调控基因表达的方法与流程

本发明涉及基因工程领域。具体而言，涉及通过基因组编辑技术修饰上游开放阅读框(uorf)，从而调控基因表达的方法。

背景技术：

基因表达在确定生物体的表型多样性方面发挥重要作用。人工操纵基因表达是优化工业生物、牲畜和作物的经济性状的关键。控制转录是基础的和常用的方法，转录物翻译成蛋白也可以通过多种手段进行精细的控制^[1]。真核生物的mrna中编码区之前存在一段前导序列(leadersequence)称为5′非翻译区(5′utr)。研究发现，部分5′非翻译区中包含可能发生翻译的开放阅读框(orf)，称为上游开放阅读框(uorf)。越来越多的证据表明，uorf的存在是调节重要蛋白编码基因翻译的关键机制^[2-5]。全基因组生物信息学分析表明，超过50％的人类mrna和约35％的拟南芥mrna含有至少一种推定的uorf。许多研究已经显示uorf通常抑制主orf(primaryorf，porf)的翻译。据报道，用反义寡核苷酸靶向uorf增加了porf的翻译效率^[4]。但是，生物信息学研究发现的绝大多数推定的uorf的生物学功能尚不清楚。最近的一项研究表明，uorf可用于优化植物免疫基因的翻译，从而在抗病性和细胞生长过程之间达到良好的平衡^[5]。这项研究很好地说明了翻译调控对关键基因功能的关键作用以及利用uorf改良植物性状的潜在能力。

发明概述

上游开放阅读框(uorf)的翻译调控正在成为控制许多真核生物基因功能的关键机制。本发明人证明对uorf进行基因组编辑是调控不同生物体基因表达的有效策略。所得到的经编辑的突变体可用于研究重要的生物学过程(例如，atbri1介导的油菜素内酯信号传递)或改善有价值的作物性状(例如抗坏血酸含量)。

附图说明

图1.crispr/cas9介导的atbri1的uorf的编辑增强atbri1的翻译。(a)wtuorf、突变体uorf和用于评估uorf对下游atbri1porf翻译的影响的双荧光素酶测定载体的示意图。(b)wt和突变形式的uorf对luc/ren活性(左)和mrna水平(右)的影响，用双重荧光素酶系统在孵育48小时的拟南芥原生质体中分析。uorfatbri1-luc与uorfatbri1-luc不同在于uatg(前者)突变为aaa(后者)。uorfatbri1-luc赋予的平均luc/ren活性和mrna水平归一化至uorfatbri1-luc的平均luc/ren活性和mrna水平(n＝3)。(c)crispr/cas9诱导的atbri1的uorf的两个纯合突变体的变化。与wt对照相比，两个突变体(uorfatbri1+g和uorfatbri1+t)中的uatg被单个g或t插入破坏。uorf序列以蓝色示出，sgrna靶向序列下划线示出，pam以粗体显示。(d)wt对照组、uorfatbri1+g和uorfatbri1+t组中atbri1转录物(上)和蛋白质(下)水平的比较。拟南芥actin2(at3g18780)用作qrt-pcr测定的内部对照(n＝3)。20s蛋白酶体α亚基g1(pag)在western印迹分析中用作上样对照。印迹下面的数字显示三种基因型中atbri1的相对量，wt对照的值主观地设定为1。(e)wt对照、uorfatbri1+g和uorfatbri1+t幼苗在2μm芸苔素内脂存在下黑暗中生长六天下胚轴长度(n＝10)。所有值代表平均值±s.d。*p＜0.05，***p＜0.00l；ns，双尾学生t检验无显著性差异。

图2.atvtc2的uorf的破坏及其对asa含量的影响。(a)crispr/cas9诱导的atvtc2两个uorf突变体中的序列变化。两个突变体携带37-核苷酸缺失(uorfatvtc2-1)或由1-核苷酸插入和9-核苷酸缺失组成的indel(uorfatvtc2-2)。uorf序列标记为蓝色，sgrna靶向序列加下划线，pam以粗体显示。(b)wt对照和纯合突变体uorfatvtc2-1和uorfatvtc2-2在t4代的叶片asa含量的比较。14日龄幼苗的莲座叶通过hplc进行asa测定。所显示的平均asa含量(±sd)各自由三次重复的测量计算。(c，d)atvtc2的wt和突变体uorf对luc/ren活性(c)和mrna水平(d)的影响，使用双荧光素酶报道系统在孵育48小时的拟南芥原生质体中评估。通过将atvtc2的wtuorf和uorfatvtc2-1和uorfatvtc2-2的突变uorf序列与luc编码区融合而分别产生uorfatvtc2-luc，uorfatvtc2-luc(-37bp)和uorfatvtc2-luc(-9/+1bp)。uorfatvtc2-luc(-37bp)和uorfatvtc2-luc(-9/+1bp)的平均luc/ren活性和mrna水平归一化至uorfatvtc2-luc(n＝3)的平均luc/ren活性和mrna水平。(e)通过qrt-pcr比较wt对照和uorfatvtc2-1和uorfatvtc2-2之间的atvtc2mrna水平。拟南芥actin2用作测定的内部对照(n＝3)。所有值均为±s.d。**p＜0.01，***p＜0.001；ns，双尾学生t检验无显著性差异。

图3.实验所用不同基因中的5′-前导序列。uorf下划线示出。uorf的推定的起始密码子阴影显示，主orf被标记为黑色。(a-d)：atbri1(at4g39400)(a)、atvtc2(at4g26850)(b)、lsggp1(lsat_1_v5_gn_7_113861)(c)和lsggp2(lsat_1_v5_gn_5_3140)(d)的5′-前导序列。

