一种四肽及其制备方法与用途与流程

本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种四肽及其制备方法与用途。

背景技术：

阿尔兹海默病(ad)又称老年痴呆症，是一种多因素诱发的中枢神经退行性疾病，多发于老年群体。ad临床表现主要包括记忆力丧失、认知能力减退，语言障碍以及精神运动异常等。该病起病缓慢或隐匿，多见于70岁以上(男性平均73岁，女性为75岁)老人，少数病人在躯体疾病、骨折或精神受到刺激后症状迅速明朗化。随着人口老龄化的加剧以及缺乏有效的预测与治疗手段，全球ad患者的数量呈上升趋势。由于ad病程的长期性，让病人及其整个家庭乃至社会承受着巨大的感情压力和经济负担。

根据发病年龄及家族聚集性，ad分为早发性、迟发性以及家族性(fad)和散发性(sad)。ad的神经组织病理学特征为：一是在大脑皮层和海马区出现有β淀粉样蛋白异常聚集形成的老年斑，二是tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结，三是大脑皮层和海马区内神经细胞减少。ad的发病原因及发病机理非常复杂，目前科学家们对其复杂的发病机制做出了众多的研究，提出了多种假说，包括aβ级联假说、tua蛋白假说、胆碱功能假说、aβ相关蛋白假说。近年来，关于ad的研究主要集中在aβ级联假说上，这一假说已成为研究预防和治疗ad相关食品、药品的主流方向。

aβ是一种分子量较小的蛋白质，是蛋白酶水解β淀粉蛋白前体的产物。假说认为，aβ的产生多余降解时，aβ蛋白清除不及时将导致aβ蛋白过多的在大脑皮层中沉积，从而形成aβ蛋白斑块。aβ过多的积累会导致一系列级联反应，如线粒体损伤、氧化应激、环氧酶cx-2活性降低，激活神经胶质细胞释放细胞因子和炎症介质，导致tau蛋白过磷酸化，引起神经纤维缠结，神经元细胞功能紊乱，加速ad发病进程。

ad这种神经退行性疾病的发病过程是不可逆的，研制可以减缓神经细胞死亡的食品、药品成为主要的方向。由于aβ1-42对神经细胞具有神经毒性，科研人员治疗ad的药物以减少aβ1-42的含量或降低aβ1-42毒性为目标，如aβ1-42免疫疗法、aβ1-42分泌酶调节剂、aβ1-42聚集抑制剂、aβ1-42降解酶调节剂。

临床上治疗ad的药物主要为乙酰胆碱释放增强剂和胆碱酯酶抑制剂，可抑制aβ1-42沉积。脑蛋白水解物为一种神经营养性多肽混合物，富含游离氨基酸、低分子多肽及镁、钾、磷、硒等多种元素，治疗阿尔兹海默症有一定疗效，多项研究显示脑蛋白水解物能显著改善患者的记忆、疲劳、眩晕、焦虑等症状。但ad的治疗始终缺乏特异性强、缓解且逆转病情，提高疾病治疗预后的有效药物。因此，进一步研发有效治疗ad的药物仍是本领域的研究热点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种四肽及其制备方法与用途，本发明提供的多肽对aβ1-42蛋白聚集具有显著的抑制作用。

本发明提供了氨基酸序列如seqidno:1所示的四肽。

所述四肽的氨基酸序列为ile-gly-phe-his，简称igfh。

其中，ile为异亮氨酸的氨基酸相应残基，gly为甘氨酸的氨基酸相应残基，phe为苯丙氨酸的氨基酸相应残基，his为组氨酸的氨基酸相应残基。

本发明还提供了编码所述四肽的dna分子。

本发明中，所述编码所述四肽的dna分子的核苷酸序列如seqidno:2所示，具体为ataggattccac。

本发明所述四肽可采用固相合成法、液相合成法或固液结合的方式进行人工合成，也可以采用基因工程的手段进行四肽的合成。

本发明所述四肽的制备方法，包括：按照seqidno:1所示氨基酸序列，在固相载体上逐一偶联氨基酸得到肽树脂，裂解后得到四肽。

具体的，所述固相合成的方法具体包括：按照所述seqidno:1所示多肽的氨基酸序列，从氨基酸序列的c端到n端，将fmoc保护氨基酸和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和保护氨基酸侧链保护基，获得粗品，粗品纯化后获得所述四肽。

