一种抑制sFRP1基因表达的siRNA及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种抑制sfrp1基因表达的sirna及其应用。

背景技术：

随着近来基因生物技术的发展，特别是核酸干扰(rnai)技术，该技术自1998年mello和fire发现以来，被广泛应用于生命科学和医学研究，并且被《科学》杂志选为2002年十大科学突破之首，该技术也使mello和fire在2006年获得了诺贝尔生理奖。

核酸干扰是指由小干扰核酸(sirna)介导的，通过激活rna诱导沉默复合体(risc)而选择性地识别降解特异的信使核酸(mrna)使该基因表达沉默的现象。

rnai是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具，它具有特异性、选择性、高效性、作用迅速等特点。rnai技术可以高效、特异的抑制相关基因的表达，从而降低处于异常活跃状态的信号通路，逆转相关疾病表型，达到调控生物体生理功能的作用，是潜在的治疗疾病的手段，在药物研发领域具有广阔的应用前景。而且相对于传统药物和抗体治疗，sirna活性分子具有标靶明确、药效好、开发速度快等优点，为传统“无药可治”的疑难疾病的创新治疗开发带来了发展新机遇。

rnai具有很高的特异性，19个核苷酸的双链rna几乎就可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸序列改变后，它对基因的抑制作用就会消失，这对双链rna的应用是非常重要的，这可以避免双链rna降解与靶mrna同家族的其他mrna。最有效的小干扰rna(smallinterferencerna，简称sirna)是19个碱基大小，且3’端有两个碱基突出(悬挂碱基)，一般为uu或者dtdt。研究表明sirna双链的反义链具有识别靶点基因序列的功能，而正义链没有序列识别功能。

分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)可以结合wnt配体并调节它们的信号转导，是典型β-连环蛋白活性的生理性重要调节因子，通常被认为可以抑制wnt/b-连环蛋白信号传导。

sfrp1的表达因疾病状况或发育阶段而异，sfrp1也可能促进肿瘤生长。对比健康组织，sfrp1在某些癌症中高度表达，比如转移性肾癌，弥漫型胃癌，基底样和小叶乳腺癌，前列腺癌和浸润性膀胱癌症，是潜在的药物开发靶点。在斑秃疾病中，sfrp1可以抑制人毛发球中的wnt配体，从而调节毛囊内典型wnt/β-catenin活性，导致脱发。而靶向sfrp1的抑制活性分子，可以抑制sfrp1活性，激活wnt/b-catenin通路，促进毛干的生长，提高毛发角蛋白表达，减少自发性人头皮毛囊衰退，从而治疗斑秃脱发的发生。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种抑制sfrp1基因表达的sirna，可在mrna水平抑制分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)基因表达。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种抑制sfrp1基因表达的sirna，其核苷酸序列为以下双链rna分子中的任一种：

正义链：5’-ccgagaugcuuaaguguga-3’，反义链：5’-ucacacuuaagcaucucgg-3’；正义链：5’-ccaccuuucaguccguguu-3’，反义链：5’-aacacggacugaaaggugg-3’；正义链：5’-ccugugacaacgaguugaa-3’，反义链：5’-uucaacucguugucacagg-3’；正义链：5’-ggcgacaagaagauugucc-3’，反义链：5’-ggacaaucuucuugucgcc-3’；正义链：5’-gcugaucuaugccuuucaa-3’，反义链：5’-uugaaaggcauagaucagc-3’；正义链：5’-cgcuuauguuaauaguaau-3’，反义链：5’-auuacuauuaacauaagcg-3’；正义链：5’-ggaucaaagaaauucagaa-3’，反义链：5’-uucugaauuucuuugaucc-3’；正义链：5’-gcaaguccauuauguaaua-3’，反义链：5’-uauuacauaauggacuugc-3’；正义链：5’-gauccuaagucucuuacaa-3’，反义链：5’-uuguaagagacuuaggauc-3’；正义链：5’-ccuugagugucauuaguua-3’，反义链：5’-uaacuaaugacacucaagg-3’；正义链：5’-agaagauggugcugcccaa-3’，反义链：5’-uugggcagcaccaucuucu-3’；正义链：5’-aguuugcacugaggaugaa-3’，反义链：5’-uucauccucagugcaaacu-3’；正义链：5’-agcgaguacgacuacguga-3’，反义链：5’-ucacguagucguacucgcu-3’；正义链：5’-ugcaguucuucggcuucua-3’，反义链：5’-uagaagccgaagaacugca-3’；正义链：5’-gcgggcgcuucuacaccaa-3’，反义链：5’-uugguguagaagcgcccgc-3’；正义链：5’-caccagcuggacaaccuca-3’，反义链：5’-ugagguuguccagcuggug-3’；或对上述十六对核苷酸序列的任一条正义链或者反义链进行化学修饰后的rna分子。

