一种从海参体腔液中制备主要卵黄蛋白的方法与流程

本发明属于食品加工
技术领域：
，涉及一种蛋白制备方法，更具体地说，涉及一种从海参体腔液中制备主要卵黄蛋白的方法。
背景技术：
：海参体腔液是海参加工过程中的副产物，作为废弃物丢弃后造成了资源浪费与环境污染。海参营养丰富，经济价值高，其体腔液中含有多种活性成分，但未被很好的利用，目前有关海参体腔液的研究局限在对其中有关免疫成分的研究，海参体腔液还富含丰富的主要卵黄蛋白，主要卵黄蛋白有很高的营养价值，富含丰富的必需氨基酸，如果能对海参体腔液中的主要卵黄蛋白进行回收利用，将会对海参的高值化利用有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于开发一种高效便捷的从海参体腔液中制备主要卵黄蛋白的方法，提高海参加工过程中副产物的利用率，避免资源浪费与环境污染；另外，根据海参体腔液蛋白质单一的特点，开发一种利用有机聚合物聚乙二醇从海参体腔液制备主要卵黄蛋白的方法，该方法具有条件温和、工艺简单、生产效率高等特点。为达到上述目的，本发明提供了一种从海参体腔液中制备主要卵黄蛋白的方法，包括如下步骤：s1、海参体腔液预处理：收集海参体腔液，离心取上清液，得体腔清液；优选方式下，步骤s1所述海参预处理的方法为：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，所述体腔液在4℃、1500～2000×g条件下离心10～15min，收集上清液，得体腔清液；所述离心预处理的目的在于去除海参体腔液中的不容物杂质，以保证蛋白质的沉淀效率。优选方式下，步骤s1所述离心具体为，在4℃，1500×g条件下离心15min。s2、透析法低温除盐：4℃条件下对步骤s1所得体腔清液进行透析除盐；优选方式下，步骤s2所述透析法低温除盐具体为：利用2～5kda的透析膜、10～30mmph7～8的磷酸盐缓冲溶液对步骤s1所得体腔清液进行透析处理48～72h，所述磷酸盐缓冲溶液的用量为体腔清液的10～20倍，控制整个除盐过程磷酸盐缓冲溶液温度在4℃；所述透析除盐的目的在于去除海参体腔清液中的盐离子，减少沉淀过程中盐离子对蛋白质的影响，提高目标蛋白的沉淀效率。优选方式下，步骤s2所述透析法低温除盐具体为：利用3.5kda的透析膜、20mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液对海参体腔清液进行透析除盐处理，控制整个除盐过程磷酸盐缓冲溶液温度在4℃。s3、提取主要卵黄蛋白：使用聚乙二醇提取主要卵黄蛋白；优选方式下，步骤s3所述提取主要卵黄蛋白的方法为：将聚乙二醇加入步骤s2所得透析除盐后的海参体腔清液，使聚乙二醇终浓度为10％～16％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph至7～8，4℃静置3～9h后7500～8500g离心10～20min，弃上清，沉淀为主要卵黄蛋白；所述聚乙二醇分子量为6000；s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶、过滤，得主要卵黄蛋白溶液；优选方式下，步骤s4所述复溶具体为：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀用10～30mmph7～8的磷酸盐缓冲溶液，以5～10ml/g的比例进行复溶，经过0.22～0.45μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液。s5、透析：将步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液使用去离子水进行透析；优选方式下，步骤s5所述透析具体为：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用3～4kda的透析膜、去离子水在4℃透析48h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的10～20倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物真空冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白。优选方式下，步骤s6所述真空冷冻干燥具体为：1～5pa，-25～-50℃，干燥48～72h。优选方式下，步骤s3所述聚乙二醇沉淀法其离心条件为4℃条件下，8000×g离心15～20分钟。优选方式下，所述从海参体腔液中制备主要卵黄蛋白的方法，包括如下步骤：s1、海参体腔液预处理：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，在4℃、1500×g条件下离心15min，收集上清液即体腔清液；s2、透析法低温除盐：利用5kda的透析膜、30mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液对步骤s1所得体腔清液进行透析除盐60h，所述磷酸盐缓冲液的用量为体腔清液的20倍，控制整个除盐过程磷酸盐缓冲溶液温度在4℃；s3、在4℃条件下，将分子量6000的聚乙二醇添加到步骤s2所得的海参体腔清液中，使聚乙二醇终浓度为16％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph为8，静置6h，7500g离心20min，所得沉淀为主要卵黄蛋白；s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀按5ml/g的比例用30mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液复溶，经过0.45μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液；s5、透析：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用3.5kda的透析膜、去离子水在4℃透析72h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的20倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物在1pa，-30℃条件下真空冷冻干燥48h即可得到主要卵黄蛋白。