一种基于原生质体的海带分子育种方法与流程

文档序号：17549147发布日期：2019-04-30 18:08阅读：426来源：国知局

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种基于原生质体的海带分子育种方法。

背景技术：

海带(sccharinajaponica)是一种生长在低温海水中的大型海生褐藻，具有明显的无性繁殖与有性繁殖世代交替现象，即有配子体世代和孢子体世代。藻体孢子囊释放游动孢子，放散的孢子为单细胞，是天然的原生质体，经萌发后形成配子体，配子体的卵囊和精囊结合形成合子，合子进一步萌发产生幼孢子体，经营养生长发育为海带。海带是我国一种重要的大型经济海藻，其用途广泛,主要应用于医药、食品、化工等方面。目前,我国海带养殖面积超过24万公顷,养殖产量83万吨,总体养殖产量占全球总量的80％以上,产量、规模处于世界领先地位。

目前，在我国主要经济海藻栽培方面，海带良种覆盖率总体不足30％，良种数量、优良种苗繁育能力严重不足，已成为制约我国海带产业持续、高效和稳定发展的重大瓶颈因素。目前应用的传统育种方法有群体水平的选择育种和杂交育种等,然而传统海带育种存在着育种周期长、品系纯度低、品系连续退化、成本高、风险大等缺点，随着分子生物学和基因组学等的飞速发展,分子育种应运而生，将现代生物技术手段整合于传统育种方法中,大幅度提高育种效率,缩短育种周期已成为现代育种的主流方向。分子育种包括通过原生质体融合，体细胞杂交育种，目的基因的转移、整合与表达,用于种质创新、品种改良以及分子标记辅助育种等。

原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建,是植物细胞工程的重要手段。现有的融合技术中,以聚乙二醇(peg)诱导融合和电融合二者占主要地位。其中peg融合技术具有设备简单、操作方便等优点，主要应用于双子叶植物和单子叶植物，但在海洋植物中极少应用。目前大型海藻原生质体方法尚不稳定,主要是借助海带自身异型世代交替生活史的特点,将单倍的配子体作为转化对象,转化后通过孤雌或受精发育而生成孢子体,从而完成整个转基因操作，但存在操作过程复杂、周期较长、成本较高等缺点。现有的peg融合技术又存在原生质体纯度低、融合产物纯度低、融合后筛选困难、可供融合的亲本原生质体数量很少等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于原生质体的海带分子育种的方法。克服了现有技术中存在的不足，利用海带孢子作为天然原生质体，结合peg融合技术和转基因技术，用peg诱导含有目的基因的质粒转入原生质体，优化了原生质体的制备和融合转化的方法，为海带的分子遗传育种提供了一种新的途径。

本发明提供了一种基于原生质体的海带分子育种的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)海带天然原生质体的制备

将种海于8℃过夜阴干，冷海水刺激种海带放散出游孢子，得到孢子液，即为海带天然原生质体；

(2)原生质体转化

将外源质粒pbi221-stgbss-bar-gfp或pbi221-bar-gfp加入步骤(1)得到的孢子液，加入peg4000溶液，混匀，避光静置培养后，得到孢子培养液；

向孢子培养液中加入w5溶液，静置后，离心，弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入消毒海水，避光转化培养后，得到转化培养后的孢子液；

所述的外源质粒pbi221-stgbss-bar-gfp的基因序列如seqidno：1所示；

所述的外源质粒pbi221-bar-gfp的基因序列如seqidno：2所示；

(3)培养育苗

苗帘培养：在大托盘中加入步骤(2)转化培养后的培养液，放入苗帘和玻片，附着培养后，将苗帘取出放入培养水箱中加消毒海水，继续培养，得到孢子体幼苗。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)海带天然原生质体的制备

选择孢子囊发育良好的种海带，将种海带用过滤海水冲去表面杂质后，于8℃过夜阴干，用煮沸后冷却的过滤灭菌冷海水刺激种海带放散出游孢子，游孢子的放散量为0.5-2.0×10⁶个/ml，得到孢子液，即海带天然原生质体；

(2)原生质体转化

将外源质粒pbi221-stgbss-bar-gfp或pbi221-bar-gfp加入步骤(1)得到的孢子液，加入peg4000溶液，混匀，8℃避光静置培养30min，得到孢子培养液；

向孢子培养液中加入w5溶液，8℃静置后，2500rpm离心15min，将细胞沉于管底；去掉上清，沉淀中加入消毒海水，8℃避光，转化培养8-168h，荧光显微镜blue档下进行荧光观察，得到转化培养后的培养液；

