肺癌诊断分子标记物lncRNALINC00516和试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及疾病诊断预防
技术领域：
，具体地，涉及肺癌诊断分子标记物lncrnalinc00516和试剂盒及其应用。
背景技术：
肺癌发病率和死亡率在我国长期居各恶性肿瘤的首位，其发病时间短、转移快、预后不理想，其5年生存率仅为15％。肺癌容易发生各个不同脏器的转移，如脑转移、骨转移、肝转移等，并引起相应的症状，对病人生存造成极大的影响。大量研究和资料表明，早期诊断和早期治疗是防治肺癌和降低其死亡率的最有效方法，但由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14％左右。现有的传统肿瘤标志物(如癌胚抗原)的灵敏度和特异性均不够高。目前简单的胸透和痰液细胞学化验只能对肺癌进行早期诊断且敏感性非常低，关于肺癌转移诊断方式还缺乏有效、方便的检测手段。因此，开发一种微创而又特异灵敏的肺癌转移诊断标志物是当务之急。人体外周血的循环肿瘤细胞和肿瘤相关的dna和rna都可以被用作体外诊断。研究发现，来自血浆和血清中循环核酸相对比较稳定，一些肿瘤组织中会出现表达异常，且和肿瘤恶化有着密不可分的关系。lncrna是一种长度大于200个核苷酸的rna分子，没有编码蛋白质功能，部分可编辑一些肽类。lncrna可通过表观遗传学、转录调控和转录后调控等多个层面调节细胞内基因的表达，参与机体各种生理病理过程。相关研究已发现lncrna可与蛋白质、rna或dna形成复合物，调节肿瘤细胞的生长，与癌症转移密切相关。进入循环系统的lncrna在正常条件下能被qrt-pcr检测到。血液是最常见的临床检验材料，采集血液也是微小创伤性、无痛苦和极易于被人们接受的取材方法。因此，基于外周血筛选肺癌转移特异性lncrna，并用作为分子标志物具有重要的检测诊断价值。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种肺癌或肺癌诊断分子标记物lncrnalinc00516，所述lncrnalinc00516在肺癌患者血清中特异性显著上调表达，linc00516的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关，能够作为肺癌诊断的分子标记物，尤其可作为肺癌或肺癌转移诊断的分子标记物，其灵敏度为81.1％、特异性为88.1％，具有较高的可靠性。本发明的另一目的在于提供所述lncrnalinc00516在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。本发明的另一目的在于提供一组检测lncrnalinc00516的引物对和探针。本发明的另一目的在于提供所述引物对和探针在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。本发明的另一目的在于提供一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：本发明人从肺癌患者的血液中分离和检测到肺癌转移特异性lncrnalinc00516呈显著高表达，发现血液中的linc00516来源于肺癌细胞，并分泌释放到血液中。此外，linc00516的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关，linc00516对区分肺癌转移患者和肺癌不转移患者的灵敏度高达81.1％，特异性高达88.1％。因此，lncrnalinc00516可作为一种新型的肺癌诊断和肺癌转移血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性、敏感性和特异性。此外，该分子标记物还可作为肺癌转移治疗药物的新治疗靶点。因此，本发明请求保护核苷酸序列如seqidno:1所示的lncrnalinc00516作为肺癌或肺癌转移诊断分子标记物的应用。本发明还请求保护核苷酸序列如seqidno:1所示的lncrnalinc00516作为肺癌转移诊断分子标记物的应用。本发明还请求保护核苷酸序列如seqidno:1所示的lncrnalinc00516在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。本发明还请求保护一组检测lncrnalinc00516的引物对和探针，包括qrt-pcr正向引物、反向引物和taqman探针，核苷酸序列依次如seqidno:2～4所示；所述taqman探针的5’端结合有荧光物质fam，3’端结合有淬灭物质tamra。linc00516-f(seqidno:2)：5’-gcacagagcctcgcctt-3’；linc00516-r(seqidno:3)：5’-agacagtatcacaggtta-3’；taqman探针(seqidno:4)：5’-fam-taattcacagttccacatggct-tamra-3’。