抗CII嵌合抗原受体编码基因、慢病毒质粒、Treg免疫细胞及其应用的制作方法

本发明涉及生物基因领域，更具体的说，是抗cii嵌合抗原受体编码基因、慢病毒质粒、treg免疫细胞及其应用。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是全世界范围常见的一种致残性大和影响生活质量的自身免疫异常疾病，其发病率高，据统计占类风湿关节炎人群占总人口的2％～4％。ra因自身的免疫系统侵犯手足的关节而使手足的关节肿胀、损伤的疾病，亦可视为一种慢性的综合征，表现为外周关节的非特异性炎症。此时患病关节及其周围组织呈现进行性破坏，并致使受损关节发生功能障碍，自身反应性t淋巴细胞在其异常的免疫反应中起重要作用。

目前，在ra治疗上主要是通过免疫抑制剂、水杨酸盐类药等药物治疗或滑膜切除等手术治疗来控制病情的发展。关于ra的研究报导及专利已有不少，但大多是通过新的药物或新剂型或rna干扰技术来针对治疗ra，比如在cn200910112919.9、cn201380036874.6、cn201380036874.6等专利中均是发明了新的贴剂或者新的组合物，目前利用免疫细胞来治疗ra的细胞制剂却没有，因此也没有其制备方法。

因此，开发一种抗cii嵌合抗原受体编码基因、慢病毒质粒、treg免疫细胞及其应用，具有极高的研究价值，同时也具有良好的经济效益和工业应用潜力。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提供抗cii嵌合抗原受体编码基因、慢病毒质粒、treg免疫细胞及其应用，通过慢病毒载体将抗ⅱ型胶原蛋白的car转染到预先收集培养的tregs细胞中，最终筛选获得car-tregs。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

第一方面，本发明提供了抗cii嵌合抗原受体编码基因，其中，所述编码基因至少包含cii结合区、ctla4功能区和rqr8分子开关。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗cii嵌合抗原受体编码基因包含linker核酸人工序列、cii单链抗体核酸人工序列、cd8铰链区核酸人工序列、cd8跨膜区核酸人工序列、2b4共刺激区核酸人工序列、cd3ζ信号传导区核酸人工序列、t2a自剪切区核酸人工序列、ctla4核酸人工序列和rqr8分子开关区核酸人工序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述抗cii嵌合抗原受体编码基因如seqidno.1所述。

本发明中，作为优选的技术方案，所述抗cii嵌合抗原受体包括顺序连接的如seqidno.2所述的leader核酸人工序列，

如seqidno.3所述的cii结合区核酸人工序列，

如seqidno.4所述的cd8铰链区核酸人工序列，

如seqidno.5所述的cd8跨膜区核酸人工序列，

如seqidno.6所述的2b4共刺激区核酸人工序列，

如seqidno.7所述的cd3ζ胞内区核酸人工序列，

如seqidno.8所述的t2a核酸人工序列，

如seqidno.9所述的ctla4核酸人工序列，

如seqidno.8所述的t2a核酸人工序列，

如seqidno.10所述的rqr8核酸人工序列。

第二方面，本发明提供了具有抗cii嵌合抗原受体的慢病毒质粒，分别按融合基因片段leader-scfv(cii)-cd8-2b4-cd3ζ-t2a-ctla4-t2a-rqr8的顺序合成其整个表达框，并插入慢病毒质粒plent-c-gfp的asisi和noti酶切位点之间，得到质粒plent-cii-ctla4。

更详细的说，质粒提纯步骤为：采用无内毒素质粒提取纯化试剂盒(购自solarbio公司)提取plent-cii-ctla4质粒。

第三方面，本发明提供了具有抗cii嵌合抗原受体编码基因的treg免疫细胞。

本发明中，作为优选的技术方案，所述treg免疫细胞采用如下的制备方法得到：

将plent-cii-ctla4质粒转染细胞系293t，然后用上述重组慢病毒感染treg免疫细胞，将感染后的细胞37℃，5％co2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％co2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高cik细胞的感染效率；吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。