所述的外源质粒pbi221-stgbss-bar-gfp的基因序列如seqidno：1所示；

所述的外源质粒pbi221-bar-gfp的基因序列如seqidno：2所示；

(3)培养育苗

苗帘培养：在大托盘中加入步骤(2)转化培养后的培养液，放入苗帘和玻片，附着培养2h，待玻片上附着的细胞数在10×10视野下达到28-70个后，将苗帘取出放入培养水箱中加消毒海水继续培养30d，得到孢子体幼苗。

在一些具体的实施方案中，所述的方法中步骤(2)原生质体转化为：

取5000ml三角瓶，先加入400ml步骤(1)得到的孢子液，再加入40mg外源质粒，混匀，加入400mlpeg4000溶液，混匀，8℃避光静置培养30min；

向混合液中加入w5溶液，使体系达到4000ml，8℃静置5min，得到孢子液；2500rpm离心15min，将细胞沉于管底；弃上清，加入4000ml消毒海水，8℃避光，转化培养；

步骤(1)中所述的孢子液中种海带放散出的游孢子的放散量为0.5-2.0×10⁶个/ml；优选为0.8×10⁶个/ml。

具体地，步骤(2)中所述的peg4000溶液为peg4000水溶液，ph为5.7，由过滤除菌的海水配置，所述的peg4000的体积百分含量为20-50％，优选为30-40％，进一步优选为35％。

优选地，上述的peg4000水溶液中还含有0.4m甘露醇，ph为5.7，由过滤除菌的海水配置，所述的peg4000的体积百分含量为20-50％，优选为30-40％，进一步优选为35％。

优选地，步骤(2)中所述的w5溶液包含154mmnacl和5mmkcl，ph为5.7，由高压灭菌的海水配置。

优选地，所述步骤(2)中的外源质粒为pbi221-bar-gfp，8℃避光，转化培养24-48h。

优选地，所述步骤(2)中的外源质粒为pbi221-stgbss-bar-gfp，8℃避光，转化培养8h。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

1、本发明提供的方法使用的原生质体为海带天然的原生质体，该原生质体活力好、发育转化效率高，能够提高peg融合的效率；同时，该原生质体可进行大批量的peg融合实验，一次性可获得更多的遗传转化植株；另外，该原生质体可适用于携带不同外源基因质粒的peg融合转化应用，适用范围广。解决了peg融合技术原生质体纯度低、可供融合的亲本原生质体数量少等问题。

2、本发明提供的方法所用的外源质粒为pbi221-stgbss-bar-gfp或pbi221-bar-gfp，其转化率明显提高，转化培养时间更短。当外源质粒为pbi221-bar-gfp时，转化培养24-48h，平均转化率可达到1.83％-1.92％；当外源质粒为pbi221-stgbss-bar-gfp时，转化培养8h，平均转化率达到2.54％。本发明提供的方法还优化了融合转化的操作过程、缩短了周期、显著降低了细胞死亡率、降低了经济成本，为海带的分子遗传育种提供了一种新的途径。

附图说明

图1为实施例2中质粒pbi221-gfp的图谱；

图2为实施例2中质粒pbi221-stgbss-bar-gfp的图谱；

图3为实施例2中质粒pbi221-bar-gfp的图谱；

图4为实施例2中转化培养8h时，在荧光显微镜和普通显微镜下的观察图；

图5为实施例2中转化培养24h时，在荧光显微镜和普通显微镜下的观察图；

图6为实施例2中转化培养48h时，在荧光显微镜和普通显微镜下的观察图；

图7为实施例2中转化培养72h时，在荧光显微镜和普通显微镜下的观察图；

图8为实施例2中转化培养168h时，在荧光显微镜和普通显微镜下的观察图；

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1

海带天然原生质体的制备

选择孢子囊发育良好的种海带，将种海带用过滤海水轻轻冲去表面杂质(不要触摸，轻轻冲洗)，放在泡沫箱中加冰瓶于8℃(即3库)过夜阴干，用烧过的过滤灭菌冷海水加冰瓶在大盒子中刺激海带放散出游孢子，得到孢子液(即海带天然原生质体)，富集之前和富集之后的孢子液在血球计数板下统计细胞浓度。

游动孢子的放散量为0.8×10⁶个/ml用于后续实验。

实施例2

peg诱导转化

(1)质粒pbi221-stgbss-bar-gfp

将质粒pbi221-gfp(图谱见图1，购自上海酶研生物科技有限公司，货号：mj1389)改造为pbi221-stgbss-bar-gfp质粒，其图谱如图2所示，基因序列如seqidno：1所示。

①取5000ml三角瓶，先加入400ml富集后的孢子液，再加入40mg外源质粒pbi221-stgbss-bar-gfp，混匀。加入400ml35％peg4000溶液，混匀，8℃避光静置培养30min，得到混合液；

