaatgaaaagcaattgcaaaaacagattgatttttggcaacgtgaatttagattttggaagtaaaataagttttattttataaaaattgctgattcagtataattaatatttacggggtgacataacgtatgaaaaaatcagaggattattcctcctaaatataaagatttaaaatttaggaggaaattatatatgacttttaatattatcaaattagaaaattgggatagaaaagaatattttgaacactattttaaccagcaaactacgtatagcattactaaagaaattgatattactttgtttaaagatatgataaaaaagaaaggatatgaaatttatccttctttgatttatgcaattatggaagttgtaaataaaaataaagtgtttagaacaggaattaatagtgagaataaattaggttattgggataagttaaatcctttgtatacagtttttaataagcaaactgaaaaatttactaacatttggactgaatctgataacaacttcacttctttttataataattataaaaatgacttgcttgaatataaagataaagaagaaatgtttcctaaaaaaccgatacctgaaaacaccataccgatttcaatgattccttggattgattttagttcatttaatttaaacattggtaacaatagcaactttttattgcctattattacgataggtaaattttatagtgagaataataaaatttatataccagttgctttgcagcttcatcatgctgtatgtgatggttaccatgcttcattatttatgaatgaatttcaagatataattcataaggtagatgattggatttagtttttagattttggaagtgaatttaattttatacacgcaagtgatcataaaatttatgaacgtatagcaaccacatttttggttgcataggttttgattttgaattaggtcttgaactatgagtggctagagcttgcatgcggatctcgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgggcccgaatggcgattttcgttcgtgaatacatgttataataactataactaataacgtaacgtgactggcaagagatatttttaaaacaatgaataggtttacacttactttagttttatggaaatgaaagatcatatcatatataatctagaataaaattaactaaaataattattatctagataaaaaatttagaagccaatgaaatctataaataaactaaattaagtttatttaattaacaactatggatataaaataggtactaatcaaaatagtgaggaggatatatttgaatacatacgaacaaattaataaagtgaaaaaaatacttcggaaacatttaaaaaataaccttattggtacttacatgtttggatcaggagttgagagtggactaaaaccaaatagtgatcttgactttttagtcgtcgtatctgaaccattgacagatcaaagtaaagaaatacttatacaaaaaattagacctatttcaaaaaaaataggagataaaagcaacttacgatatattgaattaacaattattattcagcaagaaatggtaccgtggaatcatcctcccaaacaagaatttatttatggagaatggttacaagagctttatgaacaaggatacattcctcagaaggaattaaattcagatttaaccataatgctttaccaagcaaaacgaaaaaataaaagaatatacggaaattatgacttagaggaattactacctgatattccattttctgatgtgagaagagccattatggattcgtcagaggaattaatagataattatcaggatgatgaaaccaactctatattaactttatgccgtatgattttaactatggacacgggtaaaatcataccaaaagatattgcgggaaatgcagtggctgaatcttctccattagaacatagggagagaattttgttagcagttcgtagttatcttggagagaatattgaatggactaatgaaaatgtaaatttaactataaactatttaaataacagattaaaaaaattataaaaaaattgaaaaaatggtggaaacacttttttcaatttttttgttttattatttaatatttgggaaatattcattctaattggctcgaggtcgactgtaggataaatcgtttgggccgatgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttcggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaacttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttcaccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatgtctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctatattcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgttggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaacatcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttggtctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggtaacgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgtatgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgggccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggcaggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtctcgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctcagctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaaccaccccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcgggacgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatgattgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatcatatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatgctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcacacctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatattcgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggcaggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattgggggacaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcatgcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcctcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaagctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgcaccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacctaaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctctccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagcttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggaggccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggacaaactaactcgatactggcctcctccgtcttaggagctctagcactttgccactcattttttgcgttagcaaaaacataaagggtatgggatataatcccatcaagccggtatattcagaacaggaacagcaacaagaacaacaaaagaatcaaaaacgagatagaggtatgcacttatagaacatgcatttatgccgagaaaacttattggttggaatgggctatgtgttagctaacttgttagcgagttggttggacttgaattgggattaatcccaagaaagtaccaactcaacaacacataaagccctgtaggttccgaccaataaggaaattggaataaagcaataaaaggagttgaagaaatgaaattcagagaagcctttgagaattttataacaagtaagtatgtacttggtgttttagtagttttaactgtttaccagataatacaaatgcttaaataaaaaaagacttgatctgattagaccaagtcttttgatagtgttatattaataacaaaataaaaaggagtcgctcacgccttgaccaaagtttgtgaacgacatcattcaaagaaaaaaacac。二、枯草芽孢杆菌融合表达gcrvvp4(s6基因编码的蛋白)的检测2.1sds-page检测重组菌于dsm芽孢培养基中培养0h、6h、12h、24h(如图4中，3-6泳道)取样处理，并分离培养24h的芽孢上清液和衣壳蛋白(如图4中，7、8泳道)行sds-page。观察融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况及其在芽孢中的定位。结果充分说明：融合蛋白cotc-vp4经诱导后可成功表达于重组芽孢衣壳上，其表达量随着诱导时间的增长而增多。2.2westernblotting检测将诱导24h后超声破壁分离的芽孢衣壳蛋白和上清蛋白(如图5中，3、4泳道)在行sds-page后继续行westernblotting，检测融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况及其在芽孢衣壳的定位。结果进一步充分说明：融合蛋白cotc-vp4经诱导后可成功表达于重组芽孢衣壳上。2.3免疫荧光检测取诱导24h的芽孢液固定处理后，依次与兔抗vp4血清(对照组孵育正常兔血清)、山羊抗兔cy3标记的igg反应，荧光显微镜下观察融合蛋白在芽孢衣壳表达情况。如图6所示，充分说明：经诱导后融合蛋白cotc-vp4能够大量均匀地表达在枯草杆菌芽孢外衣壳上。2.4流式细胞术检测1)取105个洗涤后的芽孢13000r/min离心2min，弃去上清；2)悬浮于30mmnapo4buffer(ph7.4，含2.4％多聚甲醛、0.04％戊二醛)，室温放置10min，冰上50min；3)pbs(ph7.4)洗3遍，200μlgtebuffer悬浮，37℃放置30min；4)pbs洗涤3遍后，与1％bsa-pbs稀释的兔抗vp4血清(1:200)孵育(对照组孵育正常兔血清)，37℃1h；5)pbs洗涤4次，再加入1:200稀释的山羊抗兔igg-fitc，室温1h；6)用pbs洗涤后，再用pbs重悬于流式软管内，流式细胞仪进行计数。与1％bsa-pbs稀释的兔抗vp4血清(1:200)孵育，结果如图7中a所示，对照组孵育正常兔血清，结果如图7中b所示，以上结果充分说明：经诱导后的重组枯草杆菌芽孢上融合蛋白cotc-vp4表达率。三、枯草芽孢杆菌的扩大培养和芽孢的获得1)按照1:100接菌于40mllb培养基中(壮观霉素抗性)，37℃摇床培养过夜；于次日转入4ldsm芽孢培养基中(不含抗生素)，37℃摇床培养24h；2)12,000g离心10min，弃上清留取沉淀，加入溶菌酶至终浓度4mg/ml反复吹悬沉淀，室温静置30min；3)用1mnacl洗涤芽孢，同时加加入pmsf至终溶度1mm，充分混匀；4)12,000g离心10min，弃上清留取沉淀，再用1mkcl洗涤芽孢同时加加入pmsf至终溶度1mm，充分混匀；5)去离子水洗涤芽孢三次，12,000g离心10min，弃上清留取沉淀；6)40ml去离子水吹悬芽孢沉淀，65℃水浴静置1h以杀灭残留的枯草芽孢杆菌繁殖体；7)取3μl芽孢用去离子稀释，显微镜下计数，将芽孢于-40℃保存备用。四、枯草杆菌芽孢疫苗的制备和鱼体免疫获得的芽孢用鱼肝油包被后与饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，芽孢量约1012cfu/g饲料。口服疫苗投喂策略如图8所示。具体的，草鱼250尾，分别为口服疫苗组(vp4组、也就是口服本发明的融合蛋白祖)、阴性对照组(cotc组、也就是重组质粒pebo3-cotc组)、空白对照组(naive组)和阳性对照组(注射商品化减毒活疫苗的injection组)，每组50尾常规鱼缸饲养。