第四方面，本发明提供了具有抗cii嵌合抗原受体编码基因的treg细胞在自身免疫性疾病方面的应用，尤其是在类风湿性关节炎方面的应用。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明创新性的提供了一种治疗类风湿性关节炎的car-tregs细胞，并且创新性的将cii作为治疗自身免疫性疾病的靶点。ⅱ型胶原蛋白(cii)主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织。抗ⅱ型胶原蛋白抗体，经常出现在ra炎症部位，在疾病过程中发挥作用，该靶向cii的抗体可以治疗炎症性疾病，抑制血管生成，治疗癌症和自身免疫性疾病。cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞(regulatorycells，tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的t细胞亚群，与自身免疫性疾病的发生关系密切。tregs可以通过多种方式抑制免疫反应，包括分泌抑制性细胞因子il-10、tgf-β等。tregs主要发挥抑制性免疫调节功能，在维持外周免疫耐受和预防自身免疫性疾病中发挥重要作用。本发明构建了具有抗cii的car以靶向自身免疫性疾病方面的治疗，尤其是类风湿性关节炎，其设计的编码基因，至少包含了包含了cii结合区和ctla4功能区、rqr8分子开关，且同时包含了位于三者之间的t2a核酸人工序列。这样，抗cii安全型嵌合抗原受体在转入免疫细胞翻译成蛋白后，t2a通过自切可以使受体分裂成三部分，第一部分为cii抗原结合区的car结构，第二部分为ctla4功能区，第三部分为rqr8分子开关作用区。本发明在保证疗效的同时一方面增强了car-tregs细胞的免疫抑制活性，另一方面保证了car-treg细胞的安全性。

本发明将cii作为治疗自身免疫性疾病的靶点，通过慢病毒载体将抗ⅱ型胶原蛋白的car转染到预先收集培养的病人外周血中的tregs细胞中，获得含有scfv(cii)的tregs细胞。scfv(cii)可以与关节炎病变处的cii结合，使得tregs细胞在关节炎病变处聚集，从而更好的发挥tregs细胞的免疫抑制功能，进而达到治疗类风湿性关节炎的效果。

本发明car结构中加入了ctla4功能区元件，ctla4与2b4共同享有b7分子配体，而ctla-4与b7分子结合后诱导t细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。该元件的加入进一步增强了car-tregs细胞的免疫抑制活性。

本发明在car结构中加入了rqr8分子开关元件，该分子开关分子量小且由两种抗原表位组成，临床上可以应用利妥昔单抗和qbend10单抗等通过抗体的adcc效应与cdc效应可以直接诱导car-tregs的细胞凋亡，保证了car-tregs细胞的临床使用安全性，可以有效的终止细胞因子风暴等不良反应。

综上所述，本发明在保证疗效的同时一方面增强了car-tregs细胞的免疫抑制活性，另一方面保证了car-treg细胞的安全性。

附图说明

图1为本发明所述的嵌合抗原受体leader-scfv(cii)-cd8-2b4-cd3ζ-t2a-ctla4-t2a-rqr8的融合基因片段的设计图。

图2为本发明含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞的表达car的效率图。

图3为本发明含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞对关节炎小鼠的治疗作用。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

抗cii嵌合抗原受体编码基因，包含了linker核酸人工序列、cii单链抗体核酸人工序列、cd8铰链区核酸人工序列、cd8跨膜区核酸人工序列、2b4共刺激区核酸人工序列、cd3ζ信号传导区核酸人工序列、t2a自剪切区核酸人工序列、ctla4核酸人工序列和rqr8分子开关区核酸人工序列。

如图1所示，本实施例的抗cii嵌合抗原受体编码基因，包括顺序连接的leader核酸人工序列seqidno.2)，cii结合区核酸人工序列(seqidno.3)，cd8hinge区核酸人工序列(seqidno.4)，cd8跨膜区核酸人工序列(seqidno.5)，2b4核酸人工序列(seqidno.6)，cd3ζ胞内区核酸人工序列(seqidno.7)，t2a核酸人工序列(seqidno.8)，ctla4核酸人工序列(seqidno.9)，t2a核酸人工序列(seqidno.8)，rqr8核酸人工序列(seqidno.10)。

实施例2

抗cii嵌合抗原受体编码基因的质粒制备实施例。

本实施例的抗cii嵌合抗原受体编码基因的质粒制备方法，包括如下步骤：

(1)按照leader-scfv(cii)-cd8-2b4-cd3ζ-t2a-ctla4-t2a-rqr8的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，并插入慢病毒质粒plent-c-gfp的asisi和noti酶切位点之间，得到质粒plent-cii-ctla4。最终获得测序正确的含有慢病毒质粒plent-cii-ctla4的e.colitop10。使用无内毒素质粒提取纯化试剂盒提取慢病毒质粒plent-cii-ctla4，质粒经浓度测定后，置于-20℃冰箱备用。

