高粱抗逆性相关基因SbERECTA及其编码蛋白与应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个高粱抗逆性相关基因sberecta、其编码蛋白及其在植物抗逆中的应用。

背景技术：

高粱(sorghumbiocolorl.moench)是畜牧业一种很好的饲草来源，既可做牧草放牧，又可刈割做青饲、青贮和干草。近年来，由于过度放牧，土壤风蚀、水蚀、盐碱化加重，以天然草地为主的草原畜牧业已没有优势可言。发展饲用高粱，对缓解由于畜多草少而造成的草原生态环境失衡具有重要意义。我国主栽高粱品种遗传资源丰富，主要性状(生物产量、籽粒产量等)变异幅度大，挖掘和鉴定高粱关键功能基因，对培育生物产量高、抗逆性强的饲用高粱新品种，解决土地资源贫瘠地区农业发展、畜牧业养殖、生物新能源开发等具有重要意义。

作物抗逆的机制是多基因参与的协同防御反应，包括外界逆境信号感知和传递机制、逆境胁迫的分子响应机制等。逆境会影响作物的各种生理生化过程，如抑制光合作用、改变细胞膜稳定性、改变激素和次级代谢物合成，甚至导致植株死亡。因此，研究高粱抗逆的功能基因，对于增加高粱的光合效率，提高高粱的生物学产量具有重要意义。

erecta基因可以调控拟南芥的气孔发育，影响植株的蒸腾效率和光合效率，增加植株的耐热性，是一个重要的功能基因。erecta蛋白是一个类受体激酶，主要参与调控植物的细胞分裂和组织发育。在拟南芥中过量表达erecta基因后，叶片气孔密度降低，叶面积增大，水分利用效率(wue)提高，株高增加，生物量显著增加，进一步研究发现erecta基因参与植物器官建成、细胞膨大和细胞间相关联系。另外，erecta基因能影响二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)的羧化速率和光电子转移能力，调节植物的光合作用，从杨树中克隆的pderecta基因转入拟南芥，拟南芥气孔密度降低，蒸腾效率增加，光合速率提高，生物量增加。erecta基因还参与了调控植物的抗病性，增强植株耐热性，如对稻瘟病产生非寄主性的抗性，过量表达显著提高番茄和水稻的耐热性和生物量。因此，erecta基因不仅参与调控气孔密度，影响植物的光合作用和生物量，又参与调控植物的抗病性和耐热性，是一个多功能基因。然而，迄今为止，尚未见到饲草作物，如高粱、高丹草等有关该基因的报道。为了深入剖析高粱sberecta(sber)基因功能，本研究对sber基因进行分离和初步的功能验证。

技术实现要素：

本发明提供一种高粱抗逆性相关sberecta蛋白。

其为：1)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(由982个aa组成)；或2)在seqidno.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明的另一目的是提供编码上述高粱抗逆性相关sberecta蛋白的sberecta基因。

sberecta基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列(由3210个核苷酸组成)。本发明的高粱抗逆性相关sberecta基因是从高粱中克隆到的一个基因。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

因此，本发明的高粱抗逆性相关sberecta蛋白还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有高粱抗逆性相关sberecta蛋白同等活性的由高粱抗逆性相关sberecta蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的另一个目的是提供携带sberecta基因的植物表达载体，所述的植物表达载体为prres14-gsber。

本发明的sberecta基因，它编码的蛋白序列与玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、二穗短柄草、拟南芥等的氨基酸序列之间的相似性相似度在80％以上，lrr区氨基酸序列非常保守；中部约570位到600位的氨基酸位点是该蛋白的跨膜区域，与其他物种的氨基酸序列差异较大，推测不同物种rlks的跨膜区功能差异性较大；3’末端约268个氨基酸是亮氨酸/苏氨酸的激酶区域，序列非常保守，包括典型的甘氨酸(g)、赖氨酸(k)和天冬氨酸(d)，这些结构域与细胞分裂和增值、细胞凋亡和分化都有重要关系。这些结果暗示sberecta对于调控高粱生长发育具有关键作用。在高粱不同组织器官中，sberecta基因的表达量差异很大：在花梗组织中，sberecta基因表达量非常高；在幼穗中，sberecta基因表达量较高，但在幼茎、叶鞘和子房中，sberecta基因表达量明显降低，而在幼叶、花药和种子中，目的基因表达量较低，在根中几乎检测不到sberecta基因的表达。这些结果说明sberecta基因在未成熟的组织器官中具有较大的转录量，且在地上快速分化发育的幼嫩组织中，转录量极为丰富，暗示sberecta在高粱幼苗发育的早期就参与了植株的发育和形态构建成。在aba、brs、ga3和iaa处理下，高粱内源基因sbactin的相对表达量很稳定，变化不明显，而目标基因sberecta相对表达量较大，在不同处理时间段内表达差异水平达到极显著，且随着激素处理时间的延长，sberecta基因表达量呈现先增加后降低的趋势。

