通过新基因开关表达系统调节多肽的表达的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求2017年1月10日提交的第62/444,775号美国临时专利申请和2017年2月28日提交的第62/464,958号美国临时专利申请的权益，这些临时申请通过引用整体并入本文。序列表的引用本申请包含序列表，该序列表已经以ascii格式通过电子方式提交，并且通过引用整体并入于此。所述ascii副本创建于2018年1月9日，被命名为50471_706_601_sl.txt，大小为421，163个字节。援引并入本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
背景技术：
：已经显示使用嵌合抗原受体(car)和t细胞受体(tcr)的过继性t细胞免疫疗法成功地引导杀死肿瘤细胞。虽然这种创新技术很有前景，但将修饰的t细胞施用于携带肿瘤的个体并非没有安全性问题，例如肿瘤裂解和细胞因子释放综合征。另外，单独表达car或tcr可能不足以实现功效，可能需要额外表达诸如il-2、il-12、il-15或il-21等细胞因子来增加此类治疗的功效。然而，这可能会导致额外的安全性问题。因此，感兴趣的是在患者施用后完全控制目的治疗基因的表达。技术实现要素：在某些实施方案中，本文公开了包含基因开关多肽和编码该基因开关多肽的多核苷酸的系统、方法或组合物。本文提供了一种组合物，其包含编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含：(a)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域；和(b)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。本文提供了一种组合物，其包含一种或多种编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统的多核苷酸，其中所述基因开关系统包含：(a)第一基因开关多肽，其包含反式激活域；(b)第二基因开关多肽，其包含与配体结合域融合的dna结合域；和(c)至少一种异源基因多肽；其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个连接；并且其中所述多肽连接体包含可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的dna结合域包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的dna结合域具有如seqidno：184所示的序列。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的反式激活域包含vp16反式激活域和b42酸性激活物反式激活域中的至少一种。在一些实施方案中，如本文提供的任何组合物的反式激活域具有如seqidno：181所示的序列。在一些情况下，本文提供的任何组合物的第一核受体配体结合域、第二核受体配体结合域和配体结合域中的至少一种包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在其它情况下，本文提供的任何组合物的第一核受体配体结合域、第二核受体配体结合域和配体结合域中的至少一种具有如seqidno：185-186中任一个所示的序列。在另一种情况下，第一基因开关多肽包含与ecr核受体配体结合域融合的gal4dbd，并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域。在又一种情况下，所述与ecr核受体配体结合域融合的gal4dbd具有如seqidno：185-186或187-188中任一个所示的序列，并且所述与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域具有如seqidno：183所示的序列。在一些情况下，本文提供的任何组合物的连接体是可切割的连接体、核糖体跳跃连接体序列或ires连接体。在一些情况下，该连接体是ires连接体并且具有如seqidno：18-19中任一个所示的序列。在其它情况下，该连接体是可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列包含2a连接体、p2a连接体、t2a连接体、f2a连接体、e2a连接体、gsg-2a连接体、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink连接体变体及其衍生物中的一种或多种。在其它实施方案中，该可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列具有如seqidno：146-162中任一个所示的序列。在一个实施方案中，本文提供的任何组合物的多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码抗原结合多肽。在另一个实施方案中，本文提供的任何组合物的抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(car)和t细胞受体中的至少一种。在其它实施方案中，该抗原结合多肽包含car，并且所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含car，并且该car具有如seqidno：210-244中任一个所示的序列。在其它实施方案中，本文提供的任何组合物的多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码细胞标签。在一些情况下，该细胞标签包含her1截短变体或cd20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签具有如seqidno：189-202中任一个所示的序列。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的第一基因开关多肽、第二基因开关多肽、抗原结合多肽和细胞标签中的至少一种的表达由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。在一些情况下，该启动子是ef1a启动子或其功能变体，其具有如seqidno：58-60中任一个所示的序列。在其它情况下，该启动子是包含t细胞特异性应答元件的组织特异性启动子。在另一种情况下，该组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。在又一种情况下，该nfat应答元件具有如seqidno：51-57中任一个所示的序列。在一些实例中，本文提供的任何组合物进一步包含编码异源基因多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，该异源基因多肽包含细胞因子、细胞标签和嵌合抗原受体(car)中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子包含细胞因子，并且所述细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在其它情况下，该细胞因子是分泌形式。在另一种情况下，该细胞因子是膜结合形式。在又一种情况下，该细胞因子具有如seqidno：203-209中任一个所示的序列。