本发明还请求保护上述引物对和探针在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。本发明还请求保护一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，包含检测lncrnalinc00516表达量的试剂。优选地，所述试剂包括荧光定量pcr反应体系；所述荧光定量pcr反应体系包括上述引物对和探针。优选地，所述荧光定量pcr反应体系由以下体积的各组分组成：10μltaqman混合液，1μltaqman探针，1μlqrt-pcr正向引物，1μlqrt-pcr反向引物，2μlcdna模板，余量ddh2o补足至20μl。更优选地，所述taqman混合液包括以下组分：2×taqmandna聚合酶、荧光染料、dntp、镁离子和其他盐离子。优选地，所述荧光定量pcr反应条件为：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。优选地，所述试剂盒和/或试剂还含有阳性对照液(即linc00516标准品)、阴性对照液(即空白对照)。优选地，所述试剂盒还包含rna逆转录反应体系；所述rna逆转录反应体系由以下各组分组成：1μlrandomprimer、1μgrnatemplate、1μlm-mlvrt、5μldntpmix、5μlm-mlv5×reactionbuffer、0.5μlrnaseinhibitor和余量rnasefreeh2o补足至25μl。优选地，所述逆转录反应条件为40℃60min；70℃5min。上述试剂盒可用于定性或定量检测血清中linc00516的表达量。上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：s1.采集血液，提供血浆中的总rna；s2.将总rna逆转录成cdna；s3.利用上述qrt-pcr正向引物、反向引物和taqman探针对步骤s2所得cdna溶液进行荧光定量pcr检测，测定样品的ct值；设肺癌患者ctlinc00516/ctu6值阈值为3.575，定义血液中检测ct值大于等于3.575为阳性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明所述lncrnalinc00516在肺癌患者血清中特异性显著上调表达，linc00516的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关，能够作为肺癌诊断的分子标记物，尤其可作为肺癌转移诊断的分子标记物，其灵敏度为81.1％、特异性为88.1％，具有较高的可靠性。本发明所提供的试剂盒检测快速方便、准确率高，可以实现肺癌的早期诊断和预测，能广泛应用于医疗行业肺癌疾病的辅助诊断和治疗。附图说明图1为lncrnalinc00516分别在肺癌转移患者和正常人血液中的表达量。图2为高表达的lncrnalinc00516促进肺癌细胞损伤修复的情况。图3为lncrnalinc00516诊断肺癌转移的roc曲线。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1肺癌转移特征性lncrnalinc00516验证本发明人团队经过前期的大量研究发现，seqidno:1所示lncrnalinc00516与肺癌的诊断、转移相关，可作为肺癌诊断和肺癌转移血液分子诊断标记物。下面利用59例肺癌病人与95例正常人血液标本对linc00516进行探针法pcr检测，从而对肺癌转移特征性lncrnalinc00516进行验证。具体包括如下步骤：1、提取血浆样本总rna(trizolls法)及rna浓度的测定：(1)样品均质化：每0.25ml样品加入0.75mltrizolls试剂(trizolls试剂与样品的体积比为3:1)；移液器上下吹匀几次，使样品均匀。注意：污染物质含量高的生物液体(如全血)应该先用无rnase水按1:1稀释。当样品少量或者样品体积<0.25ml，为方便提取rna，需用无rnase水调整样品体积到0.25ml。(2)相分离：①室温静置5min，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。②每0.75mltrizolls试剂加入0.2ml氯仿。盖紧离心管的盖子。③震荡仪上震荡30s，室温静置2～15min。④4℃，12000rpm离心15min。离心后，混合物分离为3层，上层是澄清的水相，中间层，下层是红色的酚-氯仿相。rna存在于水相里。水相体积约为70％均质时使用的trizolls试剂量。(3)rna沉淀：①水相转移到一个新管。每0.75mltrizolls试剂加入0.5ml100％异丙醇到水相。②混合异丙醇以从水相中沉淀rna。上下颠倒10次，-20℃静置样品30min，以利于rna沉淀。③4℃，12000rpm离心15min。注意：往往离心前rna沉淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。(4)rna洗涤：①移走离心管里上清液，只留rna沉淀。