本发明将sberecta基因构建到表达载体pmd18-t上，获得到prres14-gsber过表达载体，并在大肠杆菌中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将prres14-gsber携带的sberecta基因转入模式植物拟南芥中，获得拟南芥转化植株。结果表明，sberecta早期就参与了植株的发育和形态构建成，具有提高转基因拟南芥的耐高温特性的作用。

本发明还提供含有sberecta核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明的另一个目的是提供sberecta基因及其编码蛋白sberecta在提高植物抗逆性，尤其是耐高温特性中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)提供了高粱sberecta基因及其编码蛋白sberecta；

(2)通过在植物中过表达sberecta基因提高植物抗逆性，尤其耐高温特性。

因此，sberecta基因及其编码的蛋白可以提高植物抗逆性，尤其耐高温特性。

附图说明

图1为本发明实施例1中高粱抗逆性相关基因sberecta的prres14-gsber重组载体结构示意图。

图2为本发明sberecta基因cdna和氨基酸序列分析示意图。

图3为高粱抗逆性相关基因sberecta保守区的结构域示意图。其中，lrrnt为亮氨酸富集区的n端；lrrdomain为亮氨酸串联区；transmembranedomain为跨膜区；s_tkc为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，催化区域；np_bind为atp结合位点(富含赖氨酸残基)；act_site为质子接受位点(富含天冬氨酸残基)。

图4为sberecta基因的cdna和gdna序列分析示意图。

图5为sberecta氨基酸序列比对。其中，黑色直线将sberecta亮氨酸串联区和丝氨酸/苏氨酸激酶区分割开来。十字信号表示sberecta与其他物种rlks家族高度保守的氨基酸序列；箭头表示sberecta激酶区典型的氨基酸。每一个比对物种缩写号如下：taer＝小麦；hv＝大麦；bd＝二穗短柄草；sber＝高粱；zm＝玉米；os＝水稻；rc＝蓖麻；vv＝葡萄；gm＝大豆；at＝拟南芥；mt＝苜蓿；cs＝黄瓜；pt＝杨树；sm＝卷柏；pp＝苔藓。

图6为高粱抗逆性相关基因sberecta组织特异性表达柱状图。

图7为高粱抗逆性相关基因sberecta在外源激素下的表达模式线条图。

图8为转sberecta基因的拟南芥幼苗高温处理后4个时间段的植株照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：高粱抗逆性相关基因sberecta的提取

1、实验材料

2016年4月，在安徽科技学院种植园播种高粱品种tx623b(已知高粱品种，可从育种单位购买)。在苗期取幼根、幼茎、幼叶和叶鞘样品，在开花初期取幼穗、花梗、花药和子房样品，在成熟期取种子样品，均在液氮中速冻，-80℃冰箱中保存备用，用以分析sberecta基因在高粱不同组织中的表达特性，并分离sberecta基因。

同时，高粱tx623b种子播种土壤中(营养土：蛭石＝2:1)，在光照培养箱培养。培养箱环境温度26℃，湿度50％-70％，白天光照16h，夜间光照8h，光强525μmol.s^-1.m^-2。10d以后，将幼苗从土壤中轻轻带土取出，清水冲洗干净，不要破坏根系，用滤纸清理水分后，立刻分别置于aba(100μm/l)，brs(0.75μm/l)，ga3(30mm/l)和iaa(10μm/l)溶液中培养，对照组利用清水处理。处理时间段为0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h和60h后，对照组和处理组分别取样，取样时将植株的根、茎和叶混合，每个样品取三株，作为生物学重复，液氮速冻，-80℃保存备用，分析sberecta基因在四种外源激素下的表达模式。

2、实验方法

2.1高粱rna的提取和cdna的合成

(1)rna提取(酚-氯仿-异戊醇法)

①液氮研磨植物组织，加入rna提取液，振荡器充分震荡；

②加入0.5ml的氯仿/异戊醇(24:1)，继续涡旋30sec，4℃离心5min；

③上层水相转移到另一个新的2.0ml的离心管中，加入同等体积(约1ml)的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋30s，4℃离心5min；

