培育具有不同木质素含量的转基因植物的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及培育具有不同木质素含量的转基因植物的方法。

背景技术：

玉米是世界上最重要的食粮之一,现今全世界约有三分之一人口以玉米作为主要食粮。玉米的蛋白质含量高于大米,脂肪含量高于面粉、大米和小米,含热量高于面粉、大米及高粱。在城市及较发达地区,玉米是调剂口味不可缺少的食品。随着玉米加工工业的发展,玉米的食用品质不断改善,新的玉米食品如玉米片、玉米面、玉米渣、特制玉米粉、速食玉米等随之产生,并可进一步制成面条、面包、饼干等。玉米还可加工成为玉米蛋白、玉米油、味精、酱油、白酒等,这些产品在国内外市场上很受欢迎。玉米是饲料之王。据报道,100千克玉米的饲用价值相当于135千克燕麦,120千克高粱或150千克籼米。玉米的副产品秸秆也可制成青贮饲料。世界上大约65-70％的玉米都用作饲料,发达国家高达80％,是畜牧业赖以发展的重要基矗。

木质素是三种苯丙烷单元通过醚键和碳碳键相互连接形成的具有三维网状结构的生物高分子，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁，为次生壁主要成分。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。一方面，降低木质素含量后的玉米秸秆更容易转化为生物能源。另一方面，增加木质素含量后的玉米植株，抗倒伏性更强。

micrornas(简称mirna)是一类内源的长约20～24个核苷酸的非编码rna分子，它们通过对靶基因mrna的切割或抑制靶基因的翻译，特异地对靶基因进行转录后调控。

技术实现要素：

本发明的目的是提供培育具有不同木质素含量的转基因植物的方法。

本发明提供了一种培育木质素含量降低的转基因植物的方法(方法甲)，包括如下步骤：在出发植物中导入特异dna分子ⅰ，得到木质素含量低于所述出发植物的转基因植物；所述特异dna分子ⅰ为dna分子甲或dna分子乙；所述dna分子甲编码序列表的序列1所示的mirna；所述dna分子乙编码序列表的序列1所示的mirna的前体rna。

所述“序列表的序列1所示的mirna的前体rna”为序列表的序列2所示的rna。

所述特异dna分子ⅰ具体可为序列表的序列4所示的dna分子。

所述特异dna分子ⅰ具体可通过重组质粒ⅰ导入出发植物。所述重组质粒ⅰ具体可为在pcub载体的bamhi酶切位点插入所述特异dna分子ⅰ得到的重组质粒。

所述方法甲得到的转基因植株，木质素含量降低，茎秆穿刺强度降低，可作为生物能源的原材料。

本发明还保护一种培育木质素含量增加的转基因植物的方法(方法乙)，包括如下步骤：在出发植物中导入特异dna分子ⅱ，得到木质素含量高于所述出发植物的转基因植物；所述特异dna分子ⅱ为抑制序列表的序列1所示的mirna表达的dna分子。

所述特异dna分子ⅱ具体可为序列表的序列5所示的dna分子。

所述特异dna分子ⅱ具体可通过重组质粒ⅱ导入出发植物。所述重组质粒ⅱ具体可为在pcub载体的bamhi酶切位点插入所述特异dna分子ⅱ得到的重组质粒。

所述方法乙得到的转基因植株，木质素含量增高，茎秆穿刺强度增高，抗倒伏性能增强。

以上任一所述出发植物可为单子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为玉米，例如玉米品种综31。

本发明还保护序列表的序列1所示的mirna。

本发明还保护序列表的序列1所示的mirna的前体rna。所述前体rna具体可为序列表的序列2所示的rna。

本发明还保护编码序列表的序列1所示的mirna的基因。

本发明还保护编码序列表的序列2所示的rna的基因。

所述基因具体可为序列表的序列4所示的dna分子。

含有所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为将所述基因插入pcub载体的bamhi酶切位点得到的重组质粒。

本发明还保护序列表的序列1所示的mirna、序列表的序列2所示的rna或所述基因在培育木质素含量降低的植物中的应用。

本发明还保护用于抑制序列表的序列1所示的mirna的物质或抑制序列表的序列2所示的rna表达的物质在培育木质素含量增高的植物中的应用。所述抑制序列表的序列1所示的mirna的物质或所述抑制序列表的序列2所示的rna表达的物质具体可为干扰载体。所述干扰载体为具有序列表的序列5所示的dna分子的重组质粒。所述干扰载体具体可为将序列表的序列5所示的dna分子插入pcub载体的bamhi酶切位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种重组质粒(干扰载体)，为具有序列表的序列5所示的dna分子的重组质粒。所述干扰载体具体可为将序列表的序列5所示的dna分子插入pcub载体的bamhi酶切位点得到的重组质粒。