(2)采用无内毒素质粒提取纯化试剂盒(购自solarbio公司)提取plent-cii-ctla4质粒，具体步骤如下：(1)取10ul含有慢病毒质粒plent-cii-ctla4的e.colitop10菌液置于5ml含有amp⁺抗性的lb培养基中，250rpm摇床中过夜培养14-18h。(2)取扩增培养的2ml菌液室温12000rpm离心1min。(3)去上清，加200μl溶液p1(含rnasea)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(4)加入200μl溶液p2，温和颠倒离心管6～8次使菌体充分裂解。(5)加200μl溶液p3，立即温和上下颠倒6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，室温12000rpm离心10min，用以移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。(6)加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。(7)37℃冰浴5min，不时振荡溶液又变浑浊。12000rpm离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒dna，下层油相含内毒素。(8)将含质粒dna的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸到油相，重复步骤(6)～(8)三次。(9)加入600μl溶液p4，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(10)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复本步骤一次。(11)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或者50℃温箱放置数分钟，去除残余的漂洗液。(12)将吸收柱放入干净离心管中，向吸附膜中央滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温静置2min，12000rpm离心1min，收集质粒dna。(13)采用nanodrop核酸浓度测定最终得出所提慢病毒质粒plent-cii-ctla4浓度为326ng/μl，置于-20℃冰箱备用。

实施例3

本发明提供了具有抗cii嵌合抗原受体编码基因的treg免疫细胞实施例。其制备方法包括：首先将plent-cii-ctla4质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染tregs免疫细胞。

(1)慢病毒包装，滴度检测

采用lentiviralpackagingkit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的1.5mlep管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清dmem：4ml；plent-cii-ctla4质粒：10μg；gmeasytmlentiviralmix：10μl(10μg)；hgtransgenetmreagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293t细胞培养皿中，后置于co2培养箱中培养。转染24后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。取上述100μl病毒液采用慢病毒载体(hivp24)快速检测卡测定滴度，重组慢病毒的滴度1.76×10⁷tu/ml。

(2)tregs细胞的制备

取60ml外周血，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。采用cd4+cd25+cd127dim/–regulatorytcellisolationkitii(购自miltenyi)分离tregs细胞。取分离后的单个核细胞，每10⁷个细胞加入10ulbiotin-antibody混匀，置于2-8℃孵育5min，加入20μlanti-biotinmicrobeads/10⁷个细胞，混匀，2-8℃孵育10min，将细胞调整至500μl体积，过ld柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为cd4+t细胞(阴选)，用pbs将细胞洗涤离心后，每10⁷个细胞加入pbs90μl重悬，每10⁷个细胞加入cd25microbeads20ul，混匀，在2-8℃孵育15min，加入1mlpbs洗涤离心，倾去上清，重悬至500μl，过ms柱，把separator移开，放置1mlpbs于ms柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为cd4+cd25+t细胞(阳选)，加入treg培养基培养基继续培养。留取一部分细胞进行流式细胞学检测，流式细胞仪检测cd4+cd25+阳性细胞分选率达86％以上。

(3)慢病毒感染tregs细胞及感染后tregs细胞的扩增培养

以moi＝5用上述重组慢病毒感染tregs细胞。感染后的细胞37℃，5％co2培养箱中培养12小时后，收集细胞弃上清，重新加入等量病毒液，polybrene(8μg/ml)和细胞培养液，37℃，5％co2培养箱中继续培养，12h后吸弃培养上清，重新加入新鲜treg培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过fc500流式细胞仪(购自beckman公司)fl1通道检测嵌合抗原受体表达(图2)。以未感染的tregs细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染tregs细胞其阳性率32.8％。

实施例4

分子开关对含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞的控制有效性分析。

将含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞按照密度1×10⁵个/ml接种96孔板中，每孔100ul，置于5％co2、37℃培养箱培养24h；加入10nm利妥昔单抗(罗氏产品)，12h后每孔加入20μlcck-8(mce公司产品)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取od值。设置未加利妥昔单抗的car-trges细胞对照组和只加利妥昔单抗无细胞的空白对照组。

trges细胞的死亡率＝[1-(加利妥昔单抗组od值-空白对照组od值)/(未加利妥昔单抗组od值-空白对照组od值)]×100％。trges细胞的死亡率为59.27％，利妥昔单抗对car-trges细胞活性的控制率＝死亡率/重组慢病毒感染cik的阳性率＝98.13％；结果说明本发明设计的含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞活性受利妥昔单抗的控制，保证了car-tregs细胞的临床使用安全性，可以有效的终止细胞因子风暴等不良反应。