②每0.75mltrizolls试剂加入1ml75％乙醇洗涤rna沉淀。涡旋震荡，混匀样品。③4℃，7500rpm离心5min，弃上清液。(5)重悬rna：①真空或者空气干燥rna沉淀5～10min，不要用真空离心干燥机干燥rna沉淀。②用无rnase水(20～50μl)重悬rna沉淀，移液器上下轻轻吹溶液几次。③在55～60℃的水浴槽中孵育10～15min。④继续下游操作，或保存于-40或-80℃冰箱中。注意：不要让rna沉淀干燥太彻底，否则rna沉淀溶解度降低，会使a260/280<1.6。(6)rna定量：①酶标仪nanodrop1000：启动nucleicacid模块后，按照屏幕提示用2μl无rna酶水清洗基座；选择rna40模式，用2μl对照空白溶液blank；加入2μlrna溶液measure。②微孔板定量系统：共有24个孔，最右侧一列的三个孔为空白对照，剩余21个孔可以加入rna样品进行检测。加样完毕后盖上玻片，放入载板中，用dna_rnaquantification程序读值。(7)定量结果判读：纯rna的a260/280＝2，在1.7～2之间为正常，(＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。a230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐(胍盐)等，较纯净的核酸a260/a230的比值大于2.0。2、总rna的逆转录(1)用mmlvreversetranscriptase(promega)逆转录，操作如下：表1反应体系组分体积randomprimer(10μm)1μlrnatemplate1μgrnasefreeh2o余量总体系13μl置于pcr仪中，70℃5min，然后立即在冰上冷却5min。(2)在上述反应体系中加入以下试剂进行逆转录反应：表2逆转录反应体系轻轻混匀后，置于pcr仪中，40℃60min；70℃5min。逆转录产物置于4℃短暂保存，或者进行后续操作。3、实时定量pcr检测linc00516的表达量(1)实时定量pcr检测引物和探针linc00516-f(seqidno:2)：5’-gcacagagcctcgcctt-3’；linc00516-r(seqidno:3)：5’-agacagtatcacaggtta-3’；taqman探针(seqidno:4)：5’-fam-taattcacagttccacatggct-tamra-3’。(2)实时定量pcr：实时定量pcr反应使用罗氏480probemaster实时荧光定量pcr系统，利用cfx96tmreal-timepcrdetectionsystems(c1000touchpcr仪，bio-rad)进行操作。定量pcr的扩增产物长度以80bp～150bp最为合适(可以延长至300bp)。反应体系如下：表3荧光定量pcr反应体系组分体积cdna模板2μltaqmanmix(roche480probemaster)10μlforwardprimer1μlreverseprimer1μlprobe1μlh2o(pcrgrade)5μl总体系20μl反应条件：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。(3)数据分析：本实验采用相对定量分析方法。每个样品做三个复孔，结果取三个复孔的平均ct值。△ct＝目的lncrna平均ct值-内参基因平均ct值；△△ct＝△ct转移-△ct未转移；本试剂盒采用u6为内参，计算linc00516的相对表达量。数据用spss20.0软件进行分析，以目标lncrna相对表达量为自变量，组别为因变量，建立肺癌早期转移诊断的logistic回归模型，回归模型的拟合度采用似然比检验，回归参数估计值采用非参数检验法。根据roc曲线及曲线下面积(auc)评估目标lncrna诊断的敏感性和特异性。4、肺癌转移特征性lncrnalinc00516验证利用59例肺癌病人与95例正常人血液标本对linc00516进行探针法pcr检测，发现肺癌病人血液标本中的linc00516表达显著上调(p<0.0001)，结果如图1所示。此外，还发现在肺癌细胞中高表达linc00516，细胞损伤修复能力增强，结果如图2所示。以上结果说明linc00516是肺癌转移特征性lncrna。5、利用血液linc00516区分肺癌患者和健康人群从步骤1中获得血液标本，按照上述方法分析肺癌患者和正常人血液中linc00516的表达水平。从结果图1可以看出，linc00516可在肺癌患者血液中检出，转移患者比不转移患者高。通过分析可知，肺癌不转移患者linc00516可被检出的ctlinc00516/ctu6值在0.32～3.56之间，肺癌患者的ct值在3.59～9.48之间。roc曲线如图3所示。因此，设肺癌患者ctlinc00516/ctu6值阈值为3.575，定义血液中检测ct值大于等于3.575为阳性。统计结果如表4所示，灵敏度达到81.1％，特异度达到88.1％，具有较高的可靠性。