进一步地，所述化学修饰选自：核酸骨架的硫代磷酸(p-s键)修饰、核酸或脱氧核酸的2’-甲氧基(2’-ome)修饰、核酸或脱氧核酸的2’-氟(2’-f)修饰、锁核酸(lna)修饰、开环核酸(una)修饰、吲哚修饰、碱基的5-甲基胞嘧啶修饰、碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰、单链5’-末端胆固醇修饰、单链3’-末端半乳糖修饰、单链5’-末端多肽修饰、单链5’-末端磷酸化修饰和单链5’-末端荧光标记修饰，以及它们的组合。

进一步地，所述双链rna分子的3’末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基。

本发明的另一目的是提供上述sirna在药物或者制剂中的应用。

实现上述目的的技术方案如下：

上述抑制sfrp1基因表达的sirna在制备预防或治疗分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)基因相关的疾病的药物或者制剂中的应用。

进一步地，所述疾病为肾癌，胃癌，乳腺癌，前列腺癌和膀胱癌症和斑秃的任一种或多种。

本发明的有益效果是：

本发明提供了十六对能够抑制sfrp1基因表达的sirna序列，通过试验结果表明，本发明的sirna可有效抑制sfrp1基因表达，可用于制备预防和治疗分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)基因相关的疾病的药物或者制剂。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明提供的人源sfrp1sirna对mcf-7细胞sfrp1mrna干扰效果；

图2是本发明提供的人鼠同源sfrp1sirna对mcf-7细胞sfrp1mrna干扰效果；

图3是本发明提供的人源sfrp1sirna对hek-a细胞sfrp1mrna干扰效果；

图4是本发明提供的人鼠同源sfrp1sirna对hek-a细胞sfrp1mrna干扰效果；

图5是本发明提供的不同浓度sfrp1sirna对hek-a细胞sfrp1mrna干扰效果；

图6是本发明提供的典型的sirna核酸化学修饰位置。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

采用sirna设计的法则和规律，结合sirna设计软件辅助设计抑制sfrp1基因表达的sirna序列，通过大量实验筛选多条高效抑制sfrp1基因表达的sirna序列。其核苷酸序列为以下双链rna分子中的任一种，正义链：5’-ccgagaugcuuaaguguga-3’，反义链：5’-ucacacuuaagcaucucgg-3’，正义链：5’-ccaccuuucaguccguguu-3’，反义链：5’-aacacggacugaaaggugg-3’，正义链：5’-ccugugacaacgaguugaa-3’，反义链：5’-uucaacucguugucacagg-3’，正义链：5’-ggcgacaagaagauugucc-3’，反义链：5’-ggacaaucuucuugucgcc-3’；正义链：5’-gcugaucuaugccuuucaa-3’，反义链：5’-uugaaaggcauagaucagc-3’，正义链：5’-cgcuuauguuaauaguaau-3’，反义链：5’-auuacuauuaacauaagcg-3’，正义链：5’-ggaucaaagaaauucagaa-3’，反义链：5’-uucugaauuucuuugaucc-3’，正义链：5’-gcaaguccauuauguaaua-3’，反义链：5’-uauuacauaauggacuugc-3’，正义链：5’-gauccuaagucucuuacaa-3’，反义链：5’-uuguaagagacuuaggauc-3’，正义链：5’-ccuugagugucauuaguua-3’，反义链：5’-uaacuaaugacacucaagg-3’，正义链：5’-agaagauggugcugcccaa-3’，反义链：5’-uugggcagcaccaucuucu-3’，正义链：5’-aguuugcacugaggaugaa-3’，反义链：5’-uucauccucagugcaaacu-3’，正义链：5’-agcgaguacgacuacguga-3’，反义链：5’-ucacguagucguacucgcu-3’，正义链：5’-ugcaguucuucggcuucua-3’，反义链：5’-uagaagccgaagaacugca-3’，正义链：5’-gcgggcgcuucuacaccaa-3’，反义链：5’-uugguguagaagcgcccgc-3’，正义链：5’-caccagcuggacaaccuca-3’，反义链：5’-ugagguuguccagcuggug-3’，或对上述十六对核苷酸序列的任一条正义链或者反义链进行化学修饰后的rna分子。其中，上述双链rna分子的3’末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基。