实施例5

具有抗cii嵌合抗原受体编码基因的treg免疫细胞对ra小鼠模型的治疗作用实施例。具体包括：小鼠模型的各关节病变程度分析，关节处plent-cii-ctla4特异性treg细胞的含量以及外周血tnf-α与ifn-γ等因子变化。

(1)含有plent-cii-ctla4特异性treg细胞对小鼠模型的各关节病变程度分析。

7～8周龄20g左右小鼠(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)。无菌条件下，第1、21天自尾根部取3点皮内注射ⅱ型胶原(cⅱ)与褔氏不完全佐剂充分乳化的胶原乳剂100μl。小鼠关节红肿等关节炎表现、关节炎评分逐渐升高且显作为建模成功的标准。

将小鼠随机分成4组，每组10只，开始注射治疗实验。实验组分别为：

a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水，持续观察14d；

b.治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只plent空载体tregs细胞，首次注射后2天再进行第二次同剂量注射，持续观察14d；

c.治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只plent-cii-ctla4特异性tregs细胞，首次注射后2天再进行第二次同剂量注射，持续观察14d；

d.治疗三组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只plent-cii特异性tregs细胞，首次注射后2天再进行第二次同剂量注射，持续观察14d；

每天观察关节和关节外病变并进行关节炎评分并记录，绘制关节炎病变比较图，如图3所示。其中，各关节病变程度按5级评分法，0：无红肿；1:红肿局限于一个脚趾；2:红肿多于一个脚趾；3:红肿涉及所有脚趾和脚背；4：整只爪子和踝关节重度红肿。

治疗效果总结：plent-cii-ctla4特异性tregs细胞>plent-cii特异性tregs细胞>普通tregs细胞。

(2)外周血tnf-α与ifn-γ因子变化分析。

免疫治疗后15天麻醉小鼠取静脉血，采用humantnf-alphaquantikineelisakit(购自r&dsystems公司)测定血清中tnf-α水平。对照组和实验一至三组血清tnf-α水平分别为(52.66±9.32)、(41.95±9.10)、(28.35±6.94)、(32.43±7.82)ng/ml，p<0.01。采用humanifn-gammaquantikineelisakit(购自r&dsystems公司)测定血清中ifn-γ水平。具体操作步骤见说明书。对照组和治疗一至三组血清ifn-γ水平分别为(134.53±19.26)、(101.91±16.42)、(68.58±7.98)、(79.453±7.31)ng/ml，p<0.01。由结果可知，本发明tregs的car结构中加入了ctla4功能区元件，使tregs抑制效应细胞产生ifn-γ与tnfα，进一步增强了car-tregs细胞的免疫抑制活性。

(3)关节处plent-cii-ctla4特异性tregs细胞的含量

免疫治疗后15天常规关节穿刺术抽取小鼠关节腔积液累计5ml，适量pbs稀释后静置5min，弃底部残渣，将混悬液2000rpm离心5min后弃上清并用1mlpbs重悬；取ficoll分离液置于离心管中，在分离液1cm处用吸管将关节液沉淀物混悬液沿管壁加入离心管中；2000rpm离心20min后，用吸管吸取中间白色淋巴细胞层转移到新离心管中；加入2倍体积pbs混匀，2000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次；用pbs重悬单核细胞至细胞浓度约为1×10⁶/ml；通过fc500流式细胞仪(购自beckman公司)检测cd4+cd25+foxp3+tregs细胞含量。治疗二组关节液tregs细胞占cd4+细胞的百分比(14.86％)明显高于治疗一组tregs细胞占cd4+细胞的百分比(10.93％)。由结果可知，本发明plent-cii-ctla4特异性tregs细胞中含有的scfv(cii)可以与关节炎病变处的cii结合，使得tregs细胞在关节炎病变处聚集，从而更好的发挥tregs细胞的免疫抑制功能，进而达到治疗类风湿性关节炎的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>抗cii嵌合抗原受体编码基因、慢病毒质粒、treg免疫细胞及其应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10037

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctg60

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