图4.使用双荧光素酶系统研究atbri1的wt和突变体uorf序列对下游orf的翻译和mrna水平的影响。(a)相对于atbri1的wtuorf序列，突变体uorfatbri1+g或uorfatbri1t的uorf序列显著增加luc/ren活性(下游orf翻译的指标)。进行了两个不同的实验(重复1和2)，获得了类似的结果。(b)三种构建体中luc/renmrna水平没有显著差异。基于三个单独的测定计算平均值(±sd)。ns，双尾学生t检验无显著性差异。

图5.推定的atvtc2、lsggp1和lsggp2蛋白的多重比对。星号、冒号和点分别表示相同的、高度保守的和弱保守的残基。

图6.crispr/cas9诱导lsggp1和lsggp2的突变uorf等位基因及其在t0幼苗中叶asa含量。(a)通过测序pcr扩增子鉴定lsggp1和lsggp2每个uorf突变体等位基因。wt序列在顶部提供，以方便比较。注意，t0幼苗包括纯合、杂合和双等位突变体三种类型。uorf序列为蓝色。sgrna靶向序列下划线示出，pam以粗体显示。插入的核苷酸显示为深红色。no.1、no.2或no.3表示每种突变体中植物的数量。(b)用对照莴苣幼苗(用空载体pkse401转化，n＝3)和携带lsggp1(n＝6)或lsggp2(n＝5)的突变体uorf等位基因的t0幼苗测量的asa含量。

图7.用基于二元载体的四个引物组检测无转基因突变体。(a)用于通过浸花法转化的crispr/cas9二元载体的示意图。使用黑色箭头指示的四对引物来检测无转基因突变体。(b，c)转基因植物的pcr结果。前四对引物没有产生条带的泳道表示无转基因突变体。设计f5/r5以扩增用作对照的atbri1片段。

图8.atbri1和atvtc2野生型和突变的5′-前导序列与35s启动子融合的序列。在每个合成的片段中，限制酶hindiii和ncoi的切割位点分别以绿色(粗体)和橙色(粗体)突出显示；35s启动子显示为黑色，uorf序列显示为红色以及uorf周围的序列显示为蓝色。

图9.chlh的基因组编辑产生的uorf减少chlh的翻译。(a)使用双荧光素酶报告系统评估的chlh的野生型和突变体(产生了uorf)对luc/ren活性的影响。chlh-c-tm与chlh-wt的不同之处在于acg突变为atg，chlh-c-am与chlh-wt的不同之处在于gtg突变为atg。将chlh-c-tm-luc和chlh-c-am-luc赋予的平均luc/ren活性归一化至chlh-wt-luc(n＝3)。(b)chlh表达下降对幼苗的影响。(c)chlh的5′前导序列。划线为潜在可以变为以atg起始的uorf。该基因5′前导序列有两个潜在uorf。第一个是把acg→atg(chlh-c-tm)；第二个是gtg→atg(chlh-g-am)。

图10.真核生物起始因子iso-4f的基因组编辑产生的uorf减少真核起始因子iso-4f的翻译。(a)使用双荧光素酶报告系统评估的真核起始因子iso-4f的野生型和突变体(产生了uorf)对luc/ren活性的影响。eif-m与eif-wt的不同之处在于acg突变为atg。由eif-m-luc赋予的平均luc/ren活性归一化至eif-wt-luc(n＝3)。(b)真核起始因子iso-4f的5′-前导序列。划线为潜在可以变为以atg起始的uorf。该基因5′前导序列有1个潜在uorf，是把acg→atg(eif-macg-atg)。

图11.细胞色素p450的基因组编辑产生的uorf减少细胞色素p450的翻译。(a)使用双荧光素酶报告系统评估的细胞色素p450的野生型和突变体(产生了uorf)对luc/ren活性的影响。cyto-m与cyto-wt的不同之处在于acg突变为atg。将cyto-m-luc赋予的平均luc/ren活性归一化至cyto-wt-luc(n＝3)。(b)细胞色素p450表达下降对除草剂(苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl，bsm))的响应的影响。(c)cyto的5′前导序列。划线为潜在可以变为以atg起始的uorf。该基因5′前导序列有1个，是把acg→atg(cyto-m)。

图12.spindly的基因组编辑产生的uorf减少spindly的翻译。(a)使用双荧光素酶报告系统评估的spindly的野生型和突变体(产生了uorf)对luc/ren活性的影响。spy-1c-tm与spy-wt的不同之处在于acg突变为atg，spy-2c-tm与spy-wt的不同之处在于acg突变为atg。由spy-1c-tm-luc和spy-2c-tm-luc赋予的平均luc/ren活性归一化至spy-wt-luc(n＝3)。(b-c)spindly表达下降对节间生长的影响。(d)spindly的5′前导序列。划线为潜在可以变为以atg起始的uorf。该基因5’-前导序列有两个潜在urof。第一个是把acg→atg(spy-1c-tm)；第二个是acg→atg(spy-2c-tm)。

图13.对photoperiodsensitivity5(se5)进行基因组编辑产生的uorf减少se5的翻译。(a)使用双荧光素酶报告系统评估的光敏素敏感性5(se5)的野生型和突变体(产生了uorf)对luc/ren活性的影响。通过acg突变为atg，se5-1c-tm与se5-wt不同，spy-2c-tm通过acg突变为atg而不同于se5-wt。将se5-1c-tm-luc和se5-2c-tm-luc赋予的平均luc/ren活性归一化至se5-wt-luc(n＝3)。(b)se5的表达下降对开花早晚的影响。(c)se5的5′前导序列。划线为潜在可以变为以atg起始的uorf。该基因5’-前导序列有两个潜在uorf。第一个是把acg→atg(se5-1c-tm)；第二个是acg→atg(se5-2c-tm)。

发明详述

一、定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组dna和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文称为“sambrook”)。

“基因组”不仅涵盖存在于细胞核中的染色体dna，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器dna。

