培育低镉积累水稻的方法及其相关材料的用途与流程

文档序号：17549139发布日期：2019-04-30 18:07阅读：673来源：国知局

本发明涉及生物技术领域中培育低镉积累水稻的方法及其相关材料的用途。

背景技术：

镉，是一种广泛分布于自然界的有毒类金属元素，土壤镉污染可导致环境退化以及农作物产量和品质下降。土壤-作物-食物的迁移被列为人类对环境中镉元素摄取的首要途径，进入农作物的镉通过食物链进入人体，进而诱发肝癌、皮肤癌或膀胱癌等，还会诱发畸胎，从而危害人体健康。

水稻推广面积大，亩产量高，是我国的三大主粮之一。近年来，随着工农业的飞速发展，我国稻米镉污染问题日益严重，全国稻田土壤和稻米受镉污染的案例不断增多。以昆明市的安宁县等地为例，稻米中镉的含量范围达0.01-0.51mg/kg，个别地区籽粒镉含量超过标准1.6倍，水稻镉污染正向人们步步逼近，严重威胁人们的健康和生命安全，控制农产品中镉元素水平对于降低人类的镉暴露风险具有重要意义。

鉴于镉在环境中的广泛存在，且目前还没有十分有效的方法原位去除土壤和地下水中的镉的方法，通过生物技术手段降低水稻籽粒中镉的积累具有重大意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何调控生物镉积累。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种培育低镉积累水稻的方法和一种降低水稻对镉的积累的方法。

本发明所提供的培育低镉积累水稻的方法，包括抑制或降低目的水稻中oscd1/2基因表达，得到低镉积累水稻，所述目的水稻为含有所述oscd1/2基因的水稻，所述低镉积累水稻对镉的积累量小于所述目的水稻对镉的积累量；

所述oscd1/2基因编码名称为oscd1/2的蛋白质，所述oscd1/2为a)或b)：

a)氨基酸序列是seqidno.2或seqidno.4的蛋白质；

b)将seqidno.2或seqidno.4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有调控生物镉积累活性的由a)衍生的蛋白质。

上述培育低镉积累水稻的方法，换句话说，可为降低水稻对镉的积累的方法。

本发明所提供的降低水稻对镉的积累的方法，包括抑制或降低目的水稻中oscd1/2基因表达，使所述目的水稻对镉的积累降低，所述目的水稻为含有所述oscd1/2基因的水稻；

所述oscd1/2基因编码名称为oscd1/2的蛋白质，所述oscd1/2为a)或b)：

a)氨基酸序列是seqidno.2或seqidno.4的蛋白质；

b)将seqidno.2或seqidno.4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有调控生物镉积累活性的由a)衍生的蛋白质。

上述方法中，氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质的名称为oscd1，氨基酸序列是seqidno.4的蛋白质的名称为oscd2。seqidno.2和seqidno.4都由457个氨基酸残基组成，seqidno.2和seqidno.4只有一个氨基酸残基(第449位氨基酸残基)的差异，seqidno.2的第449位氨基酸残基为缬氨酸残基，seqidno.4的第449位氨基酸残基为天冬氨酸残基，其它氨基酸残基相同。

上述方法中，所述oscd1/2来源于水稻。oscd1可来源于日本晴，oscd2可来源于9311。

上述方法中，所述目的水稻可为粳稻或籼稻，如日本晴、9311等。

上述方法中，所述抑制或降低目的水稻中oscd1/2基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

上述方法中，所述抑制或降低目的水稻中oscd1/2基因表达可通过crispr-cas9系统实现。所述crispr-cas9系统包括表达靶向oscd1/2基因的sgrna的载体。所述sgrna可为核苷酸序列为5'-gccuggucgcaauuguaucc-3'的rna(名称为cr-1)，核苷酸序列为5'-cuucucggcguucgaguca-3'的rna(名称为cr-2)，核苷酸序列为5'-caagcacucccccgaguac-3'的rna(名称为cr-3)。

上述方法中，所述oscd1/2基因可为如下1)-3)中任一所述的dna分子：

1)编码序列是seqidno.1第1-1374位核苷酸的dna分子；

2)编码序列是seqidno.3第1-1374位核苷酸的dna分子；

3)与1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述oscd1/2的dna分子。

上述方法中，seqidno.1和seqidno.3均由1374个核苷酸组成，seqidno.3和seqidno.4只有一个核苷酸(第1346位核苷酸)的差异，seqidno.1的第1346位核苷酸为t，seqidno.3的第1346位核苷酸为a，其它核苷酸相同。