本发明的有益效果是：1、本发明以海参加工过程中的副产物海参体腔液为原料，提高了海参加工过程中副产物的利用率，使其蛋白资源得到充分开发利用，同时减少了海参副产物对环境的污染，所得主要卵黄蛋白可以作为功能基料添加于食品中，对海参体腔液主要卵黄蛋白的开发利用具有重要意义。2、本发明采用有机聚合物聚乙二醇进行蛋白沉淀，聚乙二醇是一种不带电荷的强亲水性的有机聚合物，可以使生物液体中蛋白质脱水而发生沉淀。与传统的蛋白沉淀法如硫酸铵盐析，乙醇沉淀、等电点沉淀等不易规模化生产的方法相比，聚乙二醇沉淀法操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。并且提取率高达70％，本发明方法简单，同时可以一次性处理大量样品，不需要复杂仪器辅助，适合大规模生产。3、本发明将海参体腔液离心去除沉淀，再使用透析的方法除盐，之后使用聚乙二醇提取蛋白并进行复溶和过滤，排除了细菌、细胞器等对蛋白制备率的影响。正是由于按照上述顺序对各工艺步骤进行组合，才保证了本发明制备的蛋白质的质量。附图说明图1为本发明所获得的主要卵黄蛋白电泳图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的具体实施方案进行较为详细的描述，下列实施例仅用于说明本发明，实施例中未注明的具体技术或条件，按照本领域内文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本发明实施过程中使用的所有试剂或仪器均可以通过市场常规购买得到。实施例1s1、海参体腔液预处理：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，在4℃、1500×g条件下离心15min，收集上清液，得体腔清液；s2、透析法低温除盐：利用2kda的透析膜、10mmph7的磷酸盐缓冲溶液在4℃对步骤s1所得体腔清液透析48h，所述磷酸盐缓冲液的用量为体腔清液的10倍；s3、提取主要卵黄蛋白：在4℃条件下，将分子量6000的聚乙二醇添加到步骤s2所得的海参体腔清液中，使聚乙二醇终浓度为10％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph为7.0，静置3h，7500g离心10min，所得沉淀为主要卵黄蛋白；s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀按5ml/g的比例用10mmph7.0的磷酸盐缓冲溶液复溶，经过0.22μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液；s5、透析：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用3.0kda的透析膜、去离子水在4℃透析48h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的10倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物在1pa，-50℃条件下真空冷冻干燥72h即可得到主要卵黄蛋白。本方法所得蛋白制备率为：67.62％其中，蛋白制备率的计算方法为：使用bradford法分别测定步骤s2所得透析后的体腔清液的蛋白浓度a1及步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液中的蛋白浓度a2，蛋白制备率＝(a2×步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液体积)÷(a1×透析后体腔清液体积)实施例2s1、海参体腔液预处理：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，在4℃、2000×g条件下离心10min，收集上清液，得体腔清液；s2、透析法低温除盐：利用3.5kda的透析膜、20mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液在4℃对步骤s1所得体腔清液进行透析60h，所述磷酸盐缓冲液的用量为体腔清液的15倍；s3、提取主要卵黄蛋白：在4℃条件下，将分子量6000的聚乙二醇添加到步骤s2所得的海参体腔清液中，使聚乙二醇终浓度为12％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph为7.5，静置6h，8000g离心20min，所得沉淀为主要卵黄蛋白；s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀按8ml/g的比例用10mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液复溶，经过0.45μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液。