一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗的制作方法

本发明属于生物技术基因工程领域，涉及一种用于预防猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型的融合蛋白。具体地，利用基因重组技术，将猪圆环病毒1型cap蛋白亚单位、猪圆环病毒3型cap蛋白与分子佐剂il-5串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺得到一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗以及该疫苗在预防猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型中的应用。
背景技术：
猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）属圆环病毒科圆环病毒属，是一种环形单链dna病毒。pcv基因组大小约为1.7kb，cap蛋白是pcv的唯一结构蛋白，与其免疫相关（杨克礼等，2017）。传统上将pcv分为pcv-1和pcv-2两种血清型，两种血清型感染均可造成繁殖障碍，导致母猪返情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产弱仔等，虽然临床上pcv-2引起的繁殖障碍更严重，但pcv-1在正常猪群及猪源细胞中污染率却极高，给临床防治带来极大挑战。2016年美国学者palinski等报道在患有pdns的猪群中发现了一种新型的猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型(pcv-3)。pcv-3基因组包含2000碱基，具有与pcv-1和pcv-2相似的基因组结构，主要编码cap和rep两个基因。自pcv-3在美国发现以来，中国、韩国、波兰、巴西和意大利等国家地区也相继报道了该病毒的流行，大范围的检测发现，该病原可以在我国的8个省以及1个直辖市检测到，临床表现出局部典型的猪皮炎肾病综合征病变，包括坏死性血管炎、肾炎、肉芽肿性淋巴腺炎、支气管间质性肺炎。白介素-5（interleukin-2,il-5）曾被称为b细胞生长因子、t细胞替代因子，是由thc第二亚型在ppd等刺激后产生的一种含有n-乙酰氨基半乳糖残基的弱酸性糖蛋白，具有促进b细胞分化与生长、诱导嗜酸性粒细胞分化、诱导细胞毒t细胞(ctl)生成的作用，是一种具有多种生物学功能的淋巴因子。目前尚无国内或国际注册的pcv-3疫苗以及pcv-1与pcv-3二价疫苗。技术实现要素：本发明根据结构蛋白在pcv病毒感染中的作用，选择pcv-1cap蛋白亚单位和pcv-3cap蛋白作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与白介素-5串联，克隆入prsetb载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的猪圆环病毒二价基因工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型的感染。优选地，本发明所述pcv-1cap蛋白亚单位，选自seqidno.4的氨基酸序列或其功能等价物。优选地，本发明所述pcv-3cap蛋白，选自seqidno.6的氨基酸序列或其功能等价物。优选地，本发明所述白介素-5，选自seqidno.8的氨基酸序列或其功能等价物。本发明所述融合蛋白还包含药学上可接受的盐以及表达所需要的载体。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分等。本发明所提供的猪圆环病毒二价基因工程疫苗具有良好安全性，临床上有较高免疫原性，刺激动物体产生高水平特异性抗体，有效预防猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型的感染。附图说明下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体prsetb-pcv-il-5的示意图。图2显示了重组表达载体prsetb-pcv-il-5用bamhⅰ+hindⅲ酶切后的电泳结果，其中泳道1为dnamarker，泳道2为未酶切对照，泳道3为质粒酶切图，泳道4为空质粒。图3为融合蛋白编码基因表达产物sds-page鉴定结果，其中泳道1为分子量marker，从上至下依次为97.4kd、66.2kd、43kd、31kd、22.0kd、14.4kd，泳道2为阴性对照，泳道3为诱导纯化样品。图4为样品纯化westernblot印迹结果，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为97.4kd、66.2kd、43kd、31kd、22.0kd、14.4kd，泳道2为阴性对照，泳道3为样品。图5为免疫小白鼠elisa检测血清特异性抗体结果，其中（-◆-）为20171107组；（-■-）为20171108组；（-▲-）为20171109组；（-×-）为空白对照组。具体实施方式实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐明本发明，但并不构成对本发明范围的限制，以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》（2002年，第三版，科学出版社）所述方法进行。实施例一融合蛋白基因的来源本发明综合分析国内外猪圆环病毒1型和3型主要流行株的基因序列、抗原结构、流行病学研究进展，根据其结构蛋白cap蛋白的氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对其亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和二级结构进行分析，预测可能的b细胞抗原表位及t细胞抗原表位，并综合相关报道，从而确定pcv-1和pcv-3cap蛋白亚单位。通过柔性linker连接形成疫苗骨架结构后再与il-5串联，该疫苗总体结构为：pcv1cap-pcv3cap-il-5-tag实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了bamhⅰ（5’端）和hindⅲ（3’端）限制性酶切位点，将合成好的片段克隆到pmd18t载体上，序列测定证实插入基因片段与涉及序列一致（见序列表）。