固相合成发合成四肽的方法中，所述固相载体为二氯树脂。

固相合成发合成四肽的方法中，所述偶联的偶联剂为diea。所述偶联剂用量优选为过量。具体为10倍树脂摩尔量。所述偶联的条件为室温30min。

固相合成发合成四肽的方法中，所述裂解的裂解剂由tfa、水、edt和tis组成。优选的，tfa、水、edt和tis的体积比为94.5:2:2.5:1。所述裂解的条件为30℃，2h。

进一步的，所述逐一偶联方式中在每步偶联前还包括脱除fmoc步骤。在一些实施例中，所述脱除fmoc的试剂为20％哌啶dmf溶液，即哌啶：dmf＝1:4(体积比)，反应时间为15min。

本发明所述制备方法还包括对制得的多肽进行纯化的步骤。优选采用高效液相色谱纯化多肽。

流动相是水和乙腈，所述制备高效液相色谱的起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。纯度达到99％以上。

所述四肽的基因工程制备方法，包括：将包含编码所述四肽的dna分子的表达载体转化宿主细胞，诱导表达所述的四肽。

所述基因工程的宿主细胞为原核生物、真核生物。具体为大肠杆菌。酵母菌或昆虫细胞。

所述四肽在制备抑制aβ蛋白聚集的产品中的应用。

所述四肽在制备防治ad的药物中的应用。

具体实施例中，本发明基于aβ级联假说，采用e22g-aβ42-mcherryhek-293转基因细胞模型对合成多肽igfh预防进行aβ1-42蛋白聚集的体外研究。

hek293-e22g-mcherry细胞，采用四环素诱导进行体外实验。四环素能够诱导aβ1-42蛋白在细胞内聚集，从未产生毒性，模拟ad患者体内神经元细胞老年斑的病理发展过程，采用cytoflexs流式细胞仪进行对mcherry红色荧光进行检测，采用561激发器下的ecd通道。

结果表明，模型组的mcherry荧光强度高于阴性对照组，说明造模成功；此外，多肽给药组的mcherry荧光强度相较于模型组均有所降低，表明多肽具有一定的抗aβ1-42的聚集作用，且抑制效果与多肽浓度呈剂量依赖关系。

因此，0.5mm合成多肽igfh具有较好的改善记忆、抑制阿尔兹海默症发展的作用，可应用于制备抗aβ1-42蛋白聚集的食品、药品，亦可应用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的食品、药品，对包括ad疾病在内的神经退行性疾病进行有效预防和治疗，改善神经退行性疾病的医疗现状。

本发明还提供了一种防治ad的药物，其包括所述的四肽。

本发明提供的药物还包含药学上可接受的辅料。

本发明所述的药物还包含其他治疗剂，所述其他治疗剂选自其他用于治疗ad的药物。

所述食品为保健食品，剂型包括颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、片剂、粉剂、软糖、乳剂或口服液。

所述药物的剂型包括膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。

一种防治ad的方法，其为给予本发明所述的药物。

本发明提供的四肽ile-gly-phe-his具有显著抗aβ1-42蛋白聚集的功效，从而具有改善记忆、延缓阿尔兹海默症发病的作用，可广泛应用于制备抗aβ1-42蛋白聚集的食品、药品，亦可应用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的食品、药品。因而，本发明的合成多肽能对ad及其他神经退行性疾病进行有效预防或治疗，可在一定程度上改善神经退行性疾病的医疗状况，具有重大的社会价值和经济效益。