表4linc00516作为分子标记物检测的特点实施例2一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，包含逆转录反应体系和荧光定量pcr反应体系；所述荧光定量pcr反应体系包括qrt-pcr正向引物、反向引物和taqman探针；所述qrt-pcr正向引物、反向引物和taqman探针的核苷酸序列分别依次如seqidno:2～4所示。所述taqman探针的5’末端结合有荧光物质fam，3’末端结合有淬灭物质tamra。linc00516-f(seqidno:2)：5’-gcacagagcctcgcctt-3’；linc00516-r(seqidno:3)：5’-agacagtatcacaggtta-3’；taqman探针(seqidno:4)：5’-fam-taattcacagttccacatggct-tamra-3’。上述引物和探针可用于制备诊断其他肿瘤的试剂盒和/或试剂。所述荧光定量pcr反应体系由以下体积的各组分组成：10μltaqman混合液，1μltaqman探针，1μlqrt-pcr正向引物，1μlqrt-pcr反向引物，2μlcdna模板，余量ddh2o补足至20μl。所述taqman混合液包括以下组分：2×taqmandna聚合酶、荧光染料、dntp、镁离子和其他盐离子。所述荧光定量pcr反应条件为：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。所述试剂盒和/或试剂还含有阳性对照液(即linc00516标准品)、阴性对照液(即空白对照)。所述rna逆转录反应体系由以下各组分组成：1μlrandomprimer、1μgrnatemplate、1μlm-mlvrt、5μldntpmix、5μlm-mlv5×reactionbuffer、0.5μlrnaseinhibitor和余量rnasefreeh2o补足至25μl。所述逆转录反应条件为40℃60min；70℃5min。上述试剂盒可用于定性或定量检测血清中linc00516的表达量。上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：s1.采集血液，提供血浆中的总rna；s2.将总rna逆转录成cdna；s3.利用上述qrt-pcr正向引物、反向引物和taqman探针对步骤s2所得cdna溶液进行荧光定量pcr检测，测定样品的ct值；设肺癌患者ctlinc00516/ctu6值阈值为3.575，定义血液中检测ct值大于等于3.575为阳性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>中山大学<120>肺癌诊断分子标记物lncrnalinc00516和试剂盒及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>725<212>dna<213>人(human)<400>1gccacgtgaaggatgtgtttgcttccccttccaccatgattgtaagtttcctgaggcctc60cccagccatgtggaactgtgaattaaacttctttcctggagtgtgaaaatgaactaataa120actctgtgacctcagagactccctctcagtgaccctgttctcaaatgtatgaagatgggt180gctcaaagatctctctctaaacatggaacagggcctgtctgaagacataagtgattaact240tctaatctataactaaggtctgagtcctgaagaccttcctctggaggctgagtagttaat300ctagatgggtccaggtgctgcaggtaaaatacctcttttctgacaagactaggactctta360catagactaccatgaactaaaagaagcacaacattgccagagtaacctgtgatactgtct420tcatgcgaacttggtatcctgtttccatcccagccttctataacccagtaacatcttttt480tgaaaccagtgggtgagaaagacacctggtcaggaacgcggaccacaggacaactcaggc540tcacccacggcatcagactaaaggcaaacaaggactctgtataaagtaccggtggcatgt600gtattagtggagatgcagcctgtgctctgcagacagggagtcacacagacacttttctat660aatttcttaagtgctttgaatgttcaagtagaaagtctaacattaaatttgattgaacaa720ttgta725<210>2<211>17<212>dna<213>人(human)<400>2gcacagagcctcgcctt17<210>3<211>18<212>dna<213>人(human)<400>3agacagtatcacaggtta18<210>4<211>22<212>dna<213>人(human)<400>4taattcacagttccacatggct22当前第1页12