通过新基因开关表达系统调节多肽的表达的制作方法

文档序号:19157073发布日期:2019-11-16 00:57阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种组合物,其包含编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽的多核苷酸,其中所述基因开关多肽包含:

a)第一基因开关多肽,其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域,和

b)第二基因开关多肽,其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域,

其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。

2.一种组合物,其包含一种或多种编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统的多核苷酸,其中所述基因开关系统包含:

a)第一基因开关多肽,其包含反式激活域;和

b)第二基因开关多肽,其包含与配体结合域融合的dna结合域;和

c)至少一种异源基因多肽;

其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个连接;并且其中所述多肽连接体包含可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。

3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述dna结合域包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物,其中所述dna结合域具有如seqidno:184所示的序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物,其中所述反式激活域包含vp16反式激活域和b42酸性激活物反式激活域中的至少一种。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物,其中所述反式激活域具有如seqidno:181所示的序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物,其中所述第一核受体配体结合域、所述第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物,其中所述第一核受体配体结合域、所述第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如seqidno:185-186中任一个所示的序列。

9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一基因开关多肽包含与ecr核受体配体结合域融合的gal4dbd,并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域。

10.根据权利要求9所述的组合物,其中与所述ecr核受体配体结合域融合的所述gal4dbd具有如seqidno:185-186或187-188中任一个所示的序列,并且与所述类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的所述vp16反式激活域具有如seqidno:183所示的序列。

11.根据权利要求1所述的组合物,其中所述连接体是可切割的连接体、核糖体跳跃连接体序列或ires连接体。

12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述连接体是ires连接体,并且所述ires连接体具有如seqidno:18-19中任一个所示的序列。

13.根据权利要求11所述的组合物,其中所述连接体是可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。

14.根据权利要求2或13所述的组合物,其中所述可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列包含2a连接体、p2a连接体、t2a连接体、f2a连接体、e2a连接体、gsg-2a连接体、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink连接体变体及其衍生物中的一种或多种。

15.根据权利要求2或13所述的组合物,其中所述可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列具有如seqidno:146-162中任一个所示的序列。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物,其中所述多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码抗原结合多肽。

17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(car)和t细胞受体中的至少一种。

18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述抗原结合多肽包含car,并且所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。

19.根据权利要求17所述的组合物,其中所述抗原结合多肽包含car,并且所述car具有如seqidno:210-244中任一个所示的序列。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物,其中所述多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码细胞标签。

21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述细胞标签包含fier1截短变体或cd20截短变体中的至少一种。

22.根据权利要求20所述的组合物,其中所述细胞标签具有如seqidno:189-202中任一个所示的序列。

23.根据权利要求20所述的组合物,其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽、所述抗原结合多肽和所述细胞标签中的至少一种的表达由启动子调节,其中所述启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。

24.根据权利要求23所述的组合物,其中所述启动子是ef1a启动子或其功能变体,其具有如seqidno:58-60中任一个所示的序列。

25.根据权利要求23所述的组合物,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。

26.根据权利要求25所述的组合物,其中所述组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。

27.根据权利要求26所述的组合物,其中所述nfat应答元件具有如seqidno:51-57中任一个所示的序列。

28.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物进一步包含编码异源基因多肽的第二多核苷酸。

29.根据权利要求2或28所述的组合物,其中所述异源基因多肽包含细胞因子、细胞标签和嵌合抗原受体(car)中的至少一种。

30.根据权利要求29所述的组合物,其中所述细胞因子包含细胞因子,并且所述细胞因子包含il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。

31.根据权利要求30所述的组合物,其中所述细胞因子是分泌形式。

32.根据权利要求30所述的组合物,其中所述细胞因子是膜结合形式。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的组合物,其中所述细胞因子具有如seqidno:203-209中任一个所示的序列。

34.根据权利要求2和28-33中任一项所述的组合物,其中所述至少一种异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。

35.根据权利要求33所述的组合物,其中所述诱导型启动子具有如seqidno:40-64中任一个所示的序列。

36.根据权利要求34或35所述的组合物,其中所述诱导型启动子受所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽中的至少一种调节。