上述方法中，3)中，90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性的dna分子。

本文中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，在整个水稻植株、水稻植株地上部分、水稻植株地下部分、水稻籽粒、水稻糙米和/或水稻麸皮中，所述低镉积累水稻对镉的积累量小于所述目的水稻对镉的积累量。

上述oscd1/2或与所述oscd1/2相关的生物材料在调控生物镉积累中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述生物材料可为下述b1)至b16)中的任一种：

b1)核酸分子，所述核酸分子为d11、d12或d13；所述d11为编码所述oscd1/2的核酸分子，所述d12为能敲除所述oscd1/2的基因的核酸分子，所述d13为能沉默所述oscd1/2的基因的核酸分子；

b2)含有b11、b12或b13所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

b13)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

b14)含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

b15)含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b16)含有b4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

上述应用中，所述d12具体可为上述cr-1、上述cr-2或上述cr-3。

调控oscd1/2基因表达的物质在调控生物镉积累中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为提高所述基因的表达也可为抑制或降低所述基因表达。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂(如上述cr-1、上述cr-2或上述cr-3)。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

上述应用中，所述生物可为c1-c11中的任一种：

c1、真核细胞生物；

c2、植物；

c3、单子叶植物；

c4、禾本科植物；

c5、稻属植物；

c6、水稻；

c7、粳稻或籼稻；

c8、双子叶植物；

c9、微生物；

c10、酵母；

c11、酿酒酵母。

本申请的发明人通过实验首次发现蛋白质oscd1/2与镉积累相关，抑制或降低目的水稻中oscd1/2基因表达，可得到低镉积累水稻，降低食品风险。

附图说明

图1为重组酵母平板镉抗性分析。左侧图片为重组酵母w303-oscd1、w303-oscd2和w303-vec在不含镉的培养基中的生长情况，右侧图片为重组酵母w303-oscd1、w303-oscd2和w303-vec在含30μmcdcl2的培养基中的生长情况。

图2为重组酵母w303-oscd1、w303-oscd2和w303-vec镉含量测定。“*”表示与w303-vec相比具有显著差异(p＜0.05)。

图3为oslcd1基因缺失突变体—oslcd1基因缺失cr-1植株的pcr扩增产物序列和野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域的pcr扩增产物序列比对结果。上面的序列为野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域的pcr扩增产物序列，下面的序列为oslcd1基因缺失cr-1植株的扩增产物的核苷酸序列。

图4为oslcd1基因缺失突变体—oslcd1基因缺失cr-2植株的pcr扩增产物序列和野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域pcr扩增产物序列比对结果。上面的序列为oslcd1基因缺失cr-2植株的扩增产物的核苷酸序列，下面的序列为野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域的pcr扩增产物序列。

图5为oslcd1基因缺失突变体—oslcd1基因缺失cr-3植株的pcr扩增产物序列和野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域pcr扩增产物序列比对结果。上面的序列为oslcd1基因缺失cr-3植株的扩增产物的核苷酸序列，下面的序列为野生型水稻日本晴的oscd1基因的相应区域的pcr扩增产物序列。

图6为野生型日本晴和oslcd1基因缺失突变体分别在0μmcdcl2和60μmcdcl2处理7天后的表型。

图7为野生型日本晴和oslcd1基因缺失突变体分别在0μmcdcl2和60μmcdcl2处理7天后地上部分总镉含量测定。“*”表示与野生型水稻日本晴相比具有显著差异(p＜0.05)。

图8为野生型日本晴和oslcd1基因缺失突变体分别在0μmcdcl2和60μmcdcl2处理7天后根部总镉含量测定。“*”表示与野生型水稻日本晴相比具有显著差异(p＜0.05)。

图9为野生型日本晴和oslcd1基因缺失突变体分别在0μmcdcl2和1.8mg/kgcdcl2处理后糙米镉含量测定。“*”表示与野生型水稻日本晴相比具有显著差异(p＜0.05)。

