鉴定夏天无的SNP标记、等位基因特异性PCR法及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定夏天无的snp标记、等位基因特异性pcr法及应用。

背景技术

夏天无(伏生紫堇)corydalisdecumbens(thunb.)pers.广泛分布在江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、山西、台湾，以及日本南部。夏天无的块茎作为药材首载于清《本草纲目拾遗》，也是2015年版《中国药典》中夏天无corydalisdecumbentisrhizoma的正品来源。夏天无具有活血止痛，舒筋活络，祛风除湿的作用，用于头痛，中风偏瘫，腰腿疼痛，风湿痹痛，跌扑损伤等症。目前已经有很多夏天无制剂被列为中药成方制剂保护品种，如夏天无注射液和复方夏天无片等。

历版《中国药典》规定药材夏天无的正品来源只有夏天无c.decumbens。然而实际上夏天无类药材来源众多。由于夏天无及其近缘种在形态上十分相似，时有掺杂情况在药材市场上出现。目前虽然有对夏天无的形态及其化学成分方面的研究，但是尚未发现夏天无的特异性pcr的鉴别报道。因此，需要建立一种可靠的方法实现夏天无及近缘种的准确鉴别。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于没有对夏天无的特异性鉴别的方法。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

用于鉴定夏天无的snp分子标记，所述snp分子标记如seqidno.1所示，为snp5和/或snp6，其中snp5为如seqidno.1所示序列的第188位碱基，此处碱基为c，则鉴定为夏天无；其中snp6为如seqidno.1所示序列的第692位碱基，此处碱基为g，则鉴定为夏天无。

本发明还提供所述snp分子标记的应用，为如下(a1)至(a3)中的任意一种：

a1:检测所述夏天无分子标记的物质鉴定或辅助鉴定夏天无中的应用；

a2:检测所述夏天无分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定夏天无产品中的应用；

a3:所述snp分子标记在夏天无分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供基于等位基因pcr检测夏天无的特异性引物对d2：包括上游引物dec-2f：5’-gcggaattacaaggatattgc-3’，所述上游引物dec-2f序列如seqidno.2所示，下游引物dec-2r：5’-cccaattctgagactcgtac-3’，所述下游引物dec-2r序列如seqidno.3所示。

本发明还提供所述引物对的应用，为如下(b1)至(b3)中的任意一种：

b1:鉴定待测药材是否为或待测样品中是否含有夏天无；

b2:制备用于鉴定待测药材是否为或待测样品中是否含有夏天无的试剂盒；

b3:在夏天无育种中的应用。

优选的，所述试剂盒中还包括dna聚合酶、pcr缓冲液、dntps。

本发明还提供基于等位基因特异性pcr检测夏天无的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组dna；

(2)以待测样品的基因组dna为模板，利用上述引物对进行pcr扩增反应，扩增含有如seqidno.1所示序列的片段；

(3)检测pcr扩增产物。

优选的，所述步骤(2)中pcr反应体系包括所述引物对、dna聚合酶、pcr缓冲液、所述待测样品基因组dna、dntps和水。

优选的，所述步骤(2)中引物对d2最低模板检测限度为60ng，所述引物对dec-2f和dec-2r的摩尔比为1:1。

优选的，所述步骤(2)中pcr扩增程序包括变性、退火和延伸，所述退火温度为42℃-60℃，所述3个步骤的循环次数为20个。

优选的，检测步骤(3)中pcr扩增产物的序列，所述pcr产物含有seqidno.1序列中所示的dna片段，所述待测样品为或候选为夏天无；所述pcr产物不含有seqidno.1序列中所示的dna片段，所述待测样品非或候选为非夏天无。

本发明的有益效果在于：

本发明依据snp位点设计了1个引物对，建立一种快速、准确的基于等位基因特异性pcr的夏天无鉴定方法。实验结果证明，本发明提供的鉴定或辅助鉴定夏天无的方法具有稳定的特异性和灵敏性，可以从72份14个物种中成功的鉴别出正品，最小dna模板检出限度为60ng。利用本发明提供的基于等位基因特异性pcr的夏天无鉴定方法，能够实现对夏天无及其加工制品真伪的准确鉴定，具有准确性高、稳定性好、特异性强、无需测序以及不受药用部位影响等优点。

附图说明

图1通用引物对样品dna模板质量检测结果，其中mard为dnamarkerd；

图2为不同条件对夏天无及其混伪品延胡索、齿瓣延胡索as-pcr扩增结果的影响，其中a为退火温度优化结果，b为循环次数优化结果，c为不同酶类型实验结果；1为延胡索(样品编号：c283)，2为齿瓣延胡索(样品编号：c316)，3为夏天无(样品编号：c286)。mard为dnamarkerd；rtaq为rtaqdna聚合酶，extaq为extaqdna聚合酶，speedstar为speedstar^tmhsdna聚合；

