本发明涉及大豆多肽技术领域，具体涉及一种大豆多肽的修饰方法。
背景技术：
蛋白酶水解主要是催化蛋白质的肽键在不同的地方断裂，酶解得到的多肽序列本质上主要是原料蛋白质的氨基酸序列的部分肽片段，其氨基酸序列结构必然会受到原料蛋白质一级结构的限制，同时也会受到蛋白酶酶切位点的限制，对酶解产物进行修饰是改善其生物活性的重要途径。
蛋白质酶解产物的修饰主要是利用生物-化学方法，使酶解物中的氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起多肽分子空间结构和组成的改变，导致其生物化学性质发生变化，从而获得较好的功能特性、营养特性及生物活性。目前，多肽的修饰主要有内切蛋白酶催化的plastein反应、美拉德反应、矿质元素螯合及氧化修饰等方法。目前用于催化修饰蛋白质酶解产物的主要是内切蛋白酶，如中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。
技术实现要素：
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供了一种可改善大豆多肽的苦味和抗氧化活性的大豆多肽的修饰方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大豆多肽的修饰方法，包括如下步骤：步骤一、将大豆分离蛋白与蒸馏水按料液比1g：10～15ml混匀得到大豆分离蛋白浆液，调节所述大豆分离蛋白浆液的ph至8～9，并加入碱性蛋白酶进行酶解，待酶解反应结束灭酶，待灭酶结束后静置冷却，经离心后取上清液；步骤二、将所述上清液进行超滤处理，收集透过液，再将所述透过液进行干燥处理，即得大豆多肽；步骤三、将所述大豆多肽与蒸馏水、无水乙醇按比例混匀制得大豆多肽混合液；步骤四、向所述大豆多肽混合液中加入一定量的游离氨基酸制得大豆多肽浆液，调节所述大豆多肽浆液的ph至8～9，并加入氨肽酶进行催化修饰反应，待修饰反应结束后灭酶，待灭酶结束后静置冷却，经离心后取上层清液；步骤五、再对所述上层清液进行离心喷雾干燥处理，即得修饰后的大豆多肽。
优选的，所述步骤一中所述碱性蛋白酶的加酶量为大豆分离蛋白用量的1.0g/100g，酶解反应温度为50～60℃，酶解反应时间为18～24小时。
优选的，所述步骤二中超滤处理的条件为：超滤膜的截留分子量为5kda，超滤压力为0.1～0.4mpa。
优选的，所述步骤二中所述大豆多肽的水解度为8～20%。
优选的，所述步骤三中所述大豆多肽混合液由如下重量百分比的组分组成：大豆多肽占30～50%、无水乙醇占0～50%、蒸馏水占10～70%，上述组分的百分比之和为100%。
优选的，所述步骤三中所述大豆多肽混合液由如下重量百分比的组分组成：大豆多肽占40%、无水乙醇占40%、蒸馏水占20%。
优选的，所述步骤四中向所述大豆多肽混合液中加入0～1.0mol/mol游离氨基的游离氨基酸制得大豆多肽浆液。
优选的，所述游离氨基酸为酪氨酸或色氨酸，所述氨肽酶为肽酶r。
优选的，所述步骤四中所述氨肽酶的加酶量为大豆多肽用量的1.0～3.0g/100g，修饰反应温度为25℃～40℃，修饰反应时间为4～8小时。
优选的，所述步骤五中离心喷雾干燥处理条件为：进口温度为180～220℃，出口温度为80～90℃，喷雾盘直径为100～120mm，水份蒸发量为40～50kg/h，电加热功率为60～70kw。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明提供的大豆多肽的修饰方法，通过在催化修饰反应中加入无水乙醇，可有效促进氨肽酶的催化反应，降低修饰后的大豆多肽的苦味；通过在催化修饰反应中加入一定量的游离氨基酸，可显著提高修饰后的大豆多肽的抗氧化活性；该大豆多肽的修饰方法，反应条件温和、过程安全可控，且可促进大豆多肽在食品配料及保健食品基料中的广泛应用。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种大豆多肽的修饰方法，包括如下步骤：