图10为野生型日本晴和oslcd1基因缺失突变体分别在0μmcdcl2和1.8mg/kgcdcl2处理后麸皮镉含量测定。“*”表示与野生型水稻日本晴相比具有显著差异(p＜0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值±标准差，采用t检验的方法进行差异显著性分析。

下述实施例中所用的质粒pag413gal-ccdb(zhenyanhe.etal.anaquaporinpvtip4；1frompterisvittatamaymediatearseniteuptake.newphytologist(2015)。oi:10.1111/nph.13637)，公众可从中国科学院植物研究所获得该质粒，以重复本申请实验。

本申请的发明人从水稻中发现了两个镉积累相关蛋白oscd1和oscd2。oscd1的氨基酸序列如序列表的序列2(seqidno.2)所示，将编码oscd1蛋白的基因命名为oscd1基因，其cds(编码序列)如序列表的序列1(seqidno.1)。oscd1基因来源于日本晴。

oscd2的氨基酸序列如序列表的序列4(seqidno.4)所示，将编码oscd2蛋白的基因命名为oscd2基因，其cds(编码序列)如序列表的序列3(seqidno.3)。oscd2基因来源于9311。

其中，seqidno.1和seqidno.3均由1374个核苷酸组成，seqidno.3和seqidno.4只有一个核苷酸(第1346位核苷酸)的差异，seqidno.1的第1346位核苷酸为t，seqidno.3的第1346位核苷酸为a，其它核苷酸相同。seqidno.2和seqidno.4都由457个氨基酸残基组成，seqidno.2和seqidno.4只有一个氨基酸残基(第449位氨基酸残基)的差异，seqidno.2的第449位氨基酸残基为缬氨酸(val)残基，seqidno.4的第449位氨基酸残基为天冬氨酸残基(asp)，其它氨基酸残基相同。

本申请中，将oscd1和oscd2统称为oscd1/2。

实施例1、oscd1/2是镉积累相关蛋白及其在调控酵母镉积累中的应用

1、酵母表达载体的构建

a、分别提取水稻日本晴和9311叶片的总rna。

b、分别以步骤a提取的总rna反转录为cdna，得到日本晴的cdna和9311的cdna。

c、以日本晴的cdna为模板，用oscd1s和oscd1a组成的引物对进行pcr扩增，得到oscd1的pcr扩增产物。oscd1s：5’-atggaggtgttctactacct-3’；

oscd1a：5’-ttaaggattcagtggctcat-3’。

以9311的cdna为模板，用上述oscd1s和oscd1a组成的引物对进行pcr扩增，得到oscd2的pcr扩增产物。

d、以oscd1的pcr扩增产物为模板，采用oscd1s1和oscd1a1组成的引物对，得到同源重组用的oscd1的pcr扩增产物。

方框标记的序列为与pag413gal-ccdb质粒发生同源重组的序列，分别为针对pag413gal-ccdb质粒的xbai酶切位点上游的部分序列的同源臂和针对pag413gal-ccdb质粒的xhoi酶切位点下游的部分序列的同源臂，所以pcr扩增产物可以与pag413gal-ccdb质粒发生同源重组，用xbai和xhoi酶切位点之间的序列取代pag413gal-ccdb质粒的xbai和xhoi酶切位点之间的小片段。

以oscd2的pcr扩增产物为模板，采用上述oscd1s1和oscd1a1组成的引物对，得到同源重组用的oscd2的pcr扩增产物。

e、用限制性内切酶xbai和xhoi双酶切pag413gal-ccdb质粒，回收骨架载体(约13kb)。

f、将同源重组用的oscd1的pcr扩增产物和步骤e的骨架载体进行重组连接(采用cloneez重组克隆试剂盒并按说明书进行)，得到重组质粒pag413-oscd1。测序结果表明pag413-oscd1是将pag413gal-ccdb的xbai和xhoi识别位点间的小片段替换为seqidno.1所示的oscd1基因，并保持pag413gal-ccdb的其它核苷酸不变得到的重组载体。

将同源重组用的oscd2的pcr扩增产物和步骤e的骨架载体进行重组连接(采用cloneez重组克隆试剂盒并按说明书进行)，得到重组质粒pag413-oscd2。测序结果表明pag413-oscd2是将pag413gal-ccdb的xbai和xhoi识别位点间的小片段替换为seqidno.3所示的oscd2基因，并保持pag413gal-ccdb的其它核苷酸不变得到的重组载体。