在一个实施方案中，本文提供的任何组合物的至少一种异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在一些实施方案中，该诱导型启动子具有如seqidno：40-64中任一个所示的序列。在其它实施方案中，该诱导型启动子由第一基因开关多肽和第二基因开关多肽中的至少一种调节。本文还提供了一种载体，其包含本文提供的任何组合物的多核苷酸。在一个实施方案中，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在另一个实施方案中，该非病毒载体是睡美人(sleepingbeauty)转座子。本文提供了一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法，该方法包括：(a)向所述效应细胞中引入一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)包含与配体结合域融合的dna结合域的第一基因开关多肽，(ii)包含反式激活域的第二基因开关多肽，(iii)由所述异源基因编码的异源基因多肽，和(iv)包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列的多肽连接体，其中所述多肽连接体将所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一连接至所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个；以及(b)使所述效应细胞以足以诱导所述异源基因的表达的量与配体接触。在一个实例中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码抗原结合多肽。在一些情况下，该抗原结合多肽选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。在一些情况下，该靶细胞是哺乳动物细胞。在其它情况下，该靶细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的预定细胞表面蛋白质是肿瘤抗原。在一些情况下，所述抗原结合多肽在效应细胞与配体接触之前选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。在一些情况下，在效应细胞与配体接触之前，将效应细胞暴露于靶细胞的预定细胞表面蛋白质至少7天。在其它情况下，预定细胞表面蛋白质被抗原结合多肽的结合活化效应细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述效应细胞与表达所述预定细胞表面蛋白质的人工抗原呈递细胞(aapc)共培养，其中所述抗原结合多肽与所述aapc的所述预定细胞表面蛋白质的结合活化所述效应细胞。在一些实施方案中，共培养至少7天、14天、21天或28天。在一些情况下，所述aapc是转基因k562细胞。在其它实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(car)和t细胞受体中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含car，并且所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含具有如seqidno：210-244中任一个所示序列的car。在一些实施方案中，该异源基因多肽包含抗原结合多肽。在一些情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞标签。在一些情况下，该细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签具有如seqidno：189-202中任一个所示的序列。在一些情况下，该异源基因多肽包含细胞标签。在其它情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包含il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，该细胞因子是分泌形式。在另一个实施方案中，该细胞因子是膜结合形式。在又一个实施方案中，该细胞因子具有如seqidno：203-209中任一个所示的序列。在其它实施方案中，该异源基因多肽包含所述细胞因子。在一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在某些实施方案中，该诱导型启动子具有如seqidno：40-64中任一个所示的序列。在另一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的dna结合域包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。在又一个实施方案中，该dna结合域具有如seqidno：184所示的序列。在又一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的反式激活域包含vp16反式激活域和b42酸性激活物反式激活域中的至少一种。在一些情况下，该反式激活域具有如seqidno：181所示的序列。在其它实施方案中，所述第一和第二基因开关多肽中的至少一种进一步包含能够与所述dna结合域结合的应答元件。在一些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的配体结合域包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在某些实施方案中，该配体结合域具有如seqidno：185-186中任一个所示的序列。在某些实施方案中，第一基因开关多肽包含与ecr核受体配体结合域融合的gal4dbd，并且第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域。在一些实施方案中，所述与ecr融合的ga14dbd具有如seqidno：185-186中任一个所示的序列，并且所述与类视黄醇受体x(rxr)核受体配体结合域融合的vp16反式激活域具有如seqidno：183所示的序列。在某些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的配体包含以下至少一种：(2s，3r，5r，9r，10r，13r，14s，17r)-17-[(2s，3r)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1h-环戊并[a]菲-6-酮；n′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-n′-[(3r)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。在一些情况下，与在配体的存在下的表达相比，在不存在配体的情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中异源基因的表达减少或消除。在某些情况下，通过提供额外量的配体来恢复所述异源基因的表达。在其它情况下，在本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽中的至少一种的表达由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。在某些情况下，该启动子是ef1a启动子或其功能变体，其具有如seqidno：58-60中任一个所示的序列。