37.一种载体,其包含权利要求1的所述多核苷酸或权利要求2的所述一种或多种多核苷酸中的至少一种。

38.根据权利要求37所述的载体,其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。

39.根据权利要求38所述的载体,其中所述非病毒载体是睡美人转座子。

40.一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法,该方法包括:

向所述效应细胞中引入一种或多种多核苷酸,所述多核苷酸编码(i)包含与配体结合域融合的dna结合域的第一基因开关多肽,(ii)包含反式激活域的第二基因开关多肽,(iii)由所述异源基因编码的异源基因多肽,和(iv)包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列的多肽连接体,其中所述多肽连接体将所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一连接至所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个;以及

使所述效应细胞以足以诱导所述异源基因的表达的量与配体接触。

41.根据权利要求40所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码抗原结合多肽。

42.根据权利要求41所述的方法,其中所述抗原结合多肽选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。

43.根据权利要求42所述的方法,其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。

44.根据权利要求42或43所述的方法,其中所述靶细胞是肿瘤细胞。

45.根据权利要求44所述的方法,其中所述预定细胞表面蛋白质是肿瘤抗原。

46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法,其中所述抗原结合多肽在所述效应细胞与所述配体的所述接触之前选择性地结合所述靶细胞的所述预定细胞表面蛋白质。

47.根据权利要求46所述的方法,其中在所述效应细胞与所述配体的所述接触之前,将所述效应细胞暴露于所述靶细胞的所述预定细胞表面蛋白质至少7天。

48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法,其中所述预定细胞表面蛋白质被所述抗原结合多肽的结合活化所述效应细胞。

49.根据权利要求38-48中任一项所述的方法,其中所述抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(car)和t细胞受体中的至少一种。

50.根据权利要求49所述的方法,其中所述抗原结合多肽包含car,并且所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。

51.根据权利要求49所述的方法,其中所述抗原结合多肽包含car,并且所述car具有如seqidno:210-244中任一个所示的序列。

52.根据权利要求38-51中任一项所述的方法,其中所述异源基因多肽包含所述抗原结合多肽。

53.根据权利要求37-52中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞标签。

54.根据权利要求53所述的方法,其中所述细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。

55.根据权利要求53所述的方法,其中所述细胞标签具有如seqidno:189-202中任一个所示的序列。

56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法,其中所述异源基因多肽包含所述细胞标签。

57.根据权利要求37-56中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞因子。

58.根据权利要求57所述的方法,其中所述细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。

59.根据权利要求58所述的方法,其中所述细胞因子是分泌形式。

60.根据权利要求58所述的方法,其中所述细胞因子是膜结合形式。

61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法,其中所述细胞因子具有如seqidno:203-209中任一个所示的序列。

62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法,其中所述异源基因多肽包含所述细胞因子。

63.根据权利要求37-62中任一项所述的方法,其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。

64.根据权利要求63所述的方法,其中所述诱导型启动子具有如seqidno:40-64中任一个所示的序列。

65.根据权利要求37-64中任一项所述的方法,其中所述dna结合域包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。

66.根据权利要求64所述的方法,其中所述dna结合域具有如seqidno:184所示的序列。

67.根据权利要求37-66中任一项所述的方法,其中所述反式激活域包括vp16反式激活域和b42酸性激活物反式激活域中的至少一种。

68.根据权利要求67所述的方法,其中所述反式激活域具有如seqidno:181所示的序列。

69.根据权利要求37-68中任一项所述的方法,其中所述第一和第二基因开关多肽中的至少一种进一步包含能够与所述dna结合域结合的应答元件。

70.根据权利要求37-69中任一项所述的方法,其中所述配体结合域包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。

71.根据权利要求70所述的方法,其中所述配体结合域具有如seqidno:185-186中任一个所示的序列。

72.根据权利要求37-71中任一项所述的方法,其中所述第一基因开关多肽包含与ecr核受体配体结合域融合的gal4dbd,并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域。

73.根据权利要求72所述的方法,其中所述与ecr融合的gal4dbd具有如seqidno:185-186中任一个所示的序列,并且所述与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域具有如seqidno:183所示的序列。