附图说明

图1a为实施例1合成的多肽igfh的高效液相色谱图；

图1b为实施例1合成的多肽igfh的液相色谱-质谱/质谱(lc-ms)图；

图2a为实施例2中阴性对照组(controlgroup)、模型组(modelgroup)、合成多肽预孵育24h且浓度分别为0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm时的mtt细胞存活率柱状图；

图2b为实施例2中阴性对照组、模型组、合成多肽预孵育24h时0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的细胞分局流式图；

图2c为实施例2中阴性对照组、模型组、合成多肽预孵育24h时0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的aβ1-42蛋白聚集率柱形图；

图3a为实施例2中阴性对照组(controlgroup)、模型组(modelgroup)、合成多肽预孵育48h且浓度分别为0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm时的mtt细胞存活率柱状图；

图3b为实施例2中阴性对照组、模型组、合成多肽预孵育48h时0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的细胞分局流式图；

图3c为实施例2中阴性对照组、模型组、合成多肽预孵育48h时0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的aβ1-42蛋白聚集率柱形图；

附图中“*”表示该组与对照组之间具有显著性差异，p<0.05；

“**”表示该组与对照组之间具有极显著性差异，p<0.01。

具体实施方式

本发明提供了一种四肽及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1固相合成法合成多肽igfh

1、合成路线工艺流程

以二氯树脂为载体，先把树脂溶胀，再将第一个氨基酸的c端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，从c端到n端依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来。

2、合成过程

以二氯树脂为载体，先把树脂溶胀，称取一定量二氯树脂，放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升dcm，振荡30min，活化待用。连接首个氨基酸，通过沙芯抽滤掉dcm溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的fmoc-l-his-oh，再加入10倍树脂摩尔量的diea，最后加入少量的dmf溶解，振荡1h。反应完后用dmf和dcm交替清洗6遍。加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，振荡15min进行脱保护。接着，抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、吡啶、苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护。接下来进行首次清洗，依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。加入3倍树脂摩尔量的fmoc-l-phe-oh，3倍树脂摩尔量的hbtu，均用少量的dmf溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的diea，反应30min进行缩合。接着进行第二次清洗，依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。抽掉溶剂，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、吡啶、苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，无色为阳性反应，若为蓝色则需要重新缩合。按照以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸，完成肽链的延伸。等最后一个氨基酸接好以后整条肽的合成便已反应完成，用dmf洗涤反应3遍，dcm洗涤反应3遍，甲醇洗涤反应3遍，最后抽干肽树脂以完成最后的收缩阶段。

3、氨基酸侧链脱保护与树脂的切割

配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：tfa(94.5％)、水(2％)、edt(2.5％)、tis(1％)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。

4、hplc纯化

首先将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50％的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。再用0.45μm滤膜过滤溶解液。取3μl溶液用分析级hplc分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将hplc用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水5％，乙腈95％。将溶解好的样品做进样准备。

制备hplc平衡10min，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。以上过程均在symphony型12通道多肽合成仪中完成，合成的多肽经shimadzu高效液相色谱仪纯化，纯度达到99％以上，并采用液相色谱-质谱/质谱(lc-ms)进行定性分析，测定其氨基酸序列。

合成的多肽的高效液相色谱图和液相色谱-质谱/质谱(lc-ms)图分别如图1a和图1b所示，由图1a和图1b分析表明，合成的多肽的一级氨基酸序列是ile-gly-phe-his，即得到目标多肽，合成获得抗aβ1-42蛋白聚集的合成多肽。

实施例2合成多肽igfh体外抗aβ1-42蛋白聚集的活性实验

1、实验方法

培养基的配制：取35ml高糖培养基(dmem)、取4ml胎牛血清(fbs)、1mll-谷氨酰胺、40μl的hygromycinb和20μl的blasticidins抗生素配制成40ml的完全培养基。

0.05、0.1、0.5和1mm的合成多肽(igfh)溶液的配制：称取4.7255mg的多肽igfh，用10ml的培养基溶解，过0.22μm的滤头后，母液浓度为1mm，再用培养基将母液稀释至实验所需浓度。