上述任一条抑制sfrp1基因表达sirna可用于制备预防和治疗分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)基因相关的疾病的药物或者制剂。

实施例一：人源sfrp1sirna的设计合成

通过美国国立生物技术信息中心ncbi数据库，获取获取人源sfrp1mrna的序列全长(系列号：nm_003012)，使用在线的sirna设计软件，设计相关序列，并利用ncbi上的blast序列相似搜索程序对目标序列进行比对，筛选10条sfrp1sirna。此外，设计dtdt悬挂末端，以增加sirna的稳定性。如表1所示，设计sirna，并同时合成一条阴性对照sirna(sinc)，其中，设计的sirna由广州市锐博生物科技有限公司合成。

表1设计的人源sfrp1sirna和阴性对照sirna(sinc)

实施例二：人鼠共源sfrp1sirna的设计合成

通过美国国立生物技术信息中心ncbi数据库，获取人源sfrp1mrna的序列全长(系列号：nm_003012)和小鼠源sfrp1mrna的序列全长(系列号：nm_013834)。

再将两者相同序列中的开放读框部分输入sirna设计软件进行序列设计，并利用ncbi上的blast序列相似搜索程序对目标序列进行比对，筛选6条人鼠共源的sfrp1sirna，如表2所示。此外，设计dtdt悬挂末端，以增加sirna的稳定性。设计的sirna由广州市锐博生物科技有限公司合成。

表2设计的人鼠共源sfrp1sirna

实施例三：sfrp1sirna对乳腺癌细胞mcf-7的sfrp1mrna干扰效果

具体实验步骤如下：

步骤3.1：乳腺癌细胞mcf-7培养于含10％胎牛血清的dmem培养基，置于5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。

步骤3.2：取6-20代的mcf-7细胞，接种于12孔培养板板中，每个孔密度为8×10⁴个细胞，待24h后细胞密度长到50-70％时进行sirna转染；

其中，分别设置空白对照组、阴性对照组(negativesirna)、sfrp1sirna(共16个样品)；各组均设3个平行孔。

步骤3.3：根据lipofectamine^tm2000(lipo2000)转染试剂操作指南进行转染，转染的具体操作步骤如下：

步骤3.31：取6μllipo2000加入44μlopti-men培养液中，静止5min；取2.5μl测试sirna(母液浓度为20μm)加入47.5μlopti-men培养液中，静止5min；将上述两种稀释液混合放置20min；

步骤3.32：将12孔培养板每孔细胞液换成400μlopti-men培养液，再加入上述混合好的sirna和lipo2000纳米复合转染溶液，轻轻混合后，细胞置于5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，4h后换液成全培养基含10％胎牛血清的dmem培养基；

步骤3.33：继续孵育转染24h后，细胞加入1mltrizol(invitrogen)，吹打混匀，并吸至1.5mlrnasefreeep管中使细胞充分裂解；

步骤3.4：加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总rna；所得rna溶于40μl无rna酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组rna含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察rna完整性；以oligo(dt)15为引物，1μgrna为模板，按照promega逆转录试剂盒操作生成cdna，并进行目标基因sfrp1mrna定量pcr检测。

实验结果如图1和图2所示，其中，图1为人源sfrp1sirna对mcf-7细胞sfrp1mrna干扰效果，显示10个sirna在不同程度上都对mcf-7细胞的sfrp1mrna有抑制效果，其中sirna-1和sirna-2效果最好，经过sirna转染后mrna表达量分别只有18±2.0％和16±2.3％；图2为人鼠同源sfrp1sirna对mcf-7细胞sfrp1mrna干扰效果，结果显示6个sirna对sfrp1mrna有不同程度的干扰效果，其中sirna-11和sirna-12效果较好，其mrna表达量分别只有20±2.1％和22±2.8％。

实施例四：sfrp1sirna对人角质上皮细胞hek-a的sfrp1mrna干扰效果

该过程的具体操作步骤如下：

步骤4.1：取人角质上皮细胞hek-a培养于keratinocytegrowthkit(pcs200040)培养基，置于5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代；

步骤4.2：取4-12代的hek-a细胞，接种于12孔培养板中，每个孔密度为8×10⁴个细胞，待24h后细胞密度长到50-70％时进行sirna转染；

分别设置空白对照组、阴性对照组(negativesirna)、sfrp1sirna(共16个样品)，各组均设3个平行孔；

步骤4.3：根据lipo2000转染试剂操作指南进行转染，具体转染步骤如下：

步骤4.31：取6μllipo2000加入44μlopti-men培养液中，静止5min；取2.5μl测试sirna(母液浓度为20μm)加入47.5μlopti-men培养液中，静止5min；然后将上述两种稀释液混合放置20min；

步骤4.32：将步骤b中的12孔培养板每孔细胞液换成400μlopti-men培养液，再加入上述混合好的sirna和lipo2000纳米复合转染溶液，轻轻混合后，细胞置于5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养4h后，换液成全培养基keratinocytegrowthkit；

步骤4.33：继续孵育转染24h后，细胞加入1mltrizol(invitrogen)，吹打混匀，并吸至1.5mlrnasefreeep管中使细胞充分裂解；

步骤4.4：加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总rna；所得rna溶于40μl无rna酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组rna含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察rna完整性；以oligo(dt)15为引物，1μgrna为模板，按照promega逆转录试剂盒操作生成cdna,并进行目标基因sfrp1mrna定量pcr检测。

实验结果如图3和图4所示；

其中，图3为人源sfrp1sirna对hek-a细胞sfrp1mrna干扰效果，显示10个人源sfrp1sirna在不同程度都对hek-a细胞的sfrp1mrna有抑制效果，其中sirna-1和sirna-2效果最好，对比空白对照，经过sirna转染后sfrp1mrna表达量分别只有23±1.15％和25±1.25％；

图4为人鼠同源sfrp1sirna对hek-a细胞的sfrp1mrna干扰效果，结果显示6个sirna对sfrp1mrna有不同程度的沉默效果，其中sirna-11和sirna-12效果较好，其mrna表达量分别只有30±1.5％和36±1.8％。

实施例五：不同浓度sfrp1sirna对人角质上皮细胞hek-a的sfrp1mrna抑制效果

该过程的具体操作步骤如下：

步骤5.1：取人角质上皮细胞hek-a培养与于keratinocytegrowthkit(pcs200040)培养基，置于5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代；

步骤5.2：取4-12代的hek-a细胞，接种于12孔培养板板中，每个孔密度为8×10⁴个细胞，待24h后细胞密度长到50-70％时进行sirna转染；

其中，分别设置空白对照组、阴性对照组(negativesirna)、sirna-15nm、sirna-110nm、sirna-120nm、sirna-150nm、sirna-1100nm、sirna-25nm、sirna-210nm、sirna-220nm、sirna-250nm、sirna-2100nm、sirna-115nm、sirna-1110nm、sirna-1120nm、sirna-1150nm、sirna-11100nm、sirna-125nm、sirna-1210nm、sirna-1220nm、sirna-1250nm、sirna-12100nm，各组均设3个平行孔；