②向混合液中加入约3200mlw5，使体系达到4000ml，8℃静置5min，2500rpm离心15min，将细胞沉于管底；

③去掉上清，加入4000ml消毒海水，8℃避光，转化培养后得到孢子液。8h，24h，48h，72h，168h(7d)荧光显微镜blue档下进行荧光观察(转化孢子呈现红黄交叠荧光和未转化的孢子呈现红色叠荧光)，观察结果分别见图4、图5、图6、图7、图8。每次观察随机选取大于20个视野(保证观察总细胞数≥200个细胞)，分别统计转化成功的细胞总数，计算转化效率，同时统计死亡细胞数目，计算死亡率，结果见表1。

④细胞附着培养：

玻片：每个玻片的凹槽处滴70ul转化培养后得到孢子液，实验组每组15片，共7组、105片、210个凹槽，将玻片放在培养皿中培养24h后向每个培养皿中加入50ml海水培养液，避光培养；

苗帘：每个大托盘中加10l水，同时放入10个苗帘(双层培养)，4个玻片(检查附着密度用)，共6个培养盒60个苗帘，附着2小时，待玻片上附着的细胞数达到10×10视野下每视野细胞数达到70、29、60、36、45、43个后，将苗帘取出放入培养水箱子中加入消毒海水培养。

(2)质粒pbi221-bar-gfp

将质粒pbi221-gfp改造为pbi221-bar-gfp质粒，其图谱如图3所示，基因序列如seqidno：2所示。

①取2000ml三角瓶，先加入100ml富集后的孢子液，再加入10mg外源质粒pbi221-bar-gfp，混匀。加入100ml35％peg4000溶液，混匀，8℃(3库即可)避光静置培养30min，得到混合液；

②向混合液中加入约800mlw5，使体系达到1000ml，8℃静置5min，2500rpm离心15min，将细胞沉于管底；

③去掉上清，加入1000ml消毒海水，8℃避光，转化培养后得到孢子液。8h，24h，48h，72h，168h(7d)荧光显微镜blue档下进行荧光观察(转化孢子呈现红黄交叠荧光和未转化的孢子呈现红色叠荧光)，观察结果分别见图4、图5、图6、图7、图8。每次观察随机选取大于20个视野(保证观察总细胞数≥200个细胞)，分别统计转化成功的细胞总数，计算转化效率，同时统计死亡细胞数目，计算死亡率，结果见表2。

④细胞附着培养：

苗帘：每个大托盘中加10l水，同时放入10个苗帘(双层培养)，4个玻片(检查附着密度用)，共1个培养盒10个苗帘，附着2小时，待玻片上附着的细胞数达到10×10视野下每视野细胞数达到28个后，将苗帘取出放入培养水箱子中加入消毒海水培养。

(3)对照

①取1000ml三角瓶，先加入100ml富集后的孢子液，混匀。加入100ml35％peg4000溶液，混匀，8℃(3库即可)避光静置培养30min，得到混合液；

②向混合液中加入约800mlw5，使体系达到1000ml，8℃(3库即可)静置5min，2500rpm离心15min，将细胞沉于管底；

③去掉上清，加入1000ml消毒海水，8℃避光，转化培养后得到孢子液。8h，24h，48h，72h，168h(7d)荧光显微镜blue档下进行荧光观察，观察结果分别见图4、图5、图6、图7、图8。每次观察随机选取大于20个视野(保证观察总细胞数≥200个细胞)，统计死亡细胞数目，计算死亡率，结果见表3。

④细胞附着培养：

苗帘：每个大托盘中加10l水，同时放入10个苗帘(双层培养)，4个玻片(检查附着密度用)，共1个培养盒10个苗帘，附着2小时，待玻片上附着的细胞数达到10×10视野下每视野细胞数达到42个后，将苗帘取出放入培养水箱子中加入消毒海水培养。

表1：pbi221-stgbss-bar-gfp转化结果

表2：pbi221-bar-gfp转化结果

表3：对照组结果

由表1-3可知，当外源质粒为pbi221-stgbss-bar-gfp时，转化培养时间最短，平均转化率最大，细胞死亡率最低；当外源质粒为pbi221-bar-gfp时，转化培养时间较短，平均转化率较高，细胞死亡率相对较低。说明本发明提供的一种基于原生质体的海带分子育种方法有效地缩短了培养周期、提高了转化率、降低了细胞死亡率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种基于原生质体的海带分子育种方法

<130>2018

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6930

<212>dna

<213>人工合成(artificial)

<400>1

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<212>dna

<213>人工合成(artificial)

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