2、酵母转化得到重组酵母

将构建好的pag413-oscd1和pag413-oscd2分别单独转入酿酒酵母w303-1a(北京中原公司)中，得到含有oscd1基因的重组酵母(命名为重组酵母w303-oscd1)和含有oscd2基因的重组酵母(命名为重组酵母w303-oscd2)。酵母转化所用的方法可参考文献：adamsa,gottschlingde,kaiserca,stearnst.1997.methodsinyeastgenetics.newyork,usa:coldspringharborlaboratorypress；gietzrd,schiestlrh.1995.transformingyeastwithdna.molecularandcellularbiology5:255-269。同时将pag413gal-ccdb转入酿酒酵母w303-1a得到含有pag413gal-ccdb的重组酵母，命名为重组酵母w303-vec，作为转空载体酵母对照。

3、重组酵母镉转运能力分析

a、平板镉抗性分析

将步骤2的重组酵母分别单独接种于sd-his(含有2％葡萄糖)液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养至od600＝1.0。离心收集重组酵母细胞，用无菌水梯度稀释重组酵母至od600分别为1.0，0.1，0.01，0.001，得到重组酵母悬浮液。将不同浓度的2μl重组酵母悬浮液依次接种于无镉(0μmcdcl2)或含30μmcdcl2的sd-his(含有2％半乳糖)固体培养基平板上。结果见图1，在不含镉的培养基上，重组酵母w303-oscd1(转oscd1基因酵母)、重组酵母w303-oscd2(转oscd2基因酵母)和重组酵母w303-vec(转空载体酵母)生长无明显差异；而oscd1基因和oscd2基因的诱导表达则导致重组酵母w303-oscd1和重组酵母w303-oscd2在无镉条件下生长轻微减弱且对30μmcdcl2敏感，而重组酵母w303-vec则仍对30μmcdcl2有较强的抗性。这说明oscd1和oscd2会使酵母对镉敏感。

b、重组酵母镉含量测定

将二次活化的步骤2的重组酵母接种于sd-his(含有2％半乳糖)液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养至od600＝1.0，向培养液中加入cdcl2并使其终浓度为60μm，培养24h时后分别取菌液离心，收集重组酵母。将收集的重组酵母用超纯水洗三次后放入烘箱80℃烘6h，称干重。将称过的材料放入消煮管加入混合酸(硝酸：浓硫酸：高氯酸＝4:1:0.5，消煮所用得酸均为优级纯)1ml，冷消煮过夜，250℃消煮-4h后定容至20ml，用电感耦合等离子体发射光谱仪icap6300(thermoelectroncorporation,usa)测定镉含量。

检测结果如图2所示，在半乳糖诱导培养基中，重组酵母w303-oscd1(转oscd1基因酵母)、重组酵母w303-oscd2(转oscd2基因酵母)在60μmcdcl2处理24h条件下镉含量均显著高于重组酵母w303-vec(转空载体酵母)。这说明，重组酵母w303-oscd1(转oscd1基因酵母)、重组酵母w303-oscd2(转oscd2基因酵母)对镉敏感是因为镉的吸收增加，表明oscd1和oscd12有镉转运的能力，均是镉积累相关蛋白。

实施例2、培育低镉积累水稻

一、基于crispr/cas9技术的oscd1基因敲除水稻的创建

1、sgrna表达载体的构建

单向导rna(singleguiderna)靶点序列的设计根据水稻镉转运蛋白oscd1的基因组序列，设计3个靶向oslcd1的sgrna，其名称分别为cr-1、cr-2和cr-3，同时将设计好的grna靶点序列进行水稻基因组序列比对，以排除非特异性靶位点。cr-1的核苷酸序列为5'-gccuggucgcaauuguaucc-3'，靶向于oscd1基因的seqidno.1的第527-546位(靶位点序列)；cr-2的核苷酸序列为5'-cuucucggcguucgaguca-3'，靶向于oscd1基因的seqidno.1的第423-441位(靶位点序列)；cr-3的核苷酸序列为5'-caagcacucccccgaguac-3'，靶向于oscd1基因的seqidno.1的第354-372位(靶位点序列)。