将重组质粒命名为pmd18t-pcv-il-5，用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用invitrogen公司的prsetb质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入质粒2μl，限制性内切酶5个活性单位（newenglandbiolabs），10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37.0℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl200mmedta终止反应。在1%琼脂糖凝胶电泳中电泳30分钟。紫外灯下将prsetb质粒和目的片段切下，按照qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段为1:2～3的比例将核苷酸片段与表达载体混合，反应体系15μl，由t4dna连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为prsetb-pcv-il-5（见图1），转化感受态大肠杆菌bl21（de3）plyss。转化：将prsetb-pcv-il-5置冰上融化，加入1ml连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒钟，然后迅速放回冰水浴90秒钟，加入1mllb培养液，37.0℃静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μllb培养基重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有100μl/ml氨苄青霉素的lb琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12～16小时，直至克隆形成。鉴定：挑取平板上的单克隆至lb培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用限制性内切酶bamhⅰ和hindⅲ进行双酶切，可以切出相应大小片段的克隆为1500bp左右，可初步确定为阳性克隆（见图2），阳性克隆进行dna序列测定进一步验证其正确性（见序列表）。诱导表达：将阳性克隆过夜培养，次日早上按照1:100转接，37℃震荡培养3小时候，加入0.5mmiptg诱导，继续培养3小时，制备样品。常规sds-page检测目的蛋白的表达情况，可在约55kd分子量处见到特异性条带为正确克隆（见图3）。取正确克隆，放大培养，sds-page证实表达正确后，使用常规westernblot进一步证实其表达准确性（见图4）。最后筛选得到的高效分泌表达融合蛋白的工程菌，命名为prsetb-pcv-il-5/bl21(de3,plyss)。实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化发酵将生产菌种接种到2ml含有100μl/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时活化菌种。将活化好的菌种以1:100的接种量接入摇瓶，37℃震荡培养至od600=3，可按10%比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和ph值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37℃时，标定ph及溶氧（od）零点。发酵温度为37.0℃±0.1℃，溶氧控制在20%左右，ph控制在7.0，接种后培养菌体od600=1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入iptg（终浓度为0.5mm）诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做sds-page检测表达情况。纯化将收集的菌体，用包涵体洗液ⅰ（1%tritonx-100，20mmtris-clph8.0）混悬后进行超声，2000w超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包涵体，并用包涵体洗液ⅱ（1%doc,4m尿素，20mmtris-clph8.0）混悬二次超声洗涤包涵体，二次低温离心收集包涵体。包涵体沉淀用8m尿素，0.3%β-me，20mmtris-cl（ph=8.0）混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30分钟，弃去沉淀。变性蛋白1:100稀释，复性液用tris（ph=8.0）缓冲体系，加入0.3m精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用ph=8.0的20mm磷酸缓冲液，0.5m氯化钠，20mm咪唑，平衡上亲和层析柱，用ph=8.0的20mm磷酸缓冲液，0.5m氯化钠，0.5m咪唑洗脱。再用1.5m硫酸铵、100mmedta、ph=8.5的10mm磷酸氢二钠平衡上疏水层析柱，再平衡，用ph=8.5的10mm磷酸氢二钠洗脱，即得猪圆环病毒二价基因工程疫苗半成品原液，进行sds-page以及westernblot印记检定纯化产物是否为目的蛋白。乳化将纯化的半成品原液用灭菌pbs稀释至200μg/ml。取进口白油矿物油佐剂duoprime(医药级)经121℃灭菌15分钟，备用。按油相:水相=50:50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80～100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2分钟，然后以5500r/min高速循环乳化9分钟，制成油包水单相疫苗。按照现行版《中国兽药典》附录进行无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格，置于2～8℃保存备用。实施例四猪圆环病毒二价基因工程疫苗安全性实验材料疫苗：猪圆环病毒二价基因工程疫苗，批号20171107、20171108、20171109，由公司研发中心提供。试验动物：8周龄balb/c小白鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。28日龄健康三元杂交断奶仔猪由广东永顺制药提供。方法疫苗对小白鼠的安全性将40只8周龄balb/c小白鼠随机分为3个批次组和1个对照组，10只/组。批次组分别皮下注射3个不同批次的猪圆环病毒二价基因工程疫苗，0.5ml/只。对照组皮下注射生理盐水白油乳剂0.5ml/只。连续观察14天，记录小白鼠的健康状况。