④上层水相转移到一个新的2.0ml的离心管中，微加入同等体积的的licl(4m)，混匀后在冰箱里4℃温育过夜；

⑤4℃离心20min，弃掉上清，加入1ml70％的酒精，漂洗沉淀，在通风橱充分晾干后，去除样品中dna杂质；

⑥加入一样体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)涡旋混匀，离心5min；上清转移至新的离心管中；

⑦加入一样体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混匀，离心5min；上清转移至新的离心管中；

⑧加入2.5体积的无水乙醇和1/10体积的naoac溶液(3mph＝5.2)，-80℃下1小时；

⑨4℃离心20min，弃掉上清，1ml70％的酒精漂洗沉淀，弃上清，在通风橱充分晾干，加入20μlh2odepc溶解；

⑩nanodrop测定rna浓度，取1μgrna样品，琼脂糖电泳检测，保存rna样品在-80℃冰箱中备用。

(2)cdna的合成和检测

取5μg的总rna，利用(oligodt)12-18引物，合成的cdna原样，合成步骤参照takara公司的primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒(6120a)说明书。合成的cdna样品用depc水稀释5倍后分装，-20℃冰箱保存。

2.2sberecta分离和序列分析

(1)sberecta序列分析

参照ncbi公布的小麦的taerecta序列(genebankaccessionjq599261.2)，在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)数据库中比对分析，获得高粱的sberecta基因的cdna序列和gdna序列。sberecta家族氨基酸翻译位点采用geneious6.0.5软件推测，sberecta家族的功能结构域分析采用conserveddomainsearch(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)和smart(http://smart.embl-heidelberg.de)数据库等进行。

(2)sberecta基因组织特异性表达和外源激素下的表达模式

利用采用实施定量(qrt-pcr)检测sberecta基因组织特异性表达和外源激素下的表达模式，目标基因sberecta的引物为sberectaq-f：gccagccgtgccaagctacatc(seqidno.3)和sberectaq-r：ctccctgcatccttcaactccc(seqidno.4)。内参基因sbactin的引物为sbactin-f：acggcctggatggcgacgtacatg(seqidno.5)和sbactin-r：gcagaaggacgcctacgttggtgac(seqidno.6)。利用abi7300(appliedbiosystems,usa)进行qrt-pcr分析，每个样品三次技术重复，反应体系为20μl，包括10μl2×sybrmix；0.3μl上游引物(10μm)；0.3μl下游游引物(10μm)；2μl(50ng)稀释的cdna模板,ddh2o补足20μl。反应程序为：95℃20s；95℃5s，61℃30s，40个循环。qrt-pcr数据分析参见以下公式(1)：

公式中ex是目的基因引物的扩增效率，er看家基因引物的扩增效率，ct,x和ct,r分别为目的基因和看家基因在pcr反应过程中收集的ct值。如果有多个看家基因，则公式分母为多个看家基因计算数值的几何平均数(ramakersetal.2003；olsenetal.2012；rieuandpowers2009)。sberecta基因表达量的差异显著性分析利用spss19.0软件(ibmspssstatistics,usa)。

(3)sberecta基因全长cdna和gdna序列的分离

1)基因扩增

参照phytozome数据库中sberecta的序列设计引物，cdna序列分离引物分别为sbercdna-f：gcgagaacccacgaaaccaacc(seqidno.7)和sbercdna-rf：cccatgattccaacacggcaaa(seqidno.8)；

gdna序列较大，采用分段扩增，中间设有一段重叠的区域，然后酶切连接在一起，引物分别为sbergdna-1f：atgcctgtccgcagctcagtggcc(seqidno.9)和sbergdna-1r：ggtggtatcgacccagttaacttattg(seqidno.10)；sbergdna-2f：caataagttaactgggtcgataccacc(seqidno.11)和sbergdna-2r：ccccagacctctctctcttccctac(seqidno.12)；利用高保真酶(kodfx-101，toyobo)，以高粱tx623b的花梗组织cdna和dna为模板，进行pcr扩增，cdna序列长度为3376bp，gdna序列长度为7276bp，反应程序：94℃2min，35cycles(98℃10s，55℃30s，68℃1mim/kb)，72℃10min，4℃保存。目的片段pcr产物的纯化按照百泰克试剂盒(dp1711)的说明进行。

2)连接转化

①如果纯化后的pcr产物为平末端，则需要在产物末端加上ploya尾巴，方便后续ta克隆连接，反应体系10μl：pcr产物6μl，taqbuffer2μl，taqpolymerase1μl，datp(10mm)0.2μl，ddh2o0.8μl，室温或者37℃反应30min后，70℃继续30min终止反应；