利用百格crispr/cas载体构建试剂盒(cat#bgk03)按照其说明书利用crispr/cas载体bgk03分别构建cr-1的crispr/cas重组表达载体、cr-2的crispr/cas重组表达载体和cr-3的crispr/cas重组表达载体，其名称分别为cripsr-cr-1(表达cr-1)，cripsr-cr-2(表达cr-2)和cripsr-cr-3(表达cr-3)。

2、转基因水稻的获得

1)、水稻成熟胚愈伤组织的诱导

将水稻日本晴种子经70％的乙醇消毒1分钟后，用无菌水清洗3-5次。用灭菌液(30％naclo，2％tween20)溶液搅拌消毒15分钟，无菌水清洗5次，浸泡过夜后用滤纸吸干。将灭菌后的种子接种于n6d培养基上，培养10-15天诱导愈伤组织，然后去掉胚芽。

2)、农杆菌的培养

将构建好的三个靶点的crispr/cas重组表达载体cripsr-cr-1，cripsr-cr-2和cripsr-cr-3分别单独导入农杆菌菌株c58(武汉淼灵生物科技有限公司)，得到重组农杆菌，将含有cr-1编码基因的重组农杆菌命名为cr-1/c58，含有cr-2编码基因的重组农杆菌命名为cr-2/c58，含有cr-3编码基因的重组农杆菌命名为cr-3/c58。挑取重组农杆菌单克隆接种于yeb培养基中，28℃培养至od600为0.5左右。

3)、水稻转化

将步骤2的重组农杆菌侵染日本晴愈伤组织，在黑暗，25℃条件下共培养3天后，在含有400mg/l的潮霉素筛选培养基上筛选。筛选抗性愈伤组织在含有50mg/l预分化培养基上培养10天左右，将预分化的愈伤组织转移至分化培养基上光照培养。一个月左右得到转基因植株，将重组农杆菌cr-1/c58介导转化获得的日本晴转基因植株命名为cr-1/c58转基因植株，重组农杆菌cr-2/c58介导转化获得的日本晴转基因植株命名为cr-2/c58转基因植株，重组农杆菌cr-3/c58介导转化获得的日本晴转基因植株命名为cr-3/c58转基因植株。分别以转基因植株和日本晴(野生型水稻)的基因组dna为模板，pcr扩增包括剪切位点的基因组dna片段，对扩增产物进行测序检测oscd1基因的敲除情况。cr-1/c58转基因植株用cr-1-f和cr-1-r进行pcr扩增，cr-2/c58转基因植株和cr-3/c58转基因植株用cr-2/3-f和cr-2/3-r进行pcr扩增。其中，cr1-f：5'gagaggttttgattcacaatggctg3'，cr1-r：5'tgcaaccttgaactgggacatcaaa3'；cr2/3-f：5'ccggggactggctgcaagggccgta3'，cr2/3-r：5'ttgttgtgctccgcgacgagccatg3'。选择测序结果表明不含oscd1基因的cr-1/c58转基因植株、cr-2/c58转基因植株和cr-3/c58转基因植株。将不含oscd1基因的cr-1/c58转基因植株命名为oslcd1基因缺失cr-1植株，将不含oscd1基因的cr-2/c58转基因植株命名为oslcd1基因缺失cr-2植株，将不含oscd1基因的cr-3/c58转基因植株命名为oslcd1基因缺失cr-3植株。oslcd1基因缺失cr-1植株的cr1-f和cr1-r扩增产物与野生型水稻日本晴的cr1-f和cr1-r扩增产物的核苷酸序列比对结果如图3所示，oslcd1基因缺失cr-1植株在oscd1基因相应区域缺失了一个核苷酸“a”(具体见标记“61”那行)，造成移码突变，从而将oscd1基因敲除。oslcd1基因缺失cr-2植株的cr2/3-f和cr2/3-r扩增产物的核苷酸序列与野生型水稻日本晴的cr2/3-f和cr2/3-r扩增产物的核苷酸序列比对结果如图4所示，oslcd1基因缺失cr-2植株在oscd1基因相应区域缺失了一个核苷酸“g”(具体见标记“361”那行)，造成移码突变，从而将oscd1基因敲除。oslcd1基因缺失cr-3植株的cr2/3-f和cr2/3-r扩增产物的核苷酸序列与野生型水稻日本晴的cr2/3-f和cr2/3-r扩增产物的核苷酸序列比对结果如图5所示，oslcd1基因缺失cr-3植株在oscd1基因相应区域缺失了一个核苷酸“a”(具体见标记“301”那行)，造成移码突变，从而将oscd1基因敲除。

3、幼苗表型鉴定

将oslcd1基因缺失cr-1植株、oslcd1基因缺失cr-2植株和oslcd1基因缺失cr-3植株的幼苗与野生型水稻日本晴的同期幼苗同时放置于培养箱中30℃正常光照培养5d,然后分别置于60μm的cdcl2和0μm的cdcl2的培养液中处理7天后观察。表型照片见图6。在含0μm的cdcl2的培养液中，oslcd1基因缺失cr-1植株(图6中以cr-1表示)、oslcd1基因缺失cr-2植株(图6中以cr-2表示)和oslcd1基因缺失cr-3植株(图6中以cr-3表示)的生长情况均与野生型日本晴(图6中以nip表示)的生长情况一致。oslcd1基因缺失cr-1植株(图6中以cr-1表示)、oslcd1基因缺失cr-2植株(图6中以cr-2表示)和oslcd1基因缺失cr-3植株(图6中以cr-3表示)在含60μm的cdcl2的培养液中的生长情况显著优于野生型日本晴(图6中以nip表示)。说明缺失表达oslcd1基因在正常生长条件下并不影响水稻生长，但在cdcl2处理条件下可显著增强水稻的镉抗性，缓解镉处理对水稻生长的抑制。

将培养7天后的植株从培养液中取下，每个植株分别进行以下操作：用超纯水洗三次后分别将地上部分和地下部分(根部)放入烘箱，80℃烘6h，称干重。将称过的材料放入消煮管加入混合酸[硝酸：浓硫酸：高氯酸＝4:1:0.5(体积比)，均为优级纯]1ml，室温放置冷消煮过夜(加入酸后室温静置称为冷消煮)，然后250℃消煮4h，用蒸馏水定容至20ml，滤纸过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪icap6300(thermoelectroncorporation,usa)测定镉含量。

根部总镉含量见图7，地上部分总镉含量见图8。与野生型水稻日本晴(图7和8中以nip表示)相比，在60μmcdcl2条件下培养7天，三个oslcd1基因缺失突变体—oslcd1基因缺失cr-1植株、oslcd1基因缺失cr-2植株和oslcd1基因缺失cr-3植株(图7和8中分别以cr-1、cr-2和cr-3表示)根部和地上部分总镉含量均降低，结果表明，oslcd1基因缺失突变体在含有cdcl2的环境中的总镉含量显著低于野生型水稻日本晴。

4、籽粒镉量的鉴定

将oslcd1基因缺失cr-1植株、oslcd1基因缺失cr-2植株和oslcd1基因缺失cr-3植株的幼苗与野生型水稻日本晴的同期幼苗，插秧到含有0.18mg/kg的cdcl2的土壤中，同时进行0.18mg/kg的cdcl2处理至成熟后，收获籽粒。每个植株选取50粒籽粒，三个重复进行以下操作：用超纯水洗三次后将籽粒放入烘箱，80℃烘6h，将籽粒分为糙米和麸皮两部分，称干重。将称过的材料放入消煮管加入混合酸[硝酸：浓硫酸：高氯酸＝4:1:0.5(体积比)，均为优级纯]1ml，室温放置冷消煮过夜(加入酸后室温静置称为冷消煮)，然后250℃消煮4h，用蒸馏水定容至20ml，滤纸过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪icap6300(thermoelectroncorporation,usa)测定镉含量。

籽粒镉含量见图9和图10。与野生型水稻日本晴相比，在0.18mg/kgcdcl2处理条件下，三个oslcd1基因缺失突变体—oslcd1基因缺失cr-1植株、oslcd1基因缺失cr-2植株和oslcd1基因缺失cr-3植株糙米和麸皮总镉含量均显著降低。

sequencelisting

<110>中国科学院植物研究所

<120>培育低镉积累水稻的方法及其相关材料的用途

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1374

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1374)