步骤一、将大豆分离蛋白与蒸馏水按料液比1g：10～15ml混匀得到大豆分离蛋白浆液，调节所述大豆分离蛋白浆液的ph至8～9，并加入碱性蛋白酶进行酶解，所述碱性蛋白酶的加酶量为大豆分离蛋白用量的1.0g/100g，酶解反应温度为50～60℃，酶解反应时间为18～24小时，待酶解反应结束将其加热至95～100℃灭酶10～20分钟，待灭酶结束后静置冷却25～35分钟，经离心后取上清液；
步骤二、将所述上清液进行超滤处理，超滤膜的截留分子量为5kda，超滤压力为0.1～0.4mpa，收集透过液，再将所述透过液进行干燥处理，即得大豆多肽，所述大豆多肽的水解度为8～20%；
步骤三、将所述大豆多肽与蒸馏水、无水乙醇按比例混匀制得大豆多肽混合液，所述大豆多肽混合液由如下重量百分比的组分组成：大豆多肽占30～50%、无水乙醇占0～50%、蒸馏水占10～70%，上述组分的百分比之和为100%；
步骤四、向所述大豆多肽混合液中加入0～1.0mol/mol游离氨基的游离氨基酸（所述游离氨基酸为酪氨酸或色氨酸）制得大豆多肽浆液，调节所述大豆多肽浆液的ph至8～9，并加入氨肽酶（所述氨肽酶为肽酶r）进行催化修饰反应，所述氨肽酶的加酶量为大豆多肽用量的1.0～3.0g/100g，修饰反应温度为25℃～40℃，修饰反应时间为4～8小时，待修饰反应结束后将其加热至95～100℃灭酶10～20分钟，待灭酶结束后静置冷却25～35分钟，经离心后取上层清液；
步骤五、再对所述上层清液进行离心喷雾干燥处理，离心喷雾干燥处理条件为：进口温度为180～220℃，出口温度为80～90℃，喷雾盘直径为100～120mm，水份蒸发量为40～50kg/h，电加热功率为60～70kw，即得修饰后的大豆多肽。
实施例
将大豆分离蛋白与蒸馏水按料液比1g：12.5ml混匀得到大豆分离蛋白浆液，调节所述大豆分离蛋白浆液的ph至8，并加入碱性蛋白酶进行酶解，所述碱性蛋白酶的加酶量为大豆分离蛋白用量的1.0g/100g，酶解反应温度为55℃，酶解反应时间为20小时，待酶解反应结束将其加热至100℃灭酶15分钟，待灭酶结束后静置冷却30分钟，经离心后取上清液；将所述上清液进行超滤处理，超滤膜的截留分子量为5kda，超滤压力为0.25mpa，收集透过液，再将所述透过液进行干燥处理，即得大豆多肽（记为sphs）；将所述大豆多肽与蒸馏水、无水乙醇按比例混匀制得大豆多肽混合液，所述大豆多肽混合液由如下重量百分比的组分组成：大豆多肽占40%、无水乙醇占40%、蒸馏水占20%；
（1）向所述大豆多肽混合液中不添加游离氨基酸制得大豆多肽浆液，调节所述大豆多肽浆液的ph至8，并加入氨肽酶（所述氨肽酶为肽酶r）进行催化修饰反应，所述氨肽酶的加酶量为大豆多肽用量的2.0g/100g，修饰反应温度为40℃，修饰反应时间为6小时，待修饰反应结束后将其加热至100℃灭酶15分钟，待灭酶结束后静置冷却30分钟，经离心后取上层清液；再对所述上层清液进行离心喷雾干燥处理，即得不添加游离氨基酸修饰后的大豆多肽（记为msphs）；
（2）向所述大豆多肽混合液中加入0.5mol/mol游离氨基的酪氨酸（tyr）制得大豆多肽浆液，调节所述大豆多肽浆液的ph至8，并加入氨肽酶（所述氨肽酶为肽酶r）进行催化修饰反应，所述氨肽酶的加酶量为大豆多肽用量的2.0g/100g，修饰反应温度为40℃，修饰反应时间为6小时，待修饰反应结束后将其加热至100℃灭酶15分钟，待灭酶结束后静置冷却30分钟，经离心后取上层清液；再对所述上层清液进行离心喷雾干燥处理，即得添加了酪氨酸（tyr）修饰后的大豆多肽（记为tyr-msphs）；
（3）向所述大豆多肽混合液中加入0.5mol/mol游离氨基的色氨酸（typ）制得大豆多肽浆液，调节所述大豆多肽浆液的ph至8，并加入氨肽酶（所述氨肽酶为肽酶r）进行催化修饰反应，所述氨肽酶的加酶量为大豆多肽用量的2.0g/100g，修饰反应温度为40℃，修饰反应时间为6小时，待修饰反应结束后将其加热至100℃灭酶15分钟，待灭酶结束后静置冷却30分钟，经离心后取上层清液；再对所述上层清液进行离心喷雾干燥处理，即得添加了色氨酸（typ）修饰后的大豆多肽（记为typ-msphs）。
一、实施例试验指标分析
上述实施例中大豆多肽sphs、不添加游离氨基酸修饰后的大豆多肽（msphs）、添加了酪氨酸（tyr）修饰后的大豆多肽（tyr-msphs）、添加了色氨酸（typ）修饰后的大豆多肽（typ-msphs）的苦味评价、abts自由基清除能力、氧自由基清除能力（orac）如下表所示：
由上表可知，不添加游离氨基酸或添加了酪氨酸（tyr）/色氨酸（typ），氨肽酶催化修饰后的大豆多肽的苦味都显著降低；经氨肽酶催化修饰后的大豆多肽的abts自由基清除能力及氧自由基清除能力显著提高，且修饰过程中添加酪氨酸（tyr）对大豆多肽的抗氧化能力提升显著。
二、上述实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：
1、苦味评价
由8位人员对大豆多肽的苦味进行评分，以盐酸奎宁标准品作为参照，评价前用不同浓度的盐酸奎宁标准溶液对感官评价人员进行训练，其中0.0、0.1、0.3、0.5与1.0mg/100ml盐酸奎宁分别对应“不苦”（0分）、‘‘微苦”（1分）、‘‘苦”（2分）、‘‘非常苦”（3分）和“极苦”（4分）；不同的大豆多肽样品都配制成1.0g蛋白/100ml的浓度，置于随机编号的样品杯中，重复的样品用不同的编号来表示；感官评价人员对不同编号的样品进行品评和打分，每评价完一个样品用矿泉水充分漱口以避免对后面样品的干扰，评分结果采用q-test进行分析处理，取平均值。
2、abts自由基清除能力的测定
abts•+储备液的配制：14mm的abts•+与4.9mm的过硫酸钾溶液等体积混合，室温放置12小时后待用，使用时取适量的储备液，用50mmph7.4的pbs缓冲溶液稀释至734nm下的吸光值为0.70±0.02左右，即为abts•+稀释液。
样品的测定：在透明的96孔微孔板中依次加入50μl样品与150μlabts•+稀释液，放入多功能读数扫描仪中混匀后在30℃下反应30min，测定其在734nm处的吸光值，记作ax，用50mmph7.4的pbs溶液代替样品作为空白对照组，对应的吸光值记为a0，以不同浓度的trolox标准溶液代替样品作为标准品组，对应的吸光值记为a0，建立trolox浓度与abts•+清除率的线性回归方程，将样品的abts•+清除率代入些方程计算出样品trolox当量值，单位为μmoltroloxequivalent/g样品；其中abts•+清除率(%)=(a0-ax)/a0*100。
3、氧自由基清除能力（orac）的测定
相关试剂的配制：荧光指示剂fl116.7nm，aaph自由基40nm，标准品trolox10-100μm，均用75mmph7.4的pbs溶液配制。
样品测定：在黑色的96孔微孔板中加入20μl稀释后的样品和120μlfl，在37℃下保温15min后，用多通道移液器快速地加入60μl现配的aaph溶液，振荡30s后，在37℃下反应100min，采用多功能读数扫描仪以激发波长485nm和发射波长520nm进行荧光强度的测定，每1min读一次数，荧光强度分别记为f0、f1……f101；同时以20μl不同浓度的trolox溶液或pbs溶液代替样品分别作为标准品组和空白对照组，orac值的计算步骤如下：根据荧光衰退曲线下面积公式
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。