图3为最低模板限度检测结果，其中1为延胡索(样品编号：c283)，2为齿瓣延胡索(样品编号：c316)，3为夏天无(样品编号：c286)，d2为夏天无特异性鉴别引物对名称；

图4为扩大样品后对特异性鉴别引物可靠性的验证结果，其中d2为夏天无特异性鉴别引物对名称。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用主要材料的来源为：

实施例1中的紫堇属植物材料及其来源见表1。表1中的植物名称记载在文献(zhangmingli,suzhiyun,magnuslidén.corydalisdc.[m]//wuzy,ravenph,hongdy.floraofchina.vol.7.bei-jing:sciencespress,st.louis:missouribotanicalgardenpress，2008:295-428.)和(kikemanzoku.corydalisdc.in:floraofjapan[m].washington:smithsonianinstitution.1965:476.)中。14种植物样品共计72份，收集自安徽、江苏、浙江、河南、山东、黑龙江、吉林、辽宁和新疆等自然分布区不同居群的植株，除浙江金华所产的延胡索为栽培物种之外，其它均系野生。所有样品由安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，植物凭证标本存放在安徽中医药大学药学院。

表1为野生植物材料及来源

注：*为测序样品

实施例2中的药材材料及其来源见表2。表2中的药材基源植物名称记载在文献(zhangmingli,suzhiyun,magnuslidén.corydalisdc.[m]//wuzy,ravenph,hongdy.floraofchina.vol.7.bei-jing:sciencespress,st.louis:missouribotanicalgardenpress，2008:295-428.)。共计14份药材样品购自安徽亳州药材市场和药店(表2)。

表2药材材料

10×pcrbuffer，dntp与extaq酶：购自takara公司；

其中as-pcr为等位基因特异性pcr。

实施例1

夏天无snp分子标记的获得

针对测序所得紫堇属实心延胡索组和叠生延胡索组14个物种共56个样品的matk序列，利用bioedit7.2.2软件进行同源对齐，手动矫正后观察延胡索所特有的snp位点。我们发现夏天无基因组dna中对应于seqidno.1所示序列的第188位c为snp5，第692位a为snp6。

实施例2

引物设计

夏天无特异性pcr扩增引物的上游引物dec-2f3’末端与snp5相同为c，下游引物dec-2r3’末端与snp6互补为c。

将dec-2f经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与dec-2f具有相同功能的dna分子，dec-2r经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与dec-2r具有相同功能的dna分子。

将各个引物进行预实验，比较灵敏度和特异性等性能，最终得到用于鉴定夏天无的1套引物对。

用于鉴定夏天无的引物对d2由上游引物dec-2f和引物dec-2r组成(5’→3’)：

dec-2f：gcggaattacaaggatattgc；

dec-2r：cccaattctgagactcgtac；

各条引物均独立包装。各条引物均以引物溶液形式加入到pcr反应体系中，各引物在引物溶液中的初始浓度均为10pmol/μl，引物对dec-2f和dec-2r的摩尔比为1:1。

实施例3

模板获取与质量检验

dna提取：植物材料取硅胶干燥的叶片20mg，药材粉末过5号筛后取100mg，按照改良的ctab法提取总dna；

质量检验：利用核酸蛋白测定仪的紫外吸收法测定双链dna模板的浓度和纯度，并用通用引物trnh(序列为cgcgcatggtggattcacaatcc)和psba(序列为gttatgcatgaacgtaatgctc)对样品进行扩增以检验模板dna质量。pcr反应体系为25μl，包括60ngdna模板，上游引物和下游引物各0.5μl(10pmol/μl)，0.125μlextaqdna聚合酶(5u/μl)，2.5μl10×pcrbuffer，2μldntp，20μlh2o。反应在96孔梯度pcr仪上进行。反应程序为94℃4min；30个循环：94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃3min。反应结束后，每个样品取5μl扩增产物与2μl6×loadingbuffer混匀，点样于含0.01％eb和1％琼脂糖的凝胶上，在200v电压的条件下电泳约30min，在jy04s-3e型凝胶成像系统中观察并记录结果。

如图1所示，结果表明每个待测样品dna模板的浓度为0.5ng/μl至4000ng/μl不等，dna模板提取质量良好，可用于进行试验，从14个物种中随机各挑选出一个样品进行展示。

实施例4

反应体系与扩增条件优化

待测样品为夏天无(表1中样品编号为c286)

(1)退火温度优化

在42℃至60℃之间以2℃的间隔设置退火温度考察梯度，从中找到最佳退火温度值。

反应体系：60ngdna模板，dec-2f和dec-2r各0.5μl(10pmol/μl)，0.125μlrtaqdna聚合酶(5u/μl)，2.5μl10×pcrbuffer，2μldntp，20μlh2o。