如本文所用，“生物体”包括适于基因组编辑的任何生物体。生物体的实例包括但不限于，哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如水稻、玉米、小麦、高梁、大麦、大豆、花生、拟南芥等。

针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链rna或dna聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷或脱氧胞苷，“g”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“u”表示尿苷，“t”表示脱氧胸苷，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。

如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。

本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的rna(如mrna)。

本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。

“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。

调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。

“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的dna序列。

本发明可使用的启动子的实例包括但不限于聚合酶(pol)i、polii或poliii启动子。poli启动子的实例包括鸡rnapoli启动子。polii启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒立即早期(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复(rsv-ltr)启动子和猿猴病毒40(sv40)立即早期启动子。poliii启动子的实例包括u6和h1启动子。可以使用诱导型启动子如金属硫蛋白启动子。启动子的其他实例包括t7噬菌体启动子、t3噬菌体启动子、β-半乳糖苷酶启动子和sp6噬菌体启动子等。当用于植物时，可使用的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒35s启动子、玉米ubi-1启动子、小麦u6启动子、水稻u3启动子、玉米u3启动子和水稻肌动蛋白启动子等。

如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。

将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、rna等)或蛋白质“导入”生物体或细胞是指用所述核酸或蛋白质转化生物体或细胞，使得所述核酸或蛋白质在生物体或细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述生物体和其任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进基因组中。可用于将核酸分子或蛋白质导入生物体或细胞的方法包括但不限于：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)、基因枪法、peg介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化。

如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plantcutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单元。如本文所使用的，植物细胞包括原生质体和具有部分细胞壁的原生质体。植物细胞可以处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高级组织单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者能够再生成完整植物的细胞或细胞的集合。因此，在本文的实施方案中，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子被认为是一种“植物部分”。

如本文所使用的，术语“原生质体”是指细胞壁被完全或部分地除去、其脂双层膜裸露的植物细胞。典型地，原生质体是没有细胞壁的分离植物细胞，其具有再生成细胞培养物或整株植物的潜力。

植物“后代”包括植物的任何后续世代。

“经遗传修饰的植物”包括在其基因组内包含外源多核苷酸或修饰的基因或表达调控序列的植物。例如外源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。外源多核苷酸可单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。修饰的基因或表达调控序列为在植物基因组中所述序列包含单个或多个脱氧核苷酸取代、缺失和添加。

如本文所用，术语“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。这些特征可以是目视可见的，比如种子、植株的大小、叶片颜色等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的抗性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的抗性或产量等性状。

如本发明所用，“农艺性状”是指植物特别是作物植物的可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、抗旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、抗病性、除草剂抗性、抗寒性、抗盐性和分蘖数等。

二、通过uorf的基因组编辑调控基因表达

在一方面，本发明提供了一种调控细胞中靶蛋白表达的方法，所述靶蛋白的编码基因的5’非翻译区(5’-utr)中包含上游开放阅读框(uorf)，所述方法包括向所述细胞导入靶向所述uorf的基因组编辑系统，由此增加或减少或消除所述uorf对靶蛋白表达的抑制。

在一些实施方案中，其中导入靶向所述uorf的基因组编辑系统导致所述uorf中的一或更多个核苷酸的突变，例如一或更多个核苷酸的取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，其中所述一或更多个核苷酸的突变导致所述uorf的弱翻译起始密码子突变为强翻译起始密码子，或者所述突变导致所述uorf的强翻译起始密码子突变为弱翻译起始密码子，或者所述突变导致所述uorf不翻译。所述强翻译起始密码子例如是atg，所述弱翻译起始密码子例如是gtg、atc、acg、ttg或aag。一般而言，uorf从弱翻译起始密码子突变为强翻译起始密码子将可能加强uorf对靶蛋白表达的抑制，从而降低靶蛋白的表达水平；uorf从强翻译起始密码子突变为弱翻译起始密码子将可能减少uorf对靶蛋白表达的抑制，从而增加靶蛋白的表达水平；而如果所述uorf不被翻译，将可能消除其对靶蛋白表达的抑制，从而增加靶蛋白的表达水平。此外，翻译起始密码子如atg、gtg、atc、acg、ttg或aag具有不同程度的翻译起始能力，由此可以实现对靶蛋白表达的不同程度的调控。

在另一方面，本发明提供了一种调控细胞中靶蛋白表达的方法，包括向所述细胞导入靶向所述靶蛋白的编码基因的5′非翻译区(5′-utr)的基因组编辑系统，由此导致所述5′-utr中的一或更多个核苷酸的突变，所述突变导致5′-utr中形成上游开放阅读框(uorf)，其抑制靶蛋白表达。例如，通过单碱基编辑的方式，将基因5′-utr中的c替换成t，这样可以人为地产生在主开放阅读框上游的额外atg，形成人工uorf，从而调节靶蛋白表达。

本发明并不特别限制使用的基因组编辑系统，只要其能够实现对生物体或细胞基因组的精确编辑。例如，适于本发明使用的基因组编辑系统包括但不限于单碱基编辑(pbe)系统、crispr-cas9系统、crispr-cpf1系统、crispri系统、锌指核酸酶系统和talen系统。本领域技术人员能够根据本申请的教导选择或设计合适的基因组编辑系统。

crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统是在进化过程中产生的细菌用于防御外来基因入侵的免疫系统。目前已经被改造并广泛用于真核生物的基因组编辑。

crispr-cas9系统是指基于cas9核酸酶的基因组crispr编辑系统。“cas9核酸酶”和“cas9”在本文中可互换使用，指的是包括cas9蛋白或其片段(例如包含cas9的活性dna切割结构域和/或cas9的grna结合结构域的蛋白)的rna指导的核酸酶。cas9是crispr/cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)原核免疫系统的组分，能在向导rna的指导下靶向并切割dna靶序列形成dna双链断裂(dsb)。适用于本发明的crispr-cas9系统包括但不限于记载于shan，q.eta1.targetedgenomemodificationofcropplantsusingacrispr-cassystem.nat.biotechnol.31，686-688(2013)的系统。