2mg/ml四环素溶液配制：称取10mg的四环素，用5ml的pbs缓冲液配制，过0.22μm的滤头后，-20℃避光保存备用。

采用hek293-e22g-mcherry细胞进行培养和实验。实验分组：阴性对照组(controlnonegroup，hek293-e22g-mcherry细胞，不加入四环素诱导)；模型组(controlgroup，hk293-e22g-mcherry细胞，采用四环素诱导)；多肽igfh低剂量组(0.1mm)和多肽igfh高剂量组(0.5mm)，每组设三个平行。

使用6孔板进行细胞铺板，每孔的细胞个数为20000，细胞贴壁生长24h后，按照实验分组分别加入培养基和多肽溶液。培养24h和48h后，更换含有培养基、不同浓度igfh多肽和最终浓度为10μg/ml四环素进行诱导培养72h。采用cytoflexs流式细胞仪进行对mcherry红色荧光进行检测，采用561激发器下的ecd通道。

aβ1-42聚集率＝处理组平均荧光强度/模型组强度×100％。

2、实验结果

阴性对照组及空白对照组(controlnonegroup)是未加入四环素诱导的细胞，模型组(controlgroup)则是加入四环素诱导的细胞，igfh是加入不同浓度合成多肽ighf的实验组。阴性对照组和不同浓度的合成多肽igfh预敷育24h的mtt细胞存活率图如图2a所示；阴性对照、模型组、多肽igfh预敷育24h的浓度为0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的的流式图和aβ1-42蛋白聚集率柱形图分别如图2b、2c所示；阴性对照组和不同浓度的合成多肽igfh预敷育48h的mtt细胞存活率图如图3a所示；阴性对照、模型组、多肽igfh预敷育48h的浓度为0.1mm的多肽低剂量组和0.5mm的多肽高剂量组的的分局流式图和aβ1-42蛋白聚集率柱形图分别如图3b、3c所示。

多肽预孵育24h时，由图2a可知，细胞的存活率呈一定的浓度依赖性，出现高浓度抑制现象。多肽浓度为0.1mm时具有促细胞增殖现象但与对照组无显著性差异(p>0.05)，多肽浓度为0.5mm时细胞存活率在80％以上，因此选择0.1、0.5mm这两种多肽浓度进行后续实验；由图2b流式图可知，模型组的mcherry荧光强度高于阴性对照组，说明造模成功；此外，多肽给药组的mcherry荧光强度相较于模型组均有所降低，表明多肽具有一定的抗aβ1-42的聚集作用。对各个直方图的平均荧光强度进行统计，相较于模型组，高、低剂量的多肽给药组的aβ1-42蛋白聚集率均有所降低，其中多肽高剂量组的aβ1-42蛋白聚集率下降较多，即多肽高剂量组的抗aβ1-42蛋白聚集效果优于多肽低剂量组。

多肽预孵育48h时，由图3a可知，细胞的存活率呈一定的浓度依赖性，出现高浓度抑制现象。多肽浓度为0.1mm和0.5mm，与空白组的细胞存活率相比无显著性差异(p>0.05)。由图3b和3c可知，多肽igfh能够显著降低aβ1-42的聚集率(p<0.05)，此多肽可以应用于抗aβ的聚集。

上述结果表明，相同浓度的多肽预孵育24h或48h，均能抗aβ1-42蛋白聚集的效果；多肽预孵育时间相同时，高、低剂量的多肽浓度均具有抗aβ1-42蛋白聚集的作用，且0.5mm多肽高剂量组的抗aβ1-42蛋白聚集效果优于多肽低剂量组。因此，0.5mm合成多肽igfh具有较好的改善记忆、抑制阿尔兹海默症发展的作用，可应用于制备抗aβ1-42蛋白聚集的食品、药品，亦可应用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的食品、药品，对包括ad疾病在内的神经退行性疾病进行有效预防和治疗，改善神经退行性疾病的医疗现状。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>无限极(中国)有限公司

<120>一种四肽及其制备方法与用途

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