反应在96孔梯度pcr仪上进行，反应程序为：94℃4min；30个循环：94℃30s，52℃30s，72℃1min；72℃3min。反应结束后，每个样品取5μl扩增产物与2μl6×loadingbuffer混匀，点样于含0.01％eb和1％琼脂糖的凝胶上，在200v电压的条件下电泳约30min，在jy04s-3e型凝胶成像系统中观察并记录结果。

(2)循环次数优化

利用步骤1的所有反应体系，将每一个反应体系的循环次数分别设置为15次、20次、22次、25次和30次，在96孔梯度pcr仪上进行pcr反应确定最佳循环次数。

(3)最佳dna聚合酶的确定

利用步骤(1)中的所有反应体系，将每一个反应体系中的rtaqdna聚合酶分别替换成extaqdna聚合酶与speedstar^tmhsdna聚合酶，在96孔梯度pcr仪上进行pcr反应确定最佳dna聚合酶类型。

反映程序1：extaqdna聚合酶：94℃4min；30个循环：94℃30s，52℃30s，72℃1min；72℃3min；

反映程序2：speedstar^tmhsdna聚合酶：94℃2min；30个循环：94℃5s，52℃15s，72℃10s；72℃2min。

(4)最佳模板量与模板限度

利用步骤(1)的所有反应体系，将每一个反应体系的模板量分别替换为1200ng、600ng、60ng、6ng和0.6ng，在96孔梯度pcr仪上进行pcr反应以确定最佳模板量与最小dna模板检测限度。

结果发现循环次数对夏天无的as-pcr鉴别影响最大，酶类型影响较小，而退火温度和模板量几乎没有影响。结果表明退火温度从42℃至60℃各引物均能检出正品条带，而伪品无条带检出，从42℃至50或52℃各引物对扩增条的带亮度逐渐增强，从50或52℃至60℃逐渐减弱(图2中a)，故选择引物对d2的最佳退火温度为50℃至52℃；当循环次数降低到20次时，引物对d2均能成功扩增出正品条带，而伪品均无条带(图2中b)，最佳循环次数均为20；所选的3种酶当中，rtaq酶、extaq酶和speedstar^tmhsdna聚合酶均能成功鉴别出正品，首选rtaq酶；当模板量为1200ng、600ng、60ng时，引物对d2均能成功扩增出正品条带，而伪品均无条带，当模板量为6ng、0.6ng时，d2扩增不出任何条带(图3)，所以引物对d2适合检测的模板量为大于或等于60ng，最低模板检测限度为60ng。

实施例5

鉴定引物对的特异性(snp分子标记的应用)

对来自67个居群的72株植物样本(表1)和14份药材样品(表2)分别使用引物对d2进行检测。

按照实施例4中得到的最佳反应条件，即最佳退火温度为52℃，最佳循环数为20次，以及dna聚合酶为rtaq酶。利用96孔梯度pcr仪对与上述试验个体不同样品的基因组dna模板，检验引物对d2对夏天无的鉴别特异性。

结果显示使用引物对d2对所有样品进行扩增，如图4所示，只有夏天无样品(表1中样品编号为c4和c286)出现目的条带，而其余13个近缘种均无条带产生。表明利用引物对d2能够实现对夏天无的as-pcr特异性鉴别，并且鉴别适应性强。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

sequencelisting

<110>安徽中医药大学

<120>鉴定夏天无的snp标记、等位基因特异性pcr法及应用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>840

<212>dna

<213>夏天无corydalisdecumbens(thunb.)pers.

<400>1

cataaaccaagtgggtggaaaaagcgaggatccattgattagcttatctggtgtcaccga60

ggtattttattttctattttcttcctatataccctgttttgactgtatcgtactatgtat120

catttgttaacccaataaaccctttgtttcaaagcgaatttcaaatggcggaattacaag180

gatatttcgaaatggatagatcgcagcaagaagacttcctctatccacttctttttcagg240

agtctctttatgcacttgctcatgattatggtttaaaaggatccagtctttacgaacccg300

tggaaaatttcggttatgacaataaatccagctcactgcttgtgaaacgtttaattactc360

gaatgtatcaacagaagtggttgattatttcgtctaatattttttcccccaaaaaaatgg420

attatcaaatggtttccgccggattttcagtcattttggaaatgaaattctcactgcgat480

tagtgtcttctcaagaagggaaagatctacaaaaatatcaaaatttacgatcaattcatt540

caacattttcctttttagaggataaattagcccatttaaataatgtgtcagatatactaa600

taccctaccccattcatctggaaatcttggttcaaaatctccgctcttggatccaagatg660

ccccttctttacatttattccgactctttctgcacgagtctcagaattgggttagtctga720

ttactcaaaaaaaatccatctctttttgttcaaaagagaatcaaagattcttcttgttcc780

tatataattttcatgtatgtgaatgggaatccctattcatgtttctccgtaaacaatctt840

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcggaattacaaggatattgc21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccaattctgagactcgtac20