利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法。

背景技术：

目前进行细胞体外初代培养的方式是利用培养皿进行体外培养，培养皿属于平面培养而且细胞在在液体中的漂浮过程不易和彼此接触，导致体外初代培养成功率非常低。

技术实现要素：

针对上述现有的细胞体外初代培养成功率低的问题，本发明提供一种利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，包括如下步骤：

1)采用醋酸电浆将中空纤维反应器表面改质10～30min，灭菌处理5～10min；

2)分离单细胞；

3)将分离的单细胞植入中空纤维反应器内，封口，将中空纤维反应器放入培养皿中，并加入培养基，培养1～20天后，取单细胞进行活性测试。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述单细胞选自单核细胞或肿瘤细胞。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述单核细胞的分离具体为：采用聚蔗糖密度梯度离心法从全血分离；所述肿瘤细胞的分离具体为：采用酵素将肿瘤样本分解成肿瘤细胞。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述中空纤维反应器包括多根平行排列的中空纤维管。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述中空纤维反应器包括由多根中空纤维管组成的纤维束。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述中空纤维管的直径为70～100μm，壁厚为2～4μm，长度为3～5cm。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，每个所述中空纤维管表面均设有多个孔洞，所述孔洞的直径为100～300nm。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述培养基为rpmi-1640。

优选的是，所述的利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其中，所述活性测试具体为：

1)将中空纤维反应器浸泡于2ml的第一移液器中，第一移液器中含有200μl0.5％噻唑蓝溶液和1000μl磷酸盐缓冲溶液，中空纤维反应器避光保存30min，离心分离出单细胞；

2)将中空纤维反应器置于含有500μl二甲基亚砜的2ml第二移液器，避光保存24h；

3)取经步骤2)处理的细胞溶液100μl至于96孔盘，测定570nm吸光度值，以判断细胞培养的存活率。

有益效果：

(1)本发明提供一种利用中空纤维反应器进行单细胞体外初代培养的方法，其具有细胞培养时间短，细胞存活率高，细胞保存时间久的优点。

(2)中空纤维反应器包括多根平行排列的中空纤维管或者为多根中空纤维管组成的纤维束，每个中空纤维管表面均设有多个孔洞，孔洞有利于细胞培养时养分传送以及产物分泌，提高细胞成活率和生长速度。

(3)中空纤维反应器对细胞进行长期三维培养，保持了细胞的生物活性，可作为抗癌药物代谢和药物毒理研究的动物癌细胞体外模型，用于体外抗癌药物筛选。

附图说明

图1为本发明中实施例1单核细胞体外初代培养存活率测试结果图；

图2为本发明中实施例2肿瘤细胞体外初代培养存活率测试结果图；

图3为本发明实施例1的中空纤维反应器；

图4为本发明实施例2的中空纤维反应器。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：利用中空纤维反应器进行单核细胞体外初代培养

中空纤维反应器(简称gnta)。

一种利用中空纤维反应器进行单核细胞体外初代培养的方法，包括如下步骤：

1)采用醋酸电浆将中空纤维反应器表面改质10min，采用uv光照射灭菌10分钟；

2)采用聚蔗糖密度梯度离心法从全血分离出单个单核细胞；

3)实验组将分离的单核细胞按2×10⁵个细胞/5μl密度植入中空纤维反应器内，再将两端开口往内折入0.5cm封口，确保细胞不流出中空纤维反应器，将中空纤维反应器放入培养皿中，并加入培养基rpmi-1640，培养1～20天后，取1～20天单核细胞进行活性测试。

中空纤维反应器为多根平行排列的中空纤维管，直径为70～100μm，壁厚为2～4μm，长度为3～5cm，每个中空纤维管表面均设有多个孔洞，孔洞的直径为100～300nm。孔洞有利于细胞培养时养分传送以及产物分泌。

活性测试具体为：

1)将中空纤维反应器浸泡于2ml的第一移液器中，第一移液器中含有200μl0.5％噻唑蓝溶液和1000μl磷酸盐缓冲溶液，中空纤维反应器避光保存30min，离心分离出单核细胞；

2)将中空纤维反应器置于含有500μl二甲基亚砜的2ml第二移液器，避光保存24h；

3)取经步骤2)处理的细胞溶液100μl至于96孔盘，测定570nm吸光度值，以判断细胞培养的存活率。

空白对照组：将分离的单核细胞按2×10⁵个细胞/5μl密度放入培养皿中，并加入培养基rpmi-1640，培养1～20天后，取1～20天单核细胞进行活性测试。

测试结果如图1所示，利用中空纤维反应器进行单核细胞体外初代培养，培养至第15天，细胞存活率约为80％；空白对照组用培养皿进行细胞培养，培养至第15天，细胞存活率约为30％。

实施例2：利用中空纤维反应器进行肿瘤细胞体外初代培养

一种利用中空纤维反应器进行肿瘤细胞体外初代培养的方法，包括如下步骤：

1)采用醋酸电浆将中空纤维反应器表面改质20min，采用uv光照射灭菌10分钟；

2)采用酵素将肿瘤样本分解成肿瘤细胞。

3)实验组将分离的肿瘤细胞按1×10⁵个细胞/5μl密度植入中空纤维反应器内，再将两端开口往内折入0.5cm封口，确保细胞不流出中空纤维反应器，将中空纤维反应器放入培养皿中，并加入培养基rpmi-1640，培养1～20天后，取1～20天肿瘤细胞进行活性测试。

中空纤维反应器为多根中空纤维管组成的纤维束，直径为70～100μm，壁厚为2～4μm，长度为3～5cm，每个中空纤维管表面均设有多个孔洞，孔洞的直径为100～300nm。孔洞有利于细胞培养时养分传送以及产物分泌。

活性测试具体为：

1)将中空纤维反应器浸泡于2ml的第一移液器中，第一移液器中含有200μl0.5％噻唑蓝溶液和1000μl磷酸盐缓冲溶液，中空纤维反应器避光保存30min，离心分离出肿瘤细胞；

2)将中空纤维反应器置于含有500μl二甲基亚砜的2ml第二移液器，避光保存24h；

3)取经步骤2)处理的细胞溶液100μl至于96孔盘，测定570nm吸光度值，以判断细胞培养的存活率。

空白对照组：将分离的肿瘤细胞按1×10⁵个细胞/5μl密度放入培养皿中，并加入培养基rpmi-1640，培养1～20天后，取1～20天肿瘤细胞进行活性测试。

测试结果如图2所示，利用中空纤维反应器进行肿瘤细胞体外初代培养，培养第7天，细胞存活率升高，而空白对照组用培养皿进行细胞培养，培养至第7天，细胞存活率降低。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。