一种IDO1抑制剂及其应用的制作方法

本发明属于药学技术领域，具体涉及一种ido1抑制剂及其应用。

背景技术：

吲哚胺-2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,ido1)是广泛分布于肝脏以外，含亚铁血红素的单体蛋白质，能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径(kynureninepathway，kp)代谢的限速酶，可催化色氨酸分解产生l-犬尿氨酸、喹啉酸等具有生物活性的代谢产物。ido1由ido1基因编码，ido1基因启动子含有2个ifn-γ激活位点，ifn-γ可以诱导ido1高水平表达。有研究表明，ido1在多数组织中处于沉默状态，但是在多种肿瘤细胞中高表达，ido1的过表达与癌症的发展和预后相关，抑制ido1活性在肿瘤疾病的治疗中有着举足轻重的作用。因此，ido1也被认为是一个具有极大开发潜力的靶标。

目前，已经进入抗肿瘤临床试验的ido抑制剂主要包括incb024360、nlg-919、1-甲基-色氨酸等，但是现有抑制剂存在活性低、选择性差、分子骨架单一或毒副作用等缺点，世界上还未有ido1抑制剂药物问世。可见，寻找新的ido1抑制剂可望获得有价值的抗肿瘤药物并拥有良好的开发前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种ido1抑制剂及其应用。

本发明提供了一种式(ⅰ)所示化合物或其立体化学异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐：

其中，r1、r2、r3分别独立地选自c1～c10烷基、c6～c10含芳环取代基。

进一步地，r1、r2、r3分别独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、苄基(-bn)。

进一步地，所述化合物结构为

本发明还提供了前述的化合物或其立体化学异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐在制备ido1抑制剂类药物上的用途。

进一步地，所述药物是抗肿瘤药物。

进一步地，所述药物是免疫增强剂。

本发明还提供了一种药物，它是以前述化合物或其立体化学异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明提供的化合物、或其立体化学异构体，或其溶剂合物、或其药学上可接受的盐表现出对ido1活性的抑制作用。可作为ido1抑制剂，应用于制备抗肿瘤药物。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为化合物zh-26的ic50值。

图2为化合物zh-26对ido1表达的作用。注：ctrl：ifn-γ处理组；ep：epacadostat+ifn-γ处理组；zh-26：不同浓度zh-26+ifn-γ处理组；*：p<0.05vsctrl；**：p<0.01vsctrl。

图3为化合物zh-26抑制过表达的ido1。注：*：p<0.05vsinf-γ。

图4为化合物zh-26对hela细胞增殖的影响。注：**：p<0.01vscon。

图5zh-26-s和con-s组的培养基作用mcf-7细胞。

图6注：cd4⁺t细胞的cd4⁺t细胞il-2表达量变化**：p<0.01vscon；#：p<0.05vscon-s；+：p<0.05vscon-s1。

具体实施方式

除特别标注外，本发明所用试剂和测试设备均为常规的市售试剂和设备。

实施例1本发明一种ido1抑制剂的应用

1、本实验所用材料、试剂及设备

(1)细胞和质粒：人宫颈癌细胞hela、人胚肾细胞hek-293a、人乳腺癌细胞株mcf-7细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心，由中国科学院成都生物研究所天然产物中心实验室保存；idocdna购自北京义翘神州科技有限公司。

(2)试剂：epacadostat购自上海蓝木化工有限公司；人干扰素ifn-γ购自南京金斯瑞生物科技有限公司；转染试剂lipofectamine2000购自赛默飞世尔科技公司；增强型cck-8试剂盒、人elisa试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；rmpi1640培养基购自美国hyclone公司；植物血凝素(pha)购自美国sigma公司。

(3)设备：verioskanflash多功能读数仪(thermofisher)；imagequantlas500一体化成像仪(gehealthcare)。

2、实验方法

(1)细胞培养

人宫颈癌细胞hela、人胚肾细胞hek-293a均在dmem-高糖培养基(含10％新生牛血清，100u/ml氨苄青霉素及100mg/ml链霉素)，人乳腺癌细胞mcf-7在rmpi-1640(含10％新生牛血清，100u/ml氨苄青霉素及100mg/ml链霉素)，5％co2，37℃细胞培养箱中培养。

(2)ido1抑制剂筛选

hela细胞按1.0×10⁵个/孔接种至48孔板，37℃培养过夜。每孔加入适量待测试药物，epacadostat作为阳性对照药，培养24h。每孔加入50ng/mlifn-γ培养24h以诱导细胞内ido产生。取100μl细胞培养液至离心管中，加入25μl30％的tca，50℃水浴30min，10000rpm离心10min，取100μl上清液至96孔板中，每孔加入100μl2％的对二甲氨基苯甲醛(pdab)，混匀后室温静置10min，多功能读数仪检测a492。

(3)hek-293a过表达ido

hek-293a细胞按1.0×10⁶个/孔接种至6孔板，37℃培养过夜。在转染前2h将培养液更换为无血清无双抗培养液。用125μlopti-mem稀释2.5μgidocdna，另用125μlopti-mem稀释5μllipofectamine2000，轻轻混匀，室温静置5min。将质粒稀释液滴加至稀释好的转染试剂中，室温静置20min，将混合液滴加至6孔板中，37℃培养6h更换为完全培养基，37℃继续培养24h，过表达ido。

(4)hela细胞增殖

hela细胞按5000个/孔接种至96孔板，37℃培养过夜。加入不同浓度zh-26，培养24h，每孔加入10％增强型cck-8溶液，在37℃继续培养0.5-1h。当培养液颜色变黄时，多功能读数仪检测450nm吸光度。