<400>1

atggaggtgttctactacctcgtgttcgggggcctcgccgccgtggtggccgggctggag60

ctcggcaagagcgccaaggaccgggtcaccacctcccaggccttcaactccttcaagaac120

aactacgtcctcgtctactccctcatgatgtccggggactggctgcaagggccgtacgtg180

tactacctctacagccagtacggcttcgacaagggcgacatcggccgcctcttcatcgcc240

ggcttcggatcctccatgctcttcggcaccatcgtcggatcactcgccgacaagcagggg300

aggaagagggcgtgcatcacctactgcatcagctacatcctcagctgcatcaccaagcac360

tcccccgagtacaagatcctcatgatcggccgcgtgctcggaggaatcgccacctcgctg420

ctcttctcggcgttcgagtcatggctcgtcgcggagcacaacaagagaggttttgattca480

caatggctgtcgatcacattctccaaggctatatttcttggcaatggcctggtcgcaatt540

gtatccgggctatttgcaaacctgcttgccgacaacttgggctttggtcccgtggcacca600

tttgatgctgctgcatgcttcctggcaataggcatggctatcataatgtcttcatggagt660

gaaaactatggagacccatctgaaagcaaggatttgatgtcccagttcaaggttgcagcc720

aaagcaattgcttcagatgaaaaaattgcattactgggagccatacagtcattgtttgag780

ggctcaatgtatactttcgtcttcctctggactccggcgttgagcccaaatgaagaagat840

attcctcatggcttcatatttgccacattcatgctgtcatcaatgttgggtagctcaatt900

gctgcacgcttgttagcccgaaagctgaaggtcgaaggttatatgcagatcgtgtttaca960

atatcagccttcacccttttccttcctgttgtcaccaacattctagtgccaacttcttca1020

gtgaaaggaggtagcatctcatttggaggcactctgcagctgcttggtttctgtaccttt1080

gaggcatgcgttggcatattctggccatcaatcatgaagatgagatctcaatatattcct1140

gaggaggcaagaagcacaatcatgaatttcttccgcataccactgaacttgtttgtttgt1200

gtggtgctttacaatgtgaatgcattccctatcactgtcatgtttggcatgtgttctatc1260

ttcctcttcatggcggcaatcctgcagagacggctaatggttgtttctgacctacacaaa1320

tcatcgacaaaagcacaagagatggttgatgaagatgagccactgaatccttaa1374

<210>2

<211>457

<212>prt

<213>1

<400>2

metgluvalphetyrtyrleuvalpheglyglyleualaalavalval

151015

alaglyleugluleuglylysseralalysaspargvalthrthrser

202530

glnalapheasnserphelysasnasntyrvalleuvaltyrserleu

354045

metmetserglyasptrpleuglnglyprotyrvaltyrtyrleutyr

505560

serglntyrglypheasplysglyaspileglyargleupheileala

65707580

glypheglysersermetleupheglythrilevalglyserleuala

859095

asplysglnglyarglysargalacysilethrtyrcysilesertyr

100105110

ileleusercysilethrlyshisserproglutyrlysileleumet

115120125

ileglyargvalleuglyglyilealathrserleuleupheserala

130135140

pheglusertrpleuvalalagluhisasnlysargglypheaspser

145150155160

glntrpleuserilethrpheserlysalailepheleuglyasngly

165170175

leuvalalailevalserglyleuphealaasnleuleualaaspasn

180185190

leuglypheglyprovalalapropheaspalaalaalacyspheleu

195200205

alaileglymetalaileilemetsersertrpsergluasntyrgly

210215220

aspprosergluserlysaspleumetserglnphelysvalalaala

225230235240

lysalailealaseraspglulysilealaleuleuglyalailegln

245250255

serleuphegluglysermettyrthrphevalpheleutrpthrpro

260265270

alaleuserproasnglugluaspileprohisglypheilepheala

275280285

thrphemetleusersermetleuglyserserilealaalaargleu

290295300

leualaarglysleulysvalgluglytyrmetglnilevalphethr

305310315320

ileseralaphethrleupheleuprovalvalthrasnileleuval

325330335

prothrserservallysglyglyserileserpheglyglythrleu

340345350

glnleuleuglyphecysthrpheglualacysvalglyilephetrp

355360365

proserilemetlysmetargserglntyrileprogluglualaarg

370375380

serthrilemetasnphepheargileproleuasnleuphevalcys

385390395400

valvalleutyrasnvalasnalapheproilethrvalmetphegly

405410415

metcysserilepheleuphemetalaalaileleuglnargargleu

420425430

metvalvalseraspleuhislysserserthrlysalaglnglumet

435440445

valaspgluaspgluproleuasnpro

450455