“向导rna”和“grna”在本文中可互换使用。在crispr-cas9系统中，向导rna通常由部分互补形成复合物的crrna和tracrrna分子构成，其中crrna包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导crispr复合物(cas9+crrna+tracrrna)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导rna(sgrna)，其同时包含crrna和tracrrna的特征。

本发明的crispr-cas9系统可以包含以下之一：

i)cas9蛋白，和向导rna；

ii)包含编码cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导rna；

iii)cas9蛋白，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；或

v)包含编码cas9蛋白的核苷酸序列和编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体。

crispr-cpf1系统是基于cpf1核酸酶的crispr基因组编辑系统。cpf1与cas9的区别在于蛋白分子量较小，并且只需要crrna作为向导rna，pam序列也有所不同。适用于本发明的crispr-cpf1系统包括但不限于记载于tangetal.，2017的系统。

本发明的crispr-cpf1系统可以包含以下之一：

i)cpf1蛋白，和向导rna(crrna)；

ii)包含编码cpf1蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导rna；

iii)cpf1蛋白，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码cpf1蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；或

v)包含编码cpf1蛋白的核苷酸序列和编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体。

crispr干扰(crispri)是衍生自crispr-cas9系统的一种基因沉默系统，其使用的是核酸酶失活的cas9蛋白。此系统尽管并没有改变靶基因的序列，在本文范围内也定义为基因组编辑系统。适用于本发明的crispri系统包括但不限于sethandharish，2016中记载的系统。

本发明的crispri系统可以包含以下之一：

i)核酸酶失活的cas9蛋白，和向导rna；

ii)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导rna；

iii)核酸酶失活的cas9蛋白，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；或

v)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白的核苷酸序列和编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体。

单碱基编辑系统是最近基于crispr-cas9开发出的一种可以对基因组进行精确单碱基编辑的系统，其使用核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白。核酸酶失活的cas9(由于dna切割结构域的亚结构域hnh亚结构域和/或ruvc亚结构域的突变造成)保留grna指导的dna结合能力，胞苷脱氨酶可以催化dna上胞苷(c)的脱氨化作用形成尿嘧啶(u)。将核酸酶失活的cas9与胞苷脱氨酶融合，在向导rna的指导下，融合蛋白可以靶向植物基因组中的靶序列，由于cas9核酸酶活性缺失，dna双链不被切割，而融合蛋白中的脱氨酶结构域能够将cas9-向导rna-dna复合物形成中产生的单链dna的胞苷脱氨转换成u，再通过碱基错配修复实现c至t的取代。适用于本发明的单碱基编辑系统包括但不限于记载于zongetal.，2017的系统。

本发明的单碱基编辑系统可以包含以下之一：

i)核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白，和向导rna；

ii)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导rna；

iii)核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体；或

v)包含编码核酸酶失活的cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列和编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体。

在一些实施方案中，所述核酸酶失活的cas9蛋白相对于野生型cas9(化脓链球菌spcas9)包含氨基酸取代d10a和/或h840a。所述胞苷脱氨酶的实例包括但不限于：apobec1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(aid)、apobec3g或cda1。

“锌指核酸酶(zfn)”是通过将锌指dna结合结构域与dna切割结构域融合而制备的人工限制性酶。单个zfn的锌指dna结合结构域通常含有3-6个单独的锌指重复序列，每个锌指重复序列可以识别例如3bp。适用于本发明的zfn系统例如可以参考shuklaetal.，2009和townsendetal，2009的记载获得。

“转录激活因子样效应物核酸酶(talen)”是可以经工程化而可以切割特定dna序列的限制性酶，通常通过将转录激活因子样效应物(tale)的dna结合结构域与dna切割结构域融合而制备。tale经工程化后可以结合几乎任何想要的dna序列。适用于本发明的talen系统例如可以参考lietal.，2012的记载获得。

在本发明方法的一些实施方案中，其中所述细胞是哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫的细胞；家禽如鸡、鸭、鹅的细胞；植物包括单子叶植物或双子叶植物的细胞，特别是作物植物如水稻、玉米、小麦、高梁、大麦、大豆、花生，模式植物如拟南芥，蔬菜植物如莴苣的细胞。

在另一方面，本发明提供了一种经本发明的方法改造的细胞，其中所述细胞中靶蛋白的表达水平相对于未改造的细胞发生变化。

在一些实施方案中，其中所述细胞是植物细胞。

在另一方面，本发明提供了一种产生经遗传修饰的植物的方法，包括从本发明的经改造的植物细胞再生完整植物的步骤，其中所述经遗传修饰的植物中靶蛋白的表达水平相对于未经遗传修饰的植物发生变化。在一些实施方式中，所述靶蛋白的表达水平的变化导致所述植物性状优选农艺性状的变化，优选农艺性状的改良。所述植物包括但不限于单子叶植物或双子叶植物，特别是作物植物如水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、大豆、花生，模式植物如拟南芥，蔬菜植物如莴苣。

在一些具体实施方案中，所述植物中的靶蛋白是bri1。在一些具体实施方式中，所述bri1蛋白的编码基因是atbri1(拟南芥)。bri1表达的改变可能改变所述植物中油菜素内脂信号转导，从而改变相关性状。

在一些实施方式中，所述植物中的靶蛋白是gdp-l-半乳糖磷酸化酶(ggp)。在一些具体实施方式中，所述gdp-l-半乳糖磷酸化酶的编码基因是atvtc2(拟南芥)、lsggp1和lsggp2(莴苣)。ggp表达发生改变的经遗传修饰的植物中的抗坏血酸水平将相对于野生型对照发生变化，优选地，其抗坏血酸水平相对于野生型对照增加。