74.根据权利要求37-73中任一项所述的方法,其中所述配体包括以下至少一种:

(2s,3r,5r,9r,10r,13r,14s,17r)-17-[(2s,3r)-3,6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1h-环戊并[a]菲-6-酮;

n′-(3,5-二甲基苯甲酰基)-n′-[(3r)-2,2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼;

5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼;

5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼;

5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼;

5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼;

5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼;

5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼;

5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼;

2-甲氧基-烟酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(2,2-二甲基-1-苯基-丙基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼;

3,5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼;和

3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。

75.根据权利要求37-74中任一项所述的方法,其中与在所述配体的存在下的表达相比,在不存在所述配体的情况下所述异源基因的所述表达减少或消除。

76.根据权利要求75所述的方法,其中通过提供额外量的所述配体来恢复所述异源基因的所述表达。

77.根据权利要求37-76中任一项所述的方法,其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽中的至少一种的表达由启动子调节,其中所述启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。

78.根据权利要求77所述的方法,其中所述启动子是ef1a启动子或其功能变体,其具有如seqidno:58-60中任一个所示的序列。

79.根据权利要求77所述的方法,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。

80.根据权利要求79所述的方法,其中所述组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。

81.根据权利要求80所述的方法,其中所述nfat应答元件具有如seqidno:50-57中任一个所示的序列。

82.根据权利要求40-81中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸被包含在载体内。

83.根据权利要求82所述的方法,其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。

84.根据权利要求83所述的方法,其中所述非病毒载体是睡美人转座子。

85.一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统,其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒,其中所述一个或多个表达盒包含:

a)编码第一基因开关多肽的序列,所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域;

b)编码第二基因开关多肽的序列,所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域;

其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。

86.一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统,其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒,其中所述一个或多个表达盒包含:

a)编码第一基因开关多肽的序列,所述第一基因开关多肽包含反式激活域;

b)编码第二基因开关多肽的序列,所述第二基因开关多肽包含与配体结合域融合的dna结合域;和

c)编码异源基因多肽的序列;

其中所述反式激活域、与所述配体结合域融合的dna结合域和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述反式激活域、与所述配体结合域融合的dna结合域和所述异源基因多肽中的另一个连接,并且其中所述多肽连接体包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列。

87.根据权利要求85所述的基因开关系统,其中所述一个或多个表达盒进一步包含编码异源基因多肽的序列。

88.根据权利要求85-87中任一项所述的基因开关系统,其中所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种:

a)一个或多个重组酶附着位点;和

b)编码丝氨酸重组酶的序列。

89.根据权利要求85-88中任一项所述的基因开关系统,其中所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种:

a)非诱导型启动子;和

b)诱导型启动子。

90.根据权利要求85-89中任一项所述的基因开关系统,其中所述dna结合域具有如seqidno:184所示的序列。

91.根据权利要求85-90中任一项所述的基因开关系统,其中所述反式激活域具有如seqidno:181所示的序列。

92.根据权利要求85-91中任一项所述的基因开关系统,其中所述第一和第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如seqidno:185-186中任一个所示的序列。

93.根据权利要求89所述的基因开关系统,其中所述非诱导型启动子具有如seqidno:40-64中任一个所示的序列。

94.根据权利要求89所述的基因开关系统,其中所述诱导型启动子具有如seqidno:40-64中任一个所示的序列。

95.根据权利要求85所述的基因开关系统,其中所述多肽连接体具有如seqidno:146-162中任一个所示的序列。

96.根据权利要求86所述的基因开关系统,其中所述多肽连接体是具有如seqidno:18-19和146-162中任一个所示序列的可切割的连接体、核糖体跳跃连接体或ires连接体。

97.根据权利要求85所述的基因开关系统,其中所述一个或多个表达盒包括包含编码嵌合抗原受体(car)的序列的表达盒,其中所述嵌合抗原受体的表达由非诱导型启动子调节。