②将上述的pcr产物连接到克隆载体pmd18-t(6011，takara)上，反应体系为12μl，pcr产物6μl(适当调整)，pmd18-tcloningvector1μl，solutioni溶液5μl；

③轻轻混匀，16℃连接30min，反应结束，将离心管置于冰上；

④加连接产物转入50μltop10感受态细胞中(提前在冰上慢慢解冻)；

⑤42℃热激40s，立即置于冰上2min；

⑥加入150μl液体lb(无抗生素)，200rpm，37℃孵育1h；

⑦将转化的菌液均匀的涂在lb平板上(含有100μg/mlamp+，并附加有40μl20mg/ml的x-gal和60μl200mg/ml的iptg)；

⑧挑取白色克隆，摇菌备用。

3)酶切鉴定，测序

分别吸取50μl菌液，于5mllb液体培养基(含有终浓度100μg/mlamp+)中培养12-16h，按照质粒提取说明书(9760，takara)提取质粒，双酶切鉴定，片段大小正确，送样测序分析，测序正确，sberecta基因全长cdna和gdna序列片段分离成功。

4)超表达载体构建和拟南芥的转化

分段将sberecta基因gdna序列插入过表达载体(含有ubi组成型启动子)，获得到prres14-gsber过表达载体(具体结构见图1)。结合载体的多克隆位点，利用限制酶ncoi和noti酶切第一片段gsber-1的质粒，限制酶ncoi酶切第二片段gsber-2的质粒，均回收酶切产物。酶切反应体系20μl：noti1μl，10×bufferh2μl，0.1％bsa2μl，0.1％x-1002μl，质粒dna≤1μg，ddh2o补齐到20μl；ncoi1μl，10×bufferk2μl，0.1％bsa2μl，质粒dna≤1μg，ddh2o补齐到20μl。酶切反应4h后，纯化回收酶切产物。获得sberecta基因gdna序列两部分产物gsber-1和gsber-2片段。

利用限制酶ncoi和noti酶切过表达载体prres14，然后将上面回收的gsber-1片段插入线性载体prres14，连接反应体系15μl：5×ligasereactionbuffer3μl，载体dna1.5μl，片段dna6μl，t4dnaligase(1units)1.5μl，ddh2o3μl，4℃过夜连接。测序分析，获得prres14-gsber-1重组载体。

利用限制酶ncoi酶切prres14-gsber-1重组载体，然后将上面回收的gsber-2片段插入线性载体prres14.101-gsber-1，连接体系如上。测序分析，ncoi和noti双酶切鉴定，获得prres14-gsber过表达重组载体。

提取prres14-gsber质粒，转化农杆菌，然后利用农杆菌侵染拟南芥(哥伦比亚0型)的花絮，获得sberecta过表达转基因拟南芥种子，连续筛选种植三代，获得t3带转基因拟南芥种子，备用。

5)转基因拟南芥高温处理

将t3代的转基因拟南芥和野生型拟南芥种子分别播种在空ms培养基上，组培室生长10d后，选取根长等长的转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗分别移栽到土壤(营养土：蛭石＝2:1)中，在光照培养箱培养，培养箱环境温度26℃，湿度50％-70％，白天光照16h，夜间光照8h，光强525μmol.s-1.m-2。5天后，42℃高温处理不同的时间段，后放置培养箱继续培养10d，观察统计幼苗的复活情况。

实施例2：高粱抗逆性相关基因sberecta的cdna序列分析及其编码蛋白的氨基酸序列分析

1、cdna序列和氨基氨酸分析

本发明sberecta基因cdna和氨基酸序列分析示意图见图2，sberecta基因cdna序列含有2949bp开放的阅读框，编码983氨基酸，预测蛋白分子量106kda，等电点(pi)为6.21。进一步分析其编码的蛋白发现，sberecta属于典型的类受体激酶家族(rlks)，n端是亮氨酸串联的富集区域，接受胞外信号转导，中间是疏水结构，是跨膜区，c端是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区。高粱抗逆性相关基因sberecta保守区的结构域示意图见图3，其中，lrrnt为亮氨酸富集区的n端；lrrdomain为亮氨酸串联区；transmembranedomain为跨膜区；s_tkc为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，催化区域；np_bind为atp结合位点(富含赖氨酸残基)；act_site为质子接受位点(富含天冬氨酸残基。sberecta基因gdna序列含有7076bp。