在一些实施方式中，本发明的所述经遗传修饰的植物是无转基因的。例如，通过基因组编辑系统的瞬时转化可以获得无转基因的经遗传修饰的植物。或者，在获得整合有外源转基因的经遗传修饰的植物之后，通过后代的遗传分离可以获得不含转基因的经遗传修饰的植物。

在一些实施方案中，植物中的靶蛋白编码基因是chlh，例如水稻chlh基因。当t-dna同时(纯合)破坏基因的功能，chlh表达的改变可能影响叶绿素合成，产生白化幼苗。

在一些实施方案中，植物中的靶蛋白的编码基因是真核起始因子iso-4f基因。真核起始因子iso-4f表达的改变可以提供对特定病毒的抗性。

在一些实施方案中，植物中的靶蛋白编码基因是细胞色素p450基因。细胞色素p450表达的改变可使幼苗对除草剂(苄嘧磺隆(bsm))更敏感，显示生长缓慢。

在一些实施方案中，植物中的靶蛋白编码基因是spindly基因，例如水稻spindly基因。水稻中spindly表达的改变可以增加营养生长期间的节间生长。

在一些实施方案中，植物中的靶蛋白编码基因是photoperiodsensitivity5(se5)，例如水稻se5基因。在长日照条件下，血红素氧合酶高度相似性hy1表达的变化可能表现出早期开花。

在另一方面，本发明涵盖通过本发明的方法产生的经遗传修饰的植物或其后代。

实施例

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

材料和方法

质粒构建

为了产生atbri1和atvtc2的uorf突变体，pyao：hspcas9-atbri1uorf-sgrna和pyao：hspcas9-atvtc2uorf-sgrna如前所述制备^[17]。简言之，使用表1中列出的引物和bsai消化的atu6-26-sk(来源)构建atu6-26-atbri1uorf-sgrna和atu6-26-atvtc2uorf-sgrna，然后用spei和nhei消化，克隆到spei消化的pyao：hspcas9中。

为了产生lsggp1和lsggp2的uorf突变体，如前所述^[18]构建了pkse401-lsggpluorf-sgrna和pkse401-lsggp2uorf-sgrna。bsai消化的pkse401用于插入用表1中列出的引物制备的sgrna编码序列。

为了开发双重荧光素酶测定中使用的构建体，商业上合成(generaybio，beijing，china)35s启动子融合的各基因的wt和突变形式的5′-前导序列(图8)。然后将它们克隆到用hindiii和ncoi消化的pgreenii0800-luc19载体^[19]。通过dna测序验证克隆的正确性。

表1拟南芥中两个基因和莴苣中两个基因的靶位点以及用于构建sgrna的引物序列。

生成atbri1和atvtc2的uorf突变体

使用载体pyao：hspcas9-atbri1uorf-sgrna和pyao：hspcas9-atvtc2uorf-sgrna通过浸花法转化拟南芥(生态型col-0)，产生atbri1和atvtc2的uorf突变体。通过对用靶向位点特异性引物(表2)扩增的pcr产物进行测序验证所得突变体。无转基因突变体通过使用四对引物(表2)进行pcr来选择，并通过其缺乏抗生素抗性来证实。

表2使用的引物

拟南芥生长和原生质体转染

从在1/2ms培养基上生长的14-d老幼苗中分离拟南芥原生质体^[20]。按照先前报道的方案^[21]，用pgreenii0800-p35s：atbri1-5′-leader-luc，pgreenii0800-p35s：atvtc2-5′-leader-luc或携带突变形式的相关5′-前导序列的构建体转染。在每次转染中，使用20μg质粒dna和约5×10⁵个原生质体。转染两天后，通过100g离心5分钟收获原生质体。luc/ren活性用dual-reporterassaysystem(promega，madison，usa)测量。相对于由pgreenii0800-p35s：atbri1-5′-leader-luc或pgreenii0800-p35s：atvtc2-5′-leader-luc产生的那些，计算由具有突变的5′-前导序列的构建体赋予的luc/ren水平。

rna制备和qrt-pcr

使用ezna^tm植物rna试剂盒(omegabio-tek，norcross，usa)从所需的原生质体和植物样品中提取总rna。使用m-mlv逆转录酶(promega，madison，usa)进行逆转录。随后，按照供应商的说明，使用ssofastevagreensupermix试剂盒(bio-rad，hercules，usa)进行qrt-pcr。所用引物列于表2。

莴苣的农杆菌介导转化以及lsggp1和lsggp2uorf突变体的制备

将卷心莴苣(lactucasatival.var.capitata)种子用70％乙醇表面灭菌1分钟，然后浸入1.0％次氯酸钠溶液中15分钟，然后播种在用0.8％bacto琼脂固化并补充3％蔗糖的ms培养基上(bd，sparks，usa)。将培养皿在16小时光照(150μmol·m^-2s^-1)和8小时黑暗的光周期和25℃下孵育7天。将子叶外植体从萌发的幼苗中无菌切除并倒置在ms共培养培养基(补充30g/l蔗糖、0.8％植物琼脂、0.1mg/lα-萘乙酸和0.5mg/l6-苄氨基嘌呤)两天。然后将外植体与携带所需构建体(pkse401-lsggp1uorf-sgrna、pkse401-lsggp2uorf-sgrna或空载体pkse401)的农杆菌悬浮液温育10分钟。共培养后，用无菌滤纸除去外植体中的过量农杆菌细胞。将处理过的外植体再次倒置在ms共培养培养基上，并在25℃下在黑暗中孵育48小时。然后将外植体转移到ms选择培养基(补充有30g/l蔗糖，0.8％植物琼脂，0.1mg/lα-萘乙酸，0.5mg/l6-苄氨基嘌呤，40mg/l卡那霉素一硫酸盐和250mg/l羧苄青霉素)，并在25℃下在16小时光(150μmolm^-2s^-1)和8小时暗循环下孵育。15天后，将愈伤组织(直径4-8毫米)在新鲜的ms选择培养基上传代培养。10天后，将再生出芽的愈伤组织转移到含有减少量的α-萘乙酸(0.026mg/l)和6-苄基氨基嘌呤(0.046mg/l)的ms选择培养基中。当芽达到3cm时，将其转移到ms生根培养基(补充有15g/l蔗糖，0.1mg/l3-吲哚乙酸和250mg/l羧苄青霉素的1/2ms)用于根诱导。具有发育良好的芽和根的小植株各自如上所述检查uorf突变。