98.根据权利要求97所述的基因开关系统,其中所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。

99.根据权利要求97所述的基因开关系统,其中所述非诱导型启动子包括ef1a或其变体。

100.根据权利要求97所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:131所示的序列。

101.根据权利要求97所述的基因开关系统,其中所述表达盒进一步包含编码细胞标签的序列,其中所述细胞标签通过连接体与所述car连接。

102.根据权利要求101所述的基因开关系统,其中所述细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。

103.根据权利要求102所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:132所示的序列。

104.根据权利要求97所述的基因开关系统,其中所述表达盒进一步包含编码所述第一基因开关多肽的所述序列和编码所述第二基因开关多肽的所述序列,其中所述第一和第二基因开关多肽之一通过连接体与所述car连接。

105.根据权利要求104所述的基因开关系统,其中所述第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接,并且所述多肽连接体是可切割的连接体。

106.根据权利要求105所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:133所示的序列。

107.根据权利要求106所述的基因开关系统,其中所述第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接,并且所述多肽连接体是ires连接体。

108.根据权利要求107所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:134所示的序列。

109.根据权利要求86或87所述的基因开关系统,其中所述一个或多个表达盒包括包含编码所述异源基因多肽的所述序列的表达盒,其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。

110.根据权利要求109所述的基因开关系统,其中所述异源基因多肽包含细胞因子。

111.根据权利要求110所述的基因开关系统,其中所述细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。

112.根据权利要求109所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:135所示的序列。

113.根据权利要求109所述的基因开关系统,其中所述表达盒包含编码第二异源基因多肽的序列,其中所述第二异源基因多肽包含细胞标签。

114.根据权利要求113所述的基因开关系统,其中所述细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。

115.根据权利要求114所述的基因开关系统,其中所述细胞标签通过连接体与所述细胞因子连接。

116.根据权利要求115所述的基因开关系统,其中所述表达盒具有如seqidno:136所示的序列。

117.根据权利要求88所述的基因开关系统,其中所述基因开关系统用于将异源基因整合到宿主细胞中,其中在所述丝氨酸重组酶和所述一个或多个重组酶附着位点的存在下使所述宿主细胞与所述一个或多个表达盒接触时,所述异源基因整合在所述宿主细胞中。

118.根据权利要求117所述的基因开关系统,其中所述系统进一步包含配体,其中在所述宿主细胞与所述配体接触时,所述异源基因在所述宿主细胞中表达。

119.根据权利要求117或118所述的基因开关系统,其中所述宿主细胞是t细胞或k细胞。

120.根据权利要求89所述的基因开关系统,其中所述诱导型启动子被所述反式激活域激活。

121.根据权利要求85-120中任一项所述的基因开关系统,其中所述系统被包含在一个或多个载体中。

122.根据权利要求121所述的基因开关系统,其中所述系统被包含在一个载体中。

123.一种多核苷酸,其编码根据权利要求85-89中任一项所述的基因开关系统的一种或多种组分。

124.一种载体,其包含根据权利要求123所述的多核苷酸。

125.根据权利要求124所述的载体,其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体中的任何一种。

126.根据权利要求125所述的载体,其中所述载体是非病毒载体,并且所述非病毒载体是睡美人转座子。

127.一种多核苷酸构建体,其包含:

编码第一基因开关多肽的多核苷酸,

编码第二基因开关多肽的多核苷酸,和

编码目的基因(goi)的多核苷酸,

其中所述编码goi的多核苷酸包含位于编码第一基因开关多肽的多核苷酸与编码第二基因开关多肽的多核苷酸之间的连续开放阅读框(orf),其中所述多核苷酸构建体进一步包含编码连接体的多核苷酸,并且其中所述goi通过所述连接体连接至每个所述第一和第二基因开关多肽。

128.一种多核苷酸,其包含以下至少一种:(i)编码第一基因开关多肽的第一序列,所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域;和(ii)编码第二基因开关多肽的第二序列,所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域;

其中所述第一序列和所述第二序列中的至少一种的表达由一个或多个fat应答元件调节。

129.一种刺激工程化细胞增殖和/或存活的方法,该方法包括:

(a)从受试者获得细胞样品,以及

(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞,其中所述一个或多个转座子编码:

嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶,以提供工程化细胞群体;

