肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物、检测方法及试剂盒与流程

文档序号：16917508发布日期：2019-02-19 19:05阅读：739来源：国知局

本发明属于病原分子检测领域，涉及肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法及试剂盒。

背景技术：

肠道病毒71型（humanenterovirus71,ev71）是小rna病毒科，肠道病毒属成员，是手足口病（hand-footandmouthdisease,hfmd）的主要病原体之一。1969年，ev71首次在美国加利福尼亚分离到并确定为一种新的肠道病毒。其后，ev71在全球范围内相继被发现和鉴定。ev71引起的手足口病一年四季均可发病，但夏秋季多发，好发于5岁以下儿童，多为自限性疾病，但少数能够导致严重的神经系统疾病，如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质样麻痹，甚至能够引起致命的神经源性肺水肿。因此，早期诊断、及时治疗是有效减少ev71危害的有效方法。

重组酶聚合酶恒温扩增（recombinasepolymeraseamplification，rpa），英国twistdxinc公司开发的被誉为是可替代pcr的核酸检测技术，，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板dna上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下使模板dna解链，引物于模板dna开始配对，并在dna聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1)仅需1对引物即可完成扩增，不需要太复杂的引物设计过程；(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需40min；(4)结果易于判断，不像lamp产物的弥散带，ｒpa扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

技术实现要素：

本发明提供一种快速检测、特异性好、结果准确的肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测方法和试剂盒

本发明技术方案如下：

用于肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物，其特征在于：根据该菌特异性基因vp1的序列的六个区域设计特异引物，所述引物如下：

上游引物ev71-f1，序列为：seqidno.1;

下游引物ev71-r1，序列为：seqidno.2;

进一步地，肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及以下试剂：阴性对照品、阳性对照品、、冻干酶粉、反应液及醋酸镁溶液。

进一步地，根据权利要求2所述的肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为生理盐水

进一步地，所述的肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为重组质粒puc57，含有目的基因vp1，基因序列为seqidno.11所示。

进一步地，所述的肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品的浓度为105copies/ml

进一步地，所述的肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)肠道病毒ev71型rna提取：采用通用型病毒rna提取试剂盒提取ev71病毒rna用于检测或保存于-70℃以待检测；

(2)等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应体系为：将2.4μl正向引物、2.4μl反向引物、2μlrna样品、11.2μl无dnase和rnase水和29.5μl反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min；

(3)等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应产物分析：扩增产物纯化后如果得到230bpdna片段则证明所测样品中含有肠道病毒ev71型。

附图说明

图1为用于等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测体系最佳引物的筛选，5对不同引物用于rpa扩增之后的凝胶电泳图（m：dl2000dnamarker；ck-：阴性对照样本；1-5分别为不同的引物对）；

图2肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测灵敏度试验结果图（m：dl2000dnamarker；ck+：阳性对照样本；10⁰-10⁵copies：不同拷贝数的模板）；

图3肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测特异性试验结果图（ck+：阳性对照样本；1-6分别为：乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒i和ii。

具体实施例

【实施例1】靶标选择、引物设计及筛选

（1）靶标选择及引物设计

通过ncbi数据库查找多对来源于国内的肠道病毒ev71型的基因序列，通过dnaman比对，选择vp1基因的保守序列作为靶标，具体为将目的基因片段合成后构建的质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、扩增灵敏度以及特异性过程中作为模板使用。根据rpa引物及探针设计原则，设计5对引物，引物序列及扩增长度如表1所示：

表1rpa引物对及扩增长度

（2）引物筛选

人工合成含有vp1基因的保守序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将5组引物分别进行在37℃条件下进行rpa扩增，以琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的长度及扩增效率，筛选出在37℃条件下，扩增效率最高的引物对，用于后续rpa检测的评价和应用。

扩增反应体系为：将2.4μl正向引物、2.4μl反向引物、2μlrna样品、11.2μl无dnase和rnase水和29.5μl反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min。

【实施例2】肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒组成及检测方法；

（1）肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，包括上面所述的最佳引物及以下试剂：阴性对照品、阳性对照品、冻干酶粉、反应液及醋酸镁溶液；

（2）肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法

(1)肠道病毒ev71型rna提取：采用通用型病毒rna提取试剂盒提取ev71病毒rna用于检测或保存于-70℃以待检测；

(3)等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应产物分析：扩增产物纯化后后如果得到230bpdna片段则证明所测样品中含有肠道病毒ev71型。

【实施例3】肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增灵敏度检测

（1）阳性质粒标准品制备

阳性对照的构建方法是采用pcr方法对合成序列质粒为模板进行扩增，得到所需的基因序列，序列片段经双酶切后与相应双酶切puc57质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并测序验证后获得阳性对照样品。使用nanodroplite分光光度计计算质粒浓度，并计算拷贝数，拷贝数计算公式为：(6.02×10²³)×(g/ml)/(dnalength×660)=copies/ml。以10倍的梯度稀释阳性对照质粒，稀释为10⁰～10⁵copies/ml6个稀释梯度作为灵敏度测试模板；

（2）灵敏度检测

分别以10⁰～10⁵copies/ml6个浓度梯度阳性质粒为模板，使用筛选的最佳引物对在37℃条件下进行rpa扩增，扩增产物纯化后后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增的效率；

【实施例3】肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增特异性检测

以ev71，乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒i和ii，按照本试剂盒提供的方法，提取核酸，进行等温逆转录重组酶聚合酶扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

序列表

<110>重庆高圣生物医药有限责任公司

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