阳性对照组只在0周注射一针之后投喂正常饲料，另外三组分别将疫苗制成饲料投喂草鱼，根据枯草杆菌芽孢对草鱼生长、免疫以及对养殖水体水质的影响，每天投喂一次，约鱼体重1％的饲料，连续投喂8周，之后喂两周正常饲料后进行攻毒试验，同时分别于第2、4、6、8周末对四组草鱼分别尾静脉取血分离收集草鱼血清，肠粘液，并分离保存脾、头肾、肾、后肠等组织，-20℃保存备用。攻毒后收集死亡草鱼的脾、肾、肠道、肝及肌肉组织直至观察到14天，处死所有草鱼并取内脏。五、口服疫苗的免疫效果评价5.1：间接elisa测定草鱼血清和肠粘液中特异性抗体水平以vp4原核蛋白(5μg/孔)包被酶标板过夜，将免疫2,4,6,8周后草鱼血清按照1：50稀释，hrp标记的兔抗草鱼igm作为二抗(1：5000稀释)检测免疫草鱼血清中igm抗体水平。结果如图9中的a所示，充分说明：口服重组芽孢能够有效刺激草鱼产生vp4特异性的系统免疫反应。以vp4原核蛋白(5μg/孔)包被酶标板过夜，将免疫2,4,6,8周后草鱼肠粘液按照1：5稀释，hrp标记的小鼠抗草鱼igz作为二抗(1：300稀释)检测免疫草鱼肠粘液中igz抗体水平。结果如图9中的b所示，充分说明：口服重组芽孢能够有效刺激草鱼产生vp4特异性的局部黏膜免疫反应。5.2：草鱼脾、头肾、肾、后肠中细胞因子的检测取收集的草鱼脾、头肾、肾、后肠组织用trizol法提取总rna并定量。将1μg总rna逆转录为cdna，用depc水稀释后行real-timeqpcr检测il-4/13a、il-4/13b、csf1r、foxp3、baff、cd8、cd4、mhc-ii、il-1β、tnf-α、tgf-β、ifn-i相关细胞因子及信号通路相关分子rig-i、mda5、lgp2、tlr3、tlr7、tlr8、tlr9、tlr21、tlr22、ips-1、irf3、irf7、nf-κb、mx1、mx2和mx3等。结果如图10a、图10b、图10c、图10d、图10e、图10f、图10g、图10h、图10i、图10j、图10k、图10l和图11所示，充分说明：口服重组芽孢能够有效刺激草鱼产生非特异性和特异性细胞免疫反应，且跟某些信号通路激活有关。六、攻击感染每组分别取20尾上述免疫后草鱼各注射200ul约104ld50gcrv-hunan1307进行攻毒感染，并以加热棒加热保持水体温度恒定28℃。攻毒后统计累计死亡率，即疫苗的免疫保护力。结果如图12所示，充分说明：口服重组芽孢能够刺激草鱼机体产生一定的抗病毒保护力。七、攻毒后各器官病毒载量的检测采用绝对荧光定量的方法，用病毒特异性taqman探针检测死亡鱼体内脾、肾、肠道、肝及肌肉组织的病毒含量。结果如图13所示，充分说明：死亡草鱼是由gcrv感染引起，口服重组芽孢能够使草鱼机体抵抗部分病毒感染。由此可知，本发明的融合蛋白，具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤。且较已有疫苗对鱼体抵抗草鱼出血病具有更好免疫保护效果。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>中山大学<120>一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途<130>183473<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aaaagcataaaaaacactacaagcttatgggaaacgtccagacgaac47<210>2<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aaatgagtggcaaagtgctagagctcctaagacggaggaggccagt46<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cctaccagtggataatgtatgcaaac26<210>4<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtatatcttcagtgctacctcatatacagcattttg37<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaag38<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgctaacgcaaaaaatgagtggcaaagtgc30<210>8<211>354<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcattt60ggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgt120ataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaa180gaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaa240gattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcac300gataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactac354<210>7<211>1953<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7atgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttc60ggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaa120cttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttca180ccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatg240tctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctata300ttcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgtt360ggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaaca420tcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttgg480tctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggta540acgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgta600tgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgg660gccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggca720ggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtct780cgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctca840gctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaacc900accccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcggg960acgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatg1020attgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatc1080atatacgataccaatctaacagcggcgaagctggctaaggttactcctgcattgctgatg1140ctgcagacggctaaaccacttagtgcggagataaccgctgcggatattcaagccatcaca1200cctcttgtagtagggactgataagctcaacactttggtcaccactggttttggcaatatt1260cgtaacattaccgacttctcaatgtctgcaatttgggaaccagagacagtcagcgcggca1320ggcaattactatctatggccgactgtaatcggtgatgcatcaatgacatcagattggggg1380acaattagcacatctctagctaatggcagactccgtgtcgcacctctggacctgactcat1440gcactccacaaaggcaatgtcgtggagtcaatcgtaccatctgatgtgctaggtaacgcc1500tcaccagaggaaatgcgttccgcgttgccagccgatgtgctgacagctttcaaagccaag1560ctcacaacagtggcttctgtagtcggccgtgccttaaatcccaacgacagtgcgcatgca1620ccatcctccggcaccgtcctcggcccgcttgcaatcgaaaacaaagcccaatcaaaacct1680aaacccgtatcagatctgtggatagccgctcgtcgtggtgtgaatctattcgtagcctct1740ccaagcgcgagtctgcaaacaggtgtgccggtcatgggggacagcagcgtgttgacaagc1800ttgacgggtggtgcaactaccgcgttgaatactggtgacatgggtacgccaagcctggag1860gccacagcgaaacgggcagctagagttgctggaggactgctacgacagagagtcatggac1920aaactaactcgatactggcctcctccgtcttag1953<210>9<211>2319<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9atgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtctttttctatcattt60ggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatctactcgccgt120ataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaaaaatacaaa180gaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatatgataaaaaa240gattatgactgtgattacgacaaaaagtatgatgactatgataaaaaatattatgatcac300gataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacactacaagctt360atgggaaacgtccagacgaacaacactacagtcaatatcaatggcgacggtaatagcttc420ggtgccgaaagcggcatgcaatcgacagctgcgcctgaaatcatgttatcacccggaaaa480cttaacccgaatggactcgcatggatgaaagtcgcaggatcaggtacaggaccaggttca540ccgcaaattgtacacgctacagacgggtcaccgtattgttacatccccccggatgccatg600tctagtatggaaaaatcagcaggtgccgttaatttgtgggaaccactattcgccgctata660ttcgaaacctgctctacagtgaacgtgtccgactttactgatgagttcagcgcctacgtt720ggcgtcagtgaaccagaggccctcaagaagtacatcgagaaaggagtcttcatgtcaaca780tcacaagcgaagaatttctttgggacactcgggcagaggatggcgaggataaagggttgg840tctgaagatatacggacggcggctgctatgataccagtagacacacctcatggctcggta900acgtgtgattggaagagcttacttagattttgggacgaaaacctaccagtggataatgta960tgcaaacaataccaaaatgctgtatatgaggtagcactgaagatataccctgcgttacgg1020gccggaaatagtggatcacttctctctgatgtcgtcggcgtattagctggtggtgcggca1080ggaactacagcgtctggagtgagtatggtcgaaggtgtgacgcgtaatgagcaggtgtct1140cgaattctgacatcagcggacgttgatattttgacgtcatcagcgccagtgcctgtctca1200gctttgagaactccaccagtggaattgtcctatcagcccagtgccctgagcgccaaaacc1260accccatggttggttcgatatcccgggactactgccatagagaagacattcgacgtcggg1320acgacatctaagacgacgtattacctgagcatgggtaactccggtggtggagatttgatg1380attgatctgaagcgacttccagcatgcggacttgaatactccctgcgtggcatcccgatc1440atatacgataccaatctaacagcggcga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