其中所述基因开关多肽包含:i)第一基因开关多肽,其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域,和ii)第二基因开关多肽,其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域,其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。

130.一种增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法,该方法包括:

(a)从受试者获得细胞样品,以及

(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞,其中所述一个或多个转座子编码:

嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶,以提供工程化细胞群体;

其中所述基因开关多肽包含:i)第一基因开关多肽,其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域,和ii)第二基因开关多肽,其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域,其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。

131.根据权利要求129或130所述的方法,其中所述转染细胞包括对细胞进行电穿孔。

132.根据权利要求129-131中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码所述基因开关多肽,并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节,其中所述启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。

133.根据权利要求132所述的方法,其中所述启动子是ef1a启动子或其功能变体,其具有如seqidno:58-60中任一个所示的序列。

134.根据权利要求132所述的方法,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。

135.根据权利要求132所述的方法,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。

136.根据权利要求135所述的方法,其中所述nfat应答元件具有如seqidno:50-57中任一个所示的序列。

137.根据权利要求129-136中任一项所述的方法,其中所述细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。

138.根据权利要求137所述的方法,其中所述细胞因子是分泌形式。

139.根据权利要求137所述的方法,其中所述细胞因子是膜结合形式。

140.根据根据权利要求137-139中任一项所述的方法,其中所述细胞因子具有如seqidno:203-209中任一个所示的序列。

141.根据权利要求129-140中任一项所述的方法,其中所述细胞是nk细胞、nkt细胞、t细胞或t细胞祖细胞。

142.根据权利要求129-141中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括向有需要的受试者施用有效量的所述工程化细胞。

143.根据权利要求142所述的方法,其中所述施用包括立即向所述受试者输注所述工程化细胞。

144.根据权利要求142或143所述的方法,其中所述方法进一步包括施用有效量的所述配体以诱导所述细胞因子的表达。

145.根据权利要求144所述的方法,其中所述配体是veledimex。

146.根据权利要求129-145中任一项所述的方法,其中所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。

147.根据权利要求146所述的方法,其中所述car能够结合所述cd19。

148.根据权利要求146所述的方法,其中所述car能够结合所述cd33。

149.根据权利要求129-148中任一项所述的方法,其中所述转座酶是鲑鱼型tc1样转座酶。

150.根据权利要求129-149中任一项所述的方法,其中所述转座酶是sb11或sb100x转座酶。

151.根据权利要求129-150中任一项所述的方法,其中所述一种或多种细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。

152.根据权利要求129-151中任一项所述的方法,其中所述一种或多种细胞标签具有如seqidno:189-202中任一个所示的序列。

153.一种治疗患有实体瘤的受试者的方法,该方法包括:

(a)从受试者获得细胞样品,

(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞,其中所述一个或多个转座子编码:

嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶,以提供工程化细胞群体;

其中所述基因开关多肽包含:i)第一基因开关多肽,其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域,和ii)第二基因开关多肽,其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域,其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接,以及

(c)将所述工程化细胞群体施用于所述受试者。

154.根据权利要求153所述的方法,其中所述细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。

155.根据权利要求154所述的方法,其中所述细胞因子包括il-12。

156.根据权利要求153所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码所述基因开关多肽,并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节,其中所述启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。

157.根据权利要求156所述的方法,其中所述启动子是ef1a启动子或其功能变体,其具有如seqidno:58-60中任一个所示的序列。

158.根据权利要求156所述的方法,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。

159.根据权利要求156所述的方法,其中所述启动子是组织特异性启动子,并且所述组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。

160.根据权利要求159所述的方法,其中所述nfat应答元件具有如seqidno:50-57中任一个所示的序列。


技术总结
本文公开了编码配体诱导型基因开关多肽的多核苷酸,和包含用于调节宿主细胞中异源基因和白介素表达的基因开关多肽的系统。本文所述的组合物、方法和系统促进包括但不限于细胞因子和抗原结合多肽的多肽的配体依赖性表达。

技术研发人员:鲁图尔·R·沙阿;托马斯·D·里德;谢丽尔·G·博林格
受保护的技术使用者:英特拉克森公司
技术研发日:2018.01.10
技术公布日:2019.11.15
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