疫苗对仔猪的安全性将20头28日龄健康三元杂交断奶仔猪随机分为3个批次组和1个对照组，5头/组。批次组分别耳后肌肉注射3个不同批次的猪圆环病毒二价基因工程疫苗，2ml/头。对照组注射生理盐水白油乳剂2ml/只。连续观察14天，记录仔猪的健康状况。试验结果疫苗对小白鼠的安全性试验结果见表1，免疫后，三个试验组小白鼠均未出现任何过敏反应或中毒症状，精神状态良好，体温、采食、饮水等一切正常，未出现明显局部炎症等临床副反应，无死亡发生，与对照组一致，表明猪圆环病毒二价基因工程疫苗对小白鼠是安全的。表1疫苗对小白鼠的安全性试验结果组别动物数量体温食欲精神健康状况炎症反应死亡数量2017110710正常正常正常良好无02017110810正常正常正常良好无02017110910正常正常正常良好无0对照组10正常正常正常良好无0疫苗对仔猪的安全性试验结果如表2，整个观察期内，所有免疫组的仔猪体温和食欲均正常，精神状态良好，未出现任何临床异常现象，免疫部位未发现过敏或炎症反应，无死亡发生，与对照组一致，表明猪圆环病毒二价基因工程疫苗对断奶仔猪是安全的。表2疫苗对仔猪的安全性试验结果组别动物数量体温食欲精神健康状况炎症反应死亡数量201711075正常正常正常良好无0201711085正常正常正常良好无0201711095正常正常正常良好无0对照组5正常正常正常良好无0实施例五猪圆环病毒二价基因工程疫苗免疫后抗体水平检测疫苗：猪圆环病毒二价基因工程疫苗，批号20171107、20171108、20171109，由公司研发中心提供。试验动物：8周龄balb/c小白鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。方法将20只8周龄balb/c小白鼠随机分为4组，3个疫苗免疫组和1个空白对照组，5只/组。按照分组情况对试验小白鼠进行免疫，皮下注射0.2ml/只。分别在免前和免后7、14、21、28、35、42、49、56天断尾采血，分离血清用于抗体检测。将纯化的重组蛋白抗原用50mmol/l的cbs（ph9.6）稀释成1μg/ml，加入酶标板中，100μl/孔，4℃静置包被过夜；去掉液体，用pbst（含0.05%tween-20，ph7.4）洗板三次，加入封闭液（含5%小马血清的pbst），100μl/孔，37℃封闭1小时；洗板三次，用血清稀释液（含5%小马血清的pbst）将待检样品1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400倍稀释，加入酶标板，100μl/孔，同时设阴性对照，37℃孵育1小时；洗板三次，加入1:5000稀释的hrp标记羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃孵育1小时；洗板四次，加入tmb底物100μl/孔，避光显色15分钟；加入2mh2so4终止反应，于450nm波长下检测吸光度值（biorad680酶标仪）。试验结果：如图5，免后14天，三个批次疫苗免疫组的小白鼠血清中开始检测到特异性抗体，然后抗体水平不断升高，并在免后35天达到高峰，随后稳定下降，一直持续到试验结束，三个批次疫苗组之间无显著差异，空白对照组未检测到抗体。实施例六免疫保护试验疫苗：猪圆环病毒二价基因工程疫苗，批号20171107、20171108、20171109，由公司研发中心提供。试验动物：28日龄健康三元杂交断奶仔猪由广东永顺制药提供。方法将40头28日龄仔猪随机分为8组，5头/组。按照分组情况对试验仔猪进行免疫，其中1组和5组耳后肌肉注射20171107批疫苗，1ml/只；2组和6组耳后肌肉注射20171108批疫苗，1ml/只；3组和7组耳后肌肉注射20171109批疫苗，1ml/只；4组和8组为对照组。免后第35天对1～4组采用pcv1bj-1进行攻毒，对5～8组采用pcv3-china/gd2016进行攻毒。观察和记录试验仔猪的发病和死亡情况。攻毒后连续14天观察猪群的精神状态、临床症状、死亡情况，统计发病率并计算保护率。保护率=［（攻毒对照组发病率-疫苗免疫组发病率）/攻毒对照组发病率］×100%。试验结果：结果如表3，采用pcv1毒株攻毒，20171107疫苗组一只发病，无死亡，保护率80%；20171108组和20171109组均无发病无死亡，保护率100%；对照组五只均发病，一只死亡。采用pcv3毒株攻毒，20171107组和20171108组均无发病无死亡，保护率100%；20171109组一只发病，无死亡，保护率80%；对照组五只均发病，三只死亡。表3猪圆环病毒二价基因工程疫苗对仔猪的保护效力序列表<110>青岛明勤生物科技有限公司<120>一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1473<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgccgctgccgtttcagtattaccgcattcgtaaagcaaaatatgaattctacccgcgc60gatccgatcaccagcaatgaacgtggcgtcggttctacggtggttattctggatgcaaac120tttgtgaccccgtccacgaatctggcttatgacccgtacattaactatagctctcgccat180accatccgtcagccgtttacgtaccacagccgctatttcaccccgaaaccggaactggat240aaaacgattgactggttccatccgaacaataaacgtaatcaactgtggctgcatctgaac300acccacacgaatgtggaacacaccggtctgggtggttctggtttacttagagaacggact360tgtaacgaatccaaacttctttggtgccgtagaagtctgtcattccagttttttccggga420cataaatgctccaaagcagtgctccccattgaacggtggggtcatatgtgttgagccatg480gggtgggtctggagaaaaagaagaggctttgtcctgggtgagcgctggtagttcccgcca540gaattggtttgggggtgaagtaacggctgtgtttttttttagaagtcataactttacgag600tggaactttccgcataagggtcgtcttggagccaagtgtttgtggtccaggcgccgtcta660gatctatggctgtgtgcccgaacatagtttttgtttgctgagctggagaaattacagggc720tgagtgtaactttcatctttagtatcttataatattcaaagctaatcgcagtttcccatt780cgtttaggcgggtaatgaagtggttggcgtgccacggcttgttattctgaggggttccaa840cggaaatgacgttcatggtggagtatttctttgtgtagtatgtgccagctgtgggcctcc900taatgaatagttttcttctgacatagcgccttctgtggcgtcgtcgtctccttgggcggg960gtcttcttctgaatatagctctgtgtctcatttggttctggtatgagaatgcttctgcat1020ttgagtctgctaggtcttggagctgcctacgttagtgccattgctgtagaaaataccatg1080aatagactggtggcagagaccttgacactgctctccattcatcgaactctgctgataggc1140gatgggaacttgatgatttcaactcctgtacatacaaatcaccaactatgcattgaagaa1200gtctttcagggaatagacacgttgaagaatcaaactgcacgaggggatgccgtggaaaaa1260ctattccaaaacttgtctttaataaaagaatatatagaccgccaaaaaaaaaattgtgga1320ggggaaagatggagagtaacgcaattcctggactacttgcaagtttttcttggtgtgata1380aataccgagtggacaatggaaagttaactagaacaaaaactcatctcagaagaggatctg1440aatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcat1473<210>2<211>487<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2leuproleupropheglntyrtyrargilearglysalalystyrglu151015phetyrproargaspproilethrserasngluargglyvalglyser202530thrvalvalileleuaspalaasnphevalthrproserthrasnleu354045alatyraspprotyrileasntyrserserarghisthrilearggln505560prophethrtyrhisserargtyrphethrprolysprogluleuasp65707580lysthrileasptrpphehisproasnasnlysargasnglnleutrp859095leuhisleuasnthrhisthrasnvalgluhisthrglyleuglygly100105110serglymetarghisargalailepheargargargproargproarg115120125argargargarghisargargargtyrvalargarglysleupheile130135140argargprothralaglythrtyrtyrthrlyslystyrserthrmet145150155160asnvalileservalglythrproglnasnasnlysprotrphisala165170175asnhispheilethrargleuasnglutrpgluthralaileserphe180185190glutyrtyrlysileleulysmetlysvalthrleuserprovalile195200205serproalaglnglnthrlysthrmetpheglyhisthralaileasp210215220leuaspglyalatrpthrthrasnthrtrpleuglnaspaspprotyr225230235240alagluserserthrarglysvalmetthrserlyslyslyshisser245250255argtyrphethrprolysproileleualaglythrthrseralahis260265270proglyglnserleuphephepheserargprothrprotrpleuasn275280285thrtyraspprothrvalglntrpglyalaleuleutrpseriletyr290295300valproglulysthrglymetthraspphetyrglythrlysgluval305310315320trpileargtyrlysservalleuglyserglymetargmetleuleu325330335hisleuserleuleuglyleuglyalaalatyrvalseralaileala340345350valgluasnthrmetasnargleuvalalagluthrleuthrleuleu355360365serilehisargthrleuleuileglyaspglyasnleumetileser370375380thrprovalhisthrasnhisglnleucysileglugluvalphegln385390395400glyileaspthrleulysasnglnthralaargglyaspalavalglu405410415lysleupheglnasnleuserleuilelysglutyrileasparggln420425430lyslysasncysglyglygluargtrpargvalthrglnpheleuasp435440445tyrleuglnvalpheleuglyvalileasnthrglutrpthrmetglu450455460serleugluglnlysleuileserglugluaspleuasnseralaval465470475480asphishishishishishis485<210>3<211>333<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgccgctgccgtttcagtattaccgcattcgtaaagcaaaatatgaattctacccgcgc60gatccgatcaccagcaatgaacgtggcgtcggttctacggtggttattctggatgcaaac120tttgtgaccccgtccacgaatctggcttatgacccgtacattaactatagctctcgccat180accatccgtcagccgt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