以上任一所述植物可为单子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为玉米，例如玉米品种综31。

本发明在玉米分子育种中具有重要意义。

附图说明

图1为mirna表达量的鉴定的结果。

图2为组织化学染色中根部的照片。

图3为组织化学染色中第一节间的照片。

图4为木质素含量测定的结果。

图5为茎杆穿刺强度测定测定的结果。

图6为盆栽实验中抽雄期植株的照片。

图7为northernblot试验的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

提及“玉米品种综31”的参考文献：玉米优良自交系综3、综31的转化研究；杨会，王国英，戴景瑞；《农业生物技术学报》，2001年04期。

提及“玉米b73”的参考文献：玉米自交系b73丙酮酸磷酸双激酶基因的克隆及低氮对ppdk表达的影响；龚付全，李平华；《热带生物学报》，2014年4期。

从玉米中发现一个mirna，如序列表的序列1所示，其前体rna如序列表的序列2所示。

实施例1、构建重组质粒

pcub载体为序列表的序列3所示的环形质粒。

1、将序列表的序列4所示的双链dna分子插入pcub载体的bamhi酶切位点，得到重组质粒pcub-mir。重组质粒pcub-mir为过表达序列表的序列1所示mirna的质粒。序列表的序列4所示的双链dna分子表达序列表的序列2所示的rna分子。序列表的序列2所示rna分子为序列表的序列1所示mirna的前体rna。

2、将序列表的序列5所示的双链dna分子插入pcub载体的bamhi酶切位点，得到重组质粒pcub-mim。序列表的序列5中，第218-241位核苷酸中“cta”以外的部分与序列表的序列1所示rna相应的dna反向互补。重组质粒pcub-mim为抑制序列表的序列1所示mirna表达的质粒。

实施例2、转基因植物的制备以及表型鉴定

一、制备转基因植物

以玉米品种综31为出发植物。玉米品种综31又称野生型植株，在图中用wt表示。

在出发植物中导入重组质粒pcub-mir，得到t0代转基因植株，将t0代转基因植株自交获得t1代植株，t1代植株自交获得t2代植株。在t2代获得纯合的转基因株系，命名为过表达株系。随机取一个过表达株系(oe)进行后续试验。

在出发植物中导入重组质粒pcub-mim，得到t0代转基因植株，将t0代转基因植株自交获得t1代植株，t1代植株自交获得t2代植株。在t2代获得纯合的转基因株系，命名为抑制表达株系。随机取两个抑制表达株系(tm-3和tm-7)进行后续试验。

在出发植物中导入pcub载体，得到t0代转基因植株，将t0代转基因植株自交获得t1代植株，t1代植株自交获得t2代植株。在t2代获得纯合的转基因株系，命名为转空载体株系。

二、mirna表达量的鉴定

试验植株为：oe株系的t2代植株、tm-3株系的t2代植株、tm-7株系的t2代植株、出发植物。每个株系5株，结果取平均值。

取试验植株的叶片，提取总rna，采用rt引物进行反转录，然后采用f1和r1组成的引物对进行实时定量pcr，检测序列表的序列1所示mirna的相对表达水平。采用ubi基因为内参基因(用于鉴定内参基因的引物对由f2和r2组成)。

rt：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctcctc。

f1：5’-gtggaaggggcatgca-3’；

r1：5’-gtgcagggtccgaggt-3’。

f2：5’-gctgccgatgtgcctgcgtcg-3’；

r2：5’-ctgaaagacagaacataatgagcacag-3’。

结果见图1。与野生型植株相比，oe株系植株中序列表的序列1所示mirna的表达量明显增加，tm-3株系植株和tm-7株系植株中序列表的序列1所示mirna的表达量显著降低。

三、组织化学染色

试验植株为：oe株系的t2代植株、tm-3株系的t2代植株、tm-7株系的t2代植株、转空载体株系的t2代植株、出发植物。

取水培条件下生长30天(从催芽开始计天数)的试验植株的第一节间以及根部成熟区，切片(切片厚度为50μm)，用5％间苯三酚染色2min，然后滴加1滴盐酸，在显微镜下进行观察。

根部的照片见图2(刻度标尺代表75μm)。

第一节间的照片见图3(刻度标尺代表200μm)。

不论在地上部还是根部，与野生型植株相比，oe株系植株中染色变浅(即木质素含量降低)，tm-3株系植株和tm-7株系植株中染色变深(即木质素含量增加)。不论在地上部还是根部，与野生型植株相比，转空载体株系植株的染色强度一致。