2、选择性剪切的特点分析

sberecta基因的cdna和gdna序列分析示意图见图4，比对sberecta基因cdna序列和gdna序列之后，发现sberecta的gdna序列具有27个外显子，26个内含子。然而，sberecta的cdna序列存在不同的内含子和外显子剪切体形式。深入分析表明，sberecta在gdna序列4127-4497bp区间内存在三种cdna序列的剪切体形式：①sb-cdna1，长度为3110，27个外显子，含有两个内含子；②sb-cdna2，长度为2880bp，26个外显子，无内含子；③sb-cdna3，长度2949，27个外显子，无内含子。

3、sberecta家族氨基酸序列结构分析

在phytozomev9.0数据库中，以高粱sberecta氨基酸序列为探针进行比对，下载玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、二穗短柄草、拟南芥等相似度在80％以上的rlks家族氨基酸，具体氨基酸序列比对图见图5，其中，黑色直线将sberecta亮氨酸串联区和丝氨酸/苏氨酸激酶区分割开来。十字信号表示sberecta与其他物种rlks家族高度保守的氨基酸序列；箭头表示sberecta激酶区典型的氨基酸。每一个比对物种缩写号如下：taer＝小麦；hv＝大麦；bd＝二穗短柄草；sber＝高粱；zm＝玉米；os＝水稻；rc＝蓖麻；vv＝葡萄；gm＝大豆；at＝拟南芥；mt＝苜蓿；cs＝黄瓜；pt＝杨树；sm＝卷柏；pp＝苔藓。多序列比对预测：sberecta与其他物种一样，lrr区氨基酸序列非常保守；中部约570位到600位的氨基酸位点是该蛋白的跨膜区域，与其他物种的氨基酸序列差异较大，推测不同物种rlks的跨膜区功能差异性较大；3’末端约268个氨基酸是亮氨酸/苏氨酸的激酶区域，序列非常保守，包括典型的甘氨酸(g)、赖氨酸(k)和天冬氨酸(d)，这些结构域与细胞分裂和增值、细胞凋亡和分化都有重要关系。这些结果暗示sberecta对于调控高粱生长发育具有关键作用。

实施例3：sberecta基因组织特异性表达

在各个发育时期，收集高粱不同组织器官材料，利用sbactin内参基因作为参照，研究sberecta基因在不同高粱组织中相对表达情况，特异性表达柱状图见图6。结果发现，在高粱不同组织器官中，sberecta基因的表达量差异很大：在花梗组织中，sberecta基因表达量非常高；在幼穗中，sberecta基因表达量较高，但在幼茎、叶鞘和子房中，sberecta基因表达量明显降低，而在幼叶、花药和种子中，目的基因表达量较低，在根中几乎检测不到sberecta基因的表达。这些结果说明sberecta基因在未成熟的组织器官中具有较大的转录量，且在地上快速分化发育的幼嫩组织中，转录量极为丰富，暗示sberecta在高粱幼苗发育的早期就参与了植株的发育和形态构建成。

实施例4：sberecta在外源激素下的表达模式

在aba、brs、ga3和iaa处理下，高粱内源基因sbactin的相对表达量很稳定，变化不明显，而目标基因sberecta相对表达量较大，在不同处理时间段内表达差异水平达到极显著，且随着激素处理时间的延长，高粱抗逆性相关基因sberecta在外源激素下的表达模式线条图见图7，sberecta基因表达量呈现先增加后降低的趋势。

实施例5：sberecta超表达拟南芥株系耐高温特性鉴定

转sberecta基因的拟南芥幼苗分别在42℃高温下处理4h、8h、12h和15h四个时间段。结果显示(图8)，在高温4h后，转基因株系和野生型株系存活率都为60％；在高温8h和12h后，转基因株系和野生型株系的存活率分别都为40％和20％；在高温15h后，转基因株系和野生型株系存活率也分别为40％和20％，说明在高温胁迫下，超表达sberecta基因的拟南芥幼苗具有很强的生命力，在一定程度上可以抵抗高温带来的伤害，而野生型拟南芥不具有这种能力，初步证明sberecta基因的过表达可以提高转基因拟南芥的耐高温特性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>安徽科技学院

<120>高粱抗逆性相关基因sberecta及其编码蛋白与应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>982

<212>prt

<213>高粱(sorghumbicolor)

<400>1

metprovalargserservalalametthrthrthralaalaargala

151015

leuvalalaleuleuleuvalalavalalavalalaaspaspglyala

202530

thrleuvalgluilelyslysserpheargasnvalglyasnvalleu

354045

tyrasptrpalaglyaspasptyrcyssertrpargglyvalleucys

505560

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