s5、透析：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用3.5kda的透析膜、去离子水在4℃透析48h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的15倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物在2pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h即可得到主要卵黄蛋白本方法所得蛋白制备率为：70.51％其中，蛋白制备率的计算方法为：使用bradford法分别测定步骤s2所得海参体腔清液的蛋白浓度a1及主要卵黄蛋白溶液中的蛋白浓度a2，蛋白制备率＝(a2×步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液体积)÷(a1×透析后体腔清液体积)实施例3s1、海参体腔液预处理：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，在4℃、1800×g条件下离心12min，收集上清液，得体腔清液；s2、透析法低温除盐：利用4kda的透析膜、25mmph8的磷酸盐缓冲溶液对步骤s1所得体腔清液液进行透析72h，所述磷酸盐缓冲液的用量为体腔清液的20倍，控制整个除盐过程磷酸盐缓冲溶液温度在4℃；s3、提取主要卵黄蛋白：在4℃条件下，将分子量6000的聚乙二醇添加到步骤s2所得的海参体腔清液中，使聚乙二醇终浓度为14％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph为8，静置9h，8500g离心15min，所得沉淀为主要卵黄蛋白s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀按10ml/g的比例用20mmph8.0的磷酸盐缓冲溶液复溶，经过0.45μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液。s5、透析：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用4.0kda的透析膜、去离子水在4℃透析48h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的20倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物在5pa，-50℃条件下真空冷冻干燥48h即可得到主要卵黄蛋白本方法所得蛋白制备率为：71.31％其中，蛋白制备率的计算方法为：使用bradford法分别测定步骤s2所得海参体腔清液的蛋白浓度a1及主要卵黄蛋白溶液中的蛋白浓度a2，蛋白制备率＝(a2×步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液体积)÷(a1×透析后体腔清液体积)实施例4s1、海参体腔液预处理：利用滤纸吸干新鲜仿刺参表面的液体，将海参从腹部切开，收集体腔液，在4℃、1500×g条件下离心15min，收集上清液，得体腔清液；s2、透析法低温除盐：利用5kda的透析膜、30mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液对步骤s1所得体腔清液进行透析除盐60h，所述磷酸盐缓冲液的用量为体腔清液的20倍，控制整个除盐过程磷酸盐缓冲溶液温度在4℃；s3、提取主要卵黄蛋白：在4℃条件下，将分子量6000的聚乙二醇添加到步骤s2所得的海参体腔清液中，使聚乙二醇终浓度为16％(重量)，使用0.5mol/l的naoh溶液或0.5mol/l的盐酸溶液调整反应体系ph为8，静置6h，7500g离心20min，所得沉淀为主要卵黄蛋白s4、复溶：将步骤s3所得的主要卵黄蛋白沉淀按5ml/g的比例用30mmph7.4的磷酸盐缓冲溶液复溶，经过0.45μm微孔滤膜过滤，得主要卵黄蛋白溶液。s5、透析：将步骤s4所得的主要卵黄蛋白溶液利用3.5kda的透析膜、去离子水在4℃透析72h，所述去离子水的用量为主要卵黄蛋白溶液的20倍；s6、干燥、将步骤s5中所得产物在1pa，-30℃条件下真空冷冻干燥48h即可得到主要卵黄蛋白本方法所得蛋白制备率为：72.71％其中，蛋白制备率的计算方法为：使用bradford法分别测定步骤s2所得海参体腔清液的蛋白浓度a1及主要卵黄蛋白溶液中的蛋白浓度a2，蛋白制备率＝(a2×步骤s4所得主要卵黄蛋白溶液体积)÷(a1×透析后体腔清液体积)本发明制备的主要卵黄蛋白电泳图如图1所示，其中s为海参体腔液，sp为本发明制备的主要卵黄蛋白，hm为高分子量蛋白maker，lm为低分子量蛋白maker；本发明制备的主要卵黄蛋白质谱结果如表1所示，本发明制备的蛋白有91.5％的是主要卵黄蛋白。表1主要卵黄蛋白质谱鉴定结果序号分子量(da)名称相关性1155309.03主要卵黄蛋白91.5％293652.04假定蛋白质cnbb11301.1％3636565.69mdn1,midasin同族体蛋白(iss)2.0％4189890.55假定蛋白质triatdraft_1812691.3％5170105.73预测:类sacsin蛋白4.2％以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12