(5)分离并活化cd4⁺t细胞

无菌采集30ml健康志愿者外周静脉血，经肝素抗凝后，以等量rpmi-1640稀释，经密度梯度离心提取外周血单个核细胞，经macs磁性分离柱分选获得cd4⁺t淋巴细胞。使用抗cd3抗体(2μg/ml)包被6孔板12h，再加抗cd28抗体(2μg/ml)刺激分离得到的cd4⁺t淋巴细胞。台盼兰染色证明活细胞率≥98％后，富集cd4⁺t淋巴细胞(2×10⁵)培养于rpmi-1640培养基(含10％新生牛血清，20mg/lpha)，5％co2，37℃细胞培养箱中培养48h，以备后用。

(6)经和不经zh-26作用的乳腺癌的培养上清制备

收集对数生长期mcf-7细胞，分别用含zh-26(终浓度17.5μm，预实验证明对mcf-7的生长增殖无影响)和不含zh-26(作对照)的rmpi-1640完全培养基，于37℃、5％co2饱和湿度中培养48h，收集不含及含zh-26作用的细胞培养上清液(con-s组和zh-26-s组)。充分漂洗残余药物后，重悬细胞至初始浓度，收集zh-26再培养上清液(zh-26-s1组)，同时以不经zh-26作用的同步再培养上清(con-s1组)作对照。以cck-8法对细胞增殖率进行检测，细胞培养上清液于-80℃冻存。

(7)zh-26对cd4⁺t淋巴细胞il-2表达量的影响

于培养瓶中分别加入0.25mlcd4⁺t淋巴细胞(1×10⁷/ml)、0.25mlpha(20mg/l)及上述待测上清液，以完全培养基为正常对照(con组)，培养48h后用pbs洗涤6次，改为无血清培养基培养12h后收集细胞培养上清，离心5min。按照人elisa试剂盒说明书的操作步骤检测il-2表达量。

(8)数据统计与处理

所有实验均重复三遍，结果表示为平均值±标准差，运用graphpadprism软件进行单因素方差分析(oneway-anova)，p<0.05为具有显著性差异。

3、实验结果

(1)ido1抑制剂筛选

通过以上建立的基于ifn-γ诱导hela细胞高表达ido1模型，对fda文库1430个化合物和本实验室771个化合物进行筛选，发现如下所示化合物zh-26对ido1活性具有显著抑制作用。

用不同浓度zh-26检测对ifn-γ诱导的hela细胞表达ido1的抑制作用，采用graphpadprism软件对ic50值进行计算，结果如图1所示。zh-26的ic50值为4.68±0.21μm，该化合物在体外具有良好的ido1抑制作用。

(2)hek-293a过表达ido1

ido1在肿瘤细胞中高表达，而在多数细胞之中处于沉默状态。在hek-293a中过表达ido1，检测zh-26对ido1的抑制作用。pcmv3-ido1质粒转染至hek-293a细胞24h后，加入不同浓度的zh-26处理6h，细胞上清液检测ido1活性，结果如图2所示，zh-26能够抑制过表达的ido1活性，并且随着浓度增加该抑制作用加强。以上结果表明，zh-26可以直接抑制ido1的活性。

(4)hela细胞增殖

分别用不同浓度的zh-26处理hela细胞24h，cck-8检测化合物对hela细胞增殖的影响，结果如图3所示。在低浓度下，zh-26对hela细胞没有明显的细胞毒作用，表明在低浓度的条件下，化合物下调hela细胞的ido1的表达并不是因为对细胞的毒性作用引起的。

(5)实验用zh-26浓度的确定

添加不同浓度的zh-26作用于mcf-7细胞，cck-8检测结果显示，最高浓度为17.5μm的zh-26对mcf-7细胞增殖与con组比较差异无统计学意义(p>0.05)，见图4。zh-26-s和con-s组的培养基作用mcf-7细胞48h及作用后连续再培养mcf-7细胞，cck-8结果显示，与未经zh-26作用同步培养的mcf-7细胞相比，17.5μm的zh-26未明显影响细胞增殖(p>0.05)，见图5。

本实验考察con组、con-s组及con-s1组对cd4⁺t淋巴细胞增殖的影响，cck-8法检测结果显示，各组的a450值分别为(0.41±0.06)、(0.42±0.04)、(0.42±0.06)，差异无统计学意义(p>0.05)。

(6)活化的cd4⁺t淋巴细胞用不同细胞上清培养后il-2表达量变化

未经和经zh-26作用mcf-7细胞并获其上清后，分别作用于cd4⁺t细胞，检测其对cd4⁺t细胞il-2表达量变化。结果(图6)表明：与con相比，con-s及con-s1对cd4⁺t细胞il-2表达明显抑制(p<0.05)，且各组之间基本无差异(p>0.05)。经zh-26作用mcf-7细胞后，与con-s及con-s1相比，zh-26-s组及zh-26-s1组il-2表达显著升高(p<0.05)。

本发明所提供的化合物zh-26能够抑制ido1活性，采用graphpadprism软件计算出zh-26的ic50值为4.68±0.21μm。在hek-293a细胞中过表达ido1，不同浓度的zh-26处理细胞后也表现出对ido1活性的抑制作用。低浓度的zh-26在hela细胞内没有发现明显的细胞毒作用。低细胞毒性浓度的zh-26作用于mcf-7收集上清液，作用于cd4⁺t细胞后，其il-2表达明显升高。

综上，zh-26能够抑制ido1活性，也可降低肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，可做为一种免疫增强剂。