四、木质素含量测定

试验植株为：oe株系的t2代植株、tm-3株系的t2代植株、tm-7株系的t2代植株、转空载体株系的t2代植株、出发植物。每个株系3株，结果取平均值。

取成熟期授粉后第7天的试验植株的第三节间，80℃烘干至恒重，然后粉碎并过40目筛，收集粉末。称取约5mg粉末于10ml玻璃试管中，采用苏州科铭木质素含量试剂盒(乙酰溴法，具体步骤见说明书)检测木质素含量。

木质素含量(单位为mg/g，mg为木质素的质量单位，g为粉末干重的质量单位)＝0.0735*(△a-0.0068)/w*t。a：280nm处吸光值；△a＝a测定管-a空白管；w：样本质量，单位为g；t：稀释倍数。

结果见图4。与野生型植株相比，oe株系植株的茎杆木质素含量降低了22.93％，tm-3株系植株的茎杆木质素含量升高了42.15％，tm-7株系植株的茎杆木质素含量升高了28.96％。与野生型植株相比，转空载体株系植株的茎杆木质素含量无显著变化。

五、茎杆穿刺强度测定

茎杆穿刺强度与玉米抗倒伏具有显著相关性，能综合反映茎杆强度和抗倒伏性。

试验植株为：oe株系的t2代植株、tm-3株系的t2代植株、tm-7株系的t2代植株、转空载体株系的t2代植株、出发植物。每个株系20株，结果取平均值。

成熟期授粉后第7天的试验植株进行穿刺强度测定，具体步骤为：使用awos-sl04型茎秆强度测定仪，将横截面积为1.0mm²的测头以茎秆的短轴方向垂直刺入地上部第三节间中部，读取并记录试验数据。

结果见图5。与野生型植株相比，oe株系植株的茎杆的穿刺强度降低了22.15％，tm-3株系植株的茎杆的穿刺强度升高了18.97％，tm-7株系植株的茎杆的穿刺强度升高了21.45％。与野生型植株相比，转空载体株系植株的茎杆的穿刺强度无显著变化。

六、盆栽实验

试验种子为：oe株系的t3代种子、tm-3株系的t3代种子、tm-7株系的t3代种子、转空载体株系的t3代种子、出发植物。

取塑料花盆(32.5厘米直径*26厘米高)，每盆装土14.0kg，然后施用基肥，将催芽后的试验种子种植于花盆中，在露天条件下进行培养。

抽雄期植株的照片见图6。风吹之后，oe株系植株出现茎杆弯曲(说明茎杆机械强度变小)，tm-3株系植株、tm-7株系植株、野生型植株和转空载体株系植株仍保持直立(说明茎杆机械强度较硬)。

实施例3、靶基因的确认

一、5’race试验

初步预测序列表的序列1所示mirna的候选靶基因有8个(grmzm2g367668、grmzm2g169033、grmzm2g148937、grmzm2g178741、grmzm2g039381、grmzm2g062069、grmzm2g043300、grmzm2g004106)，依次对各个候选靶基因进行验证。

提取玉米b73的总rna，采用generacer^tmkit分别对各个候选靶基因进行5’race试验(包括靶基因mrna产物连接5’race接头，反转录成cdna、巢式pcr和特异片段的克隆及测序四个步骤，具体见说明书)。

结果表明，grmzm2g367668转录本和grmzm2g169033转录本上存在所述mirna的切割位点。grmzm2g367668转录本对应的dna如序列表的序列6所示，所述mirna的剪切位点位于grmzm2g367668转录本的第222-242位核苷酸之间。grmzm2g169033转录本对应的dna如序列表的序列7所示，所述mirna剪切位点位于grmzm2g169033转录本的第302-322位核苷酸之间。

二、northernblot试验

试验植株为：实施例2中制备的oe株系的t2代植株、tm-3株系的t2代植株、tm-7株系的t2代植株、转空载体株系的t2代植株、出发植物。

取幼苗期的试验植株的根，提取总rna，进行northernblot试验(针对grmzm2g169033转录本的探针如序列表的序列8所示，针对grmzm2g367668转录本的探针如序列表的序列9所示。

结果见图7。oe株系植株中，grmzm2g169033转录本和grmzm2g367668转录本水平明显下降，tm-3株系植株和tm-7株系植株中，grmzm2g169033转录本和grmzm2g367668转录本水平明显升高。结果表明，grmzm2g169033转录本和grmzm2g367668转录本为所述mirna的靶基因。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>培育具有不同木质素含量的转基因植物的方法

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