蛋白质提取和蛋白质凝胶印迹分析

使用含有50mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl，0.1％np40，4m尿素和1mmpmsf的提取缓冲液从14天龄的拟南芥幼苗中提取蛋白质。用抗atbri1抗体^[22](1∶1500稀释)或抗pag1抗体^[23](1∶10,000稀释)进行蛋白质凝胶印迹分析。使用的二抗是与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗体，其反应信号使用增强的化学发光溶液(millipore，billerica，usa)显现。

测定asa含量

asa含量通过高效液相色谱(hplc)按照先前详细的方案^[24]测定。简言之，将叶组织在液氮中粉碎成粉末。使用提取缓冲液溶解粉末，该缓冲液含有最终体积为100mlmilli-q水的74.45mgedta、286.65mgtcep和5ml98％正磷酸。将悬浮液涡旋30秒，然后在室温下孵育2分钟，然后在冰上孵育10分钟。随后，将其以12,000g在4℃离心30分钟，保留上清液并使用4mm亲水ptfe注射器过滤器过滤。使用pursuitxrsc18c18000250x046柱(agilent)测定过滤样品，并用紫外线(244nm)检测。对于atvtc2的纯合uorf突变体，测定了三个生物重复，每个含有来自6株幼苗的叶面组织。对于lsggp1或lsggp2的t0uorf突变体，使用叶组织分别测定具有突变等位基因的幼苗的asa含量。在asa测量期间，将具有pkse401的空t-dna的小植株用作对照。

统计分析

所有数值都表示为±s.d。使用双尾student′st检验分析不同样品之间的统计学差异。

实施例1双荧光素酶报告基因测定确定uorfatbri1

作为概念证明，发明人分析了位于atbri1基因的5′-前导序列中的推定的uorf，atbri1产物是拟南芥中植物激素油菜素内脂(br)的受体^[6]。该uorf(命名为uorfatbri1)以atg开始，长21bp，位于编码atbri1的porf上游58bp(图1a和图3a)。

采用了双荧光素酶报告基因测定法^[7]测试这个推定的uorf是否影响porf翻译(图1a)。将atbri1的5′-前导序列与野生型(wt)uorfatbri1或突变形式的uorfatbri1(命名为uorfatbri1)[上游atg(uatg)突变为aaa]插入荧光素酶(luc)编码区的上游，所得表达盒由35s启动子驱动。作为内部对照，在相同的质粒中构建了表达海肾(renillareniformis)荧光素酶(ren)的35s启动子指导的表达盒(图1a)。携带uorfatbri1或uorfatbri1的构建体在拟南芥原生质体中瞬时表达。具有uorfatbri1的构建体比具有wtuorfatbri1的构建体产生近四倍的luc/ren活性(图1b，左图)，而相应的mrna水平没有显著差异(图1b，右图)。这些结果表明wt形式的uorfatbri1的存在显著抑制luc翻译，其突变则可以显著增强下游porf的翻译。

实施例2编辑uorfatbri1

我们接下来使用针对包含uatg的区域的sgrna进行crispr编辑(图1c)，以评估扰乱uorfatbri1对atbri1mrna翻译的体内作用。获得超过30个突变体，其中两个在uatg(图1c)中分别含有1个核苷酸(g或t)插入的突变体进行进一步分析。两个突变体(uorfatbri1+g和uorfatbri1+t)的纯合系的atbri1mrna水平与wt对照组没有显著差异，但是atbri1蛋白在uorfatbri1+g中增加约20％，在uorfatbri1+t增加约90％(图1d)。之前的研究表明，atbri1的过度表达可以减少芸苔素内脂(br生物合成的有效抑制剂)对拟南芥下胚轴生长的抑制作用。与这一发现一致，uorfatbri1+t幼苗的下胚轴在外源性芸苔素内脂的存在下显著长于wt对照(图1e)。

但在uorfatbri1+g和wt幼苗的下胚轴之间没有观察到明显的差异(图1e)。这可能是由于与uorfatbri1+t相比，uorfatbri1+g中atbri1蛋白的升高较少(图1d)。uorfatbri1+t对芸苔素内脂的较高耐受性与较高水平的atbri1蛋白质相符(图1d)。这些结果一起揭示了uorfatbm1在体内控制atbri1翻译中的功能作用，并证明了通过crispr编辑破坏uorf可以减少uorf对下游porf翻译的抑制。在uorfatbri1+t中比在uorfatbri1+g中更多的atbri1的积累可能是由于前者中porf的翻译抑制被更大程度地缓解。在双重荧光素酶报告基因测定中，通过在uatg中插入t，uorfatbri1的破坏也导致比通过插入g的破坏显示出更高的luc/ren活性(图4)。在uorfatbri1+g和uorfatbri1+t中新创造的gtg和ttg可能分别允许uorfatbri1的一些残留功能，前者保留更高的活性。这个推理与以往的研究结果^[8，9]一致，表明gtg和ttg可以作为起始密码子，尽管效率低于atg。