步骤5.3：根据lipo2000转染试剂操作指南进行转染，具体转染步骤同实施例四中的步骤4.3，mrnapcr定量实验方法和过程同实施例四中的步骤4.4。

实验结果如图5所示，即不同浓度sfrp1sirna对hek-a细胞sfrp1mrna干扰效果，通过实验结果可知，即使在低浓度5nm4条sirna对sfrp1mrna的抑制率都高达50％以上，说明本实验设计的sirna具有很强的特异性；普遍在20nm和50nm的时候达到了最好的干扰效果。

本领域技术人员将从本实施例五很容易看出，本发明的sirna在不同浓度下都可以对sfrp1mrna的有不同程度的抑制效果，并不局限于本实施举例的4条sirna，即sirna-1，sirna-2，sirna-11，sirna-12。

实施例六：化学修饰sfrp1sirna对人角质上皮细胞hek-a的sfrp1mrna抑制效果

对sirna进行不同化学修饰及其组合修饰，以提高sirna稳定性，提升干扰效果。化学修饰包括硫代修饰(p-s键)，甲氧基修饰(2’-ome)，卤素修饰(2’-f)，胆固醇修饰等，修饰种类如表3所示，修饰后的序列如表3所示，某些典型的化学修饰位置如图6所示。

表3sirna修饰种类表

其中，锁核酸(lna)修饰为核糖的2’-o位和4’-c位通过缩水左右形成的环状结构，开环核酸(una)修饰为核糖的2’-c和3’-c间的c-c键断裂，a代表核苷酸。

按照实施例二的方法对表4、表5和表6所示的各sirna进行hek-a细胞转染，并检测其对sfrp1基因的mrna表达的抑制效率，结果分别如表7、表8和表9所示。

表4sirna-1对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果中各链的序号及其对应的序列

其中，s代表正义链；as代表反义链。多肽系列为ggactgstqhqcg。

表5sirna-2对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果中各链的序号及其对应的序列

其中，s代表正义链；as代表反义链。

表6sirna-12对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果中各链的序号及其对应的序列

其中，s代表正义链；as代表反义链。

表7化学修饰sirna-1对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果

表8化学修饰sirna-2对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果

表9化学修饰sirna-12对hek-a细胞sfrp1mrna的抑制效果

依据表7、表8和表9中的结果，结果表明各类适当的化学修饰后所得的sirna修饰物均起到沉默目标基因sfrp1的mrna表达的效果。本领域技术人员将从实施例六中很容易看出来，通过实施例六类似的sirna化学修饰操作，可以提高sirna的稳定性并保持其mrna沉默效果。本实施例六所列的化学修饰，并不包括本发明的对表1和表2各种sirna修饰的全部内容，只是优选的实施描述。

本发明提供了十六对能够抑制sfrp1基因表达的sirna序列，通过试验结果表明，本发明的sirna可有效抑制sfrp1基因表达，可用于制备预防和治疗分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)基因相关的疾病的药物或者制剂。

序列表

<110>合肥中科干细胞再生医学有限公司

<120>一种抑制sfrp1基因表达的sirna及其应用

<130>2018.12.25

<160>32

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工合成(artificialsequence)

<400>1

ccgagaugcuuaaguguga19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工合成(artificialsequence)

<400>2

ucacacuuaagcaucucgg19

<210>3

<211>19

<212>rna

<213>人工合成(artificialsequence)

<400>3

ccaccuuucaguccguguu19

<210>4

<211>19

<212>rna

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<210>5

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<212>rna

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<400>5

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<210>6

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<212>rna

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<212>rna

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<400>9

gcugaucuaugccuuucaa19

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uugaaaggcauagaucagc19

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<211>19

<212>rna

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<400>11

cgcuuauguuaauaguaau19

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<211>19

<212>rna

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<400>12

auuacuauuaacauaagcg19

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<211>19

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<210>14

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uucugaauuucuuugaucc19

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ccuugagugucauuaguua19

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<211>19

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<211>19

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<211>19

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<211>19

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<211>19

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ugagguuguccagcuggug19