实施例3鉴定uorfatvtc2

使用uorfatbri1进行概念验证后，发明人接下来测试了该策略是否可以用于增强对人类消费有价值的植物性状。已经在编码gdp-l-半乳糖磷酸化酶(ggp)的直系同源植物基因的5′近端区域发现了保守的uorf。ggp是植物细胞中抗坏血酸(asa，也称为维生素c)生物合成的主要酶^[10]。asa是人类必不可少的营养物质，并且已经付出了很多努力来通过生物技术育种增加asa含量。在拟南芥中，atvtc2编码关键的ggp同功酶，uorf(uorfatvtc2，图3b)位于其5′-前导序列。asa对atvtc2mrna翻译进行负反馈控制，uorf对于该反馈控制是必不可少的。由于缺乏atvtc2的uorf突变的植物，仍未知uorf的破坏是否会增加asa含量。

在uorfatvtc2(图3b)的开头有两个推定的、非正规的起始密码子(atcacg)。发明人构建了uorfatvtc2的两个纯合突变体，一个(uorfatvtc2-1)携带37个核苷酸缺失并除去第一个推定起始密码子atc的腺嘌呤残基，另一个(uorfatvtc2-2)具有1个核苷酸插入和9个核苷酸的缺失，破坏了两个潜在的起始密码子(图2a)。

在t4幼苗中，uorfatvtc2-2的asa含量比wt对照高出70％以上，而在uorfatvtc2-1和wt对照组之间检测到asa含量没有显著性差异(图2b)。后一种发现表明，在uorfatvtc2-1中，保留了acg密码子的突变型uorf(携带-37bp缺失)，orf序列未受干扰，仍然可以对porf翻译产生强烈的抑制。使用双重荧光素酶报告基因测定证实了这一点(图2c、d)。如预期的那样，除去atcacg的uorfatvtc2-2中的突变体uorf在相同的测定中不能抑制porf翻译(图2c、d)。atvtc2的mrna水平在wt对照，uorfatvtc2-1和uorfatvtc2-2(图2e)中没有显著差异，表明uorfatvtc2-2中asa的大量增加是由atvtc2mrna翻译增加引起的。总的来说，这些观察结果表明，uorfatvtc2的破坏增加了atvtc2蛋白和asa的产生。

实施例4构建具有增加asa含量的蔬菜植物

为了看看编辑atvtc2直系同源物保守的uorf是否可以用于在新鲜蔬菜植物中提高asa含量(这是asa的一种低成本便利的来源)，我们使用了全球流行的蔬菜莴苣(lactucasatival.)。在莴苣中发现了两种不同的ggp编码基因lsggp1和lsggp2，其推定的产物与atvtc2具有超过70％的相似性(图5)。lsggp1(uorflsggp1)和lsggp2(uorflsggp2)中的uorf的位置与atvtc2中的uorfatvtc2的位置相似(图3b-d)。推定的起始密码子是uorflsggp1的acg和uorflsggp2的atcacg(图3c，d)。使用两个sgrna分别突变uorflsggp1和uorflsggp2(图6)。对于uorflsggp1，突变体等位基因都保留了acg密码子，但是uorf编码能力由indel而变弱；在uorflsggp2的情况下，突变体等位基因仅保留两个原始起始密码子(atcacg)中仅一个(acg)或两者都丢失(图6a)。测定各t0突变体的叶面asa含量，并用boxplot分析数据。改变uorflsggp1和uorflsggp2分别增加了54-194％和183-352％的asa含量(图6b)。

这些发现提示uorf的基因组可以用于调控mrna翻译，是生成遗传多样性以研究关键生物过程(例如，atbri1介导的信号传导)和改良有价值的作物性状(例如asa含量)的广泛适用的方法。由于真核生物基因中uorf的发生率高，以及已经为大量的作物种类开发了基因组编辑方法，所以本发明的方法具有很大的应用潜力。基因组编辑的一个重要优点是可以通过后代分离或通过使用无dna编辑方法将uorf突变体制成无转基因^[14-16]。通过pcr分析分离群体，已经容易地获得了atbri1和atvtc2uorf突变体的无转基因后代(图7和表3)。

表3uorfatbri1和uorfatvtc2突变体t4代潮霉素敏感性的分离分析。

实施例5为其他靶基因产生uorf

为了研究调节基因表达的方法是否可以广泛使用，为五种其他不同的靶基因创建uorf。

对于chlh，具有chlh-c-tm的构建体产生具有chlh-wt的构建体的近20％luc/ren活性(图9a)，而具有chlh-c-am的构建体产生具有chlh-wt的构建体近75％的luc/ren活性(图9a)。这些结果表明luc翻译被突变形式chlh(产生了uorf)显著抑制，其突变显著降低下游porf的翻译。当t-dna同时(纯合)破坏基因的功能时，chlh翻译的改变影响叶绿素合成，引起白化幼苗(图9)。

对于真核起始因子iso-4f，具有eif-m的构建体产生具有eif-wt的构建体的近75％luc/ren活性(图10a)。这些结果表明，突变形式真核起始因子iso-4f的存在(产生了uorf)显著抑制了luc翻译，其突变显著降低下游porf的翻译。真核起始因子iso-4f表达的改变可以提供对特定病毒的抗性(图10)。

对于细胞色素p450基因，具有cyto-m的构建体产生具有cyto-wt产生构建体的近75％luc/ren活性(图11a)。这些结果表明，突变形式的细胞色素p450基因的存在(产生了uorf)显著抑制luc翻译，其突变显著降低下游porf的翻译。细胞色素p450表达的改变使幼苗对除草剂(苄嘧磺隆(bsm))更敏感，显示生长缓慢(图11)。

对于spindly基因，具有spy-1c-tm的构建体产生具有spy-wt的构建体的近75％的luc/ren活性(图12a)，而具有spy-2c-tm的构建体产生具有spy-wt的构建体近5％的luc/ren活性(图12a)。这些结果表明，突变形式spindly基因的存在(产生了uorf)显著抑制luc翻译，其突变显著降低下游porf的翻译。spindly表达的改变增加营养生长期间的节间生长(图12)。

对于photoperiitysensitivity5(se5)基因，具有se5-1c-tm的构建体产生具有se5-wt的构建体的近90％luc/ren活性(图13a)，而具有se5-2c-tm的构建体产生具有se5-wt的构建体的近15％luc/ren活性(图13a)。这些结果表明，突变形式se5基因的存在(产生了uorf)显著抑制luc翻译，其突变显著降低下游porf的翻译。se5翻译的变化显示在长日照条件下的早花(图13)。

参考文献：

1.schwanhausser，b.etal.nature.473，337-342(2011).

2.calvoa，s.e.pagliarinia，d.j.&moothaa，v.k.proc.natl.acad.sci.u.s.a.106,7507-12(2009).

3.vonarnim，a.g.，jia，q.&vaughn，j.n.plantsci.214，1-12(2014).

4.liangx.h.etal.natbiotechnol.34,875-882(2017).

5.xu，g.etal.nature.545,487-490(2017).

6.wang，z.y.etal.nature.410，380-383(2001).

7.hellens，r.p.etal.plantmethods.1，13(2005).

8.kawakami，t.etal.microbiolimmunol.43，351-357(1999).

9.mehdi，h.，ono，e.&gupta，k.c.gene.91：173-178(1990).

10.laing，w.a.etal.plantcell.27，772-786(2015).

11.bulley，s.m.etal.plantbiotechnol.j.10，390397(2012).

12.zhou，y.etal.biol.plant.56，451-457(2012).

13.reyes-chin-wo，s.etal.natcommun.8，14953(2017).

14.woo，j.w.etal.natbiotechnol.33，1162-1164(2015).

15.zhang，y.etal.natcommun.7，12617(2016).

16.liang，z.etal.natcommun.8，14261(2017).

17.yan，l.etal.molplant.8，1820-1823(2015).

18.xing，h.l.etal.bmcplantbiol.14，327(2014).

19.hellens，r.p.etal.plantmethods.1，13(2005).

20.zhai，z.，jung，h.i.&vatamaniuk，o.k.etal.jvisexp.30，pii：1149.doi：10.3791/1149(2009).

21.yoo，s.d.，cho，y.h.&sheen，j.natprotoc.2：1565-1572(2007).

22.cui，f.etal.plantcell24，233-244(2012).

23.zhang，h.etal.plantcell.27，214-227(2015).

24.kovács，l.etal.bio-protocol.6，e2067(2016)。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

天津吉诺沃生物科技有限公司

<120>调控基因表达的方法

<130>p20182767

<150>201710976945.0

<151>2017-10-19

<160>40

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atbri1靶序列

<400>1

ttccacttcctctctaatggtgg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atvtc2靶序列

<400>2

ggaacaggtgatcggaatcacgg23

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp1靶序列

<400>3

ccacggctatacacggagcaca22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp2靶序列

<400>4

cgacaagttgcagacatcacgg22

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atbri1引物-f

<400>5

attgttccacttcctctctaatgg24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atvtc2引物-f

<400>6

attgggaacaggtgatcggaatca24

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp1引物-f

<400>7

attgtgtgctccgtgtatagccg23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp2引物-f

<400>8

attgcgacaagttgcagacatca23

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atbri1引物-r

<400>9

aaacccattagagaggaagtggaa24

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>atvtc2引物-r

<400>10

aaactgattccgatcacctgttcc24

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp1引物-r

<400>11

aaaccggctatacacggagcaca23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp2引物-r

<400>12

aaactgatgtctgcaacttgtcg23

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>qpcr-luc-f

<400>13

ggattacaagattcaaagtgcg22

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>qpcr-luc-r

<400>14

tgatacctggcagatggaac20

<210>15

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>qpcr-ren-f

<400>15

catgggatgaatggcctgatattg24

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>qpcr-ren-r

<400>16

gataatgttggacgacgaacttc23

<210>17

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>bri1-f1

<400>17

aagtaggatatgtagcttgcagaag25

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>bri1-r1

<400>18

agatccagaacttccaagctg21

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>bri1-rna-f

<400>19

ttggttcttgctccggtctg20

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>bri1-rna-r

<400>20

cgtctccactgattttgtttcc22

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>actin2-f

<400>21

gcaccctgttcttcttaccg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>actin2-r

<400>22

aaccctcgtagattggcaca20

<210>23

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>f1

<400>23

ccagtcacgacgttgtaaaac21

<210>24

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>r1

<400>24

caatgaatttcccatcgtcgag22

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>f2

<400>25

ctcgaggaagcttctagatttc22

<210>26

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>r2

<400>26

gatccttgtagtctccgtcgtgg23

<210>27

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>f3

<400>27

catccagaaagcccaggtgtc21

<210>28

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>r3

<400>28

cagggtaatctcggtcttg19

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>f4

<400>29

catcatggaaagaagcagctt21

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>r4

<400>30

gaattcccgatctagtaacataga24

<210>31

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>f5

<400>31

agttacttcgattgatctcagct23

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>r5

<400>32

gagagatcgagaccagtgagtg22

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>vtc2-2f

<400>33

acgtccgaatcacaaccaca20

<210>34

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>vtc2-2r

<400>34

tgattagactcttccaagctaca23

<210>35

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>vtc2-qpcr-f

<400>35

ttcgctatgatgtcactgcctg22

<210>36

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>vtc2-qpcr-r

<400>36

gcaacgaaaccatacttcccc21

<210>37

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp1-f

<400>37

tcgaattaatttgcgactagc21

<210>38

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp1-r

<400>38

cttcttcgattaattgggacgc22

<210>39

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp2-f

<400>39

acactccacacccatgaaatctc23

<210>40

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lsggp2-r

<400>40

cttgaaaattaaacgataataacagg26