在其它情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。在另一种情况下，该组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。在又一种情况下，该nfat应答元件具有如seqidno：50-57中任一个所示的序列。在某些情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的所述一种或多种多核苷酸被包含在载体内。在一些情况下，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在某些情况下，该非病毒载体是睡美人转座子。本文提供了一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：(a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域；(b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。本文提供了一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：(a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含反式激活域；(b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与配体结合域融合的dna结合域；和(c)编码异源基因多肽的序列；其中所述反式激活域、与所述配体结合域融合的dna结合域和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述反式激活域、与所述配体结合域融合的dna结合域和所述异源基因多肽中的另一个连接，并且其中所述多肽连接体包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的所述一个或多个表达盒进一步包含编码异源基因多肽的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：(a)一个或多个重组酶附着位点；和(b)编码丝氨酸重组酶的序列。在其它实施方案中，所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：(a)非诱导型启动子；和(b)诱导型启动子。在某些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的dna结合域具有如seqidno：184所示的序列。在其它实施方案中，如本文提供的基因开关系统的反式激活域具有如seqidno：181所示的序列。在另一个实施方案中，第一和第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如seqidno：185-186中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述非诱导型启动子具有如seqidno：40-64中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述诱导型启动子具有如seqidno：40-64中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述多肽连接体具有如seqidno：146-162中任一个所示的序列。在一些实施方案中，所述多肽连接体是其具有如seqidno：18-19和146-162中任一个所示的序列的可切割的连接体、核糖体跳跃连接体或ires连接体。在一些实例中，如本文提供的基因开关系统的所述一个或多个表达盒包括包含编码嵌合抗原受体(car)的序列的表达盒，其中该嵌合抗原受体的表达由非诱导型启动子调节。在某些实例中，该car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。在其它实例中，如本文提供的基因开关系统的非诱导型启动子包含ef1a或其变体。在某些情况下，所述表达盒具有如seqidno：131所示的序列。在其它情况下，所述表达盒进一步包含编码细胞标签的序列，其中该细胞标签通过连接体与car连接。在一些情况下，该细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。在另一个实例中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如seqidno：132所示的序列。在一些实施方案中，该表达盒进一步包含编码第一基因开关多肽的序列和编码第二基因开关多肽的序列，其中第一和第二基因开关多肽之一通过连接体与car连接。在一些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接，并且该多肽连接体是可切割的连接体。在一些实施方案中，所述表达盒具有如seqidno：133所示的序列。在一些实施方案中，第一和第二基因开关多肽通过多肽连接体连接，并且该多肽连接体是ires连接体。在某些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如seqidno：134所示的序列。在其它实施方案中，所述一个或多个表达盒包括包含编码异源基因多肽的序列的表达盒，其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在其它实施方案中，该异源基因多肽包含细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在另一个实施方案中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如seqidno：135所示的序列。在一些实施方案中，该表达盒包含编码第二异源基因多肽的序列，其中第二异源基因多肽包含细胞标签。在某些情况下，该细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签通过连接体与细胞因子连接。在另一种情况下，该表达盒具有如seqidno：136所示的序列。在一些情况下，如本文提供的基因开关系统用于将异源基因整合到宿主细胞中，其中在丝氨酸重组酶和所述一个或多个重组酶附着位点的存在下使宿主细胞与所述一个或多个表达盒接触时，所述异源基因整合在所述宿主细胞中。在某些情况下，所述基因开关系统进一步包含配体，其中在宿主细胞与该配体接触时，所述异源基因在宿主细胞中表达。在某些情况下，该宿主细胞是t细胞或nk细胞。在某些情况下，所述一个或多个重组酶附着位点可包含噬菌体基因组重组附着位点(attp)或细菌基因组重组附着位点(attb)。在一些情况下，所述丝氨酸重组酶可以是sf370。在某些情况下，如本文提供的基因开关系统的诱导型启动子被反式激活域激活。在某些情况下，该系统被包含在一个或多个载体中。在某些情况下，该系统被包含在一个载体中。公开了编码如本文提供的基因开关系统的一种或多种组分的多核苷酸。本文还公开了一种载体，其包含编码如本文提供的基因开关系统的一种或多种组分的多核苷酸。在某些情况下，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体中的任何一种。在某些情况下，该载体是非病毒载体，并且所述非病毒载体是睡美人转座子。本文提供了一种多核苷酸构建体，其包含：编码第一基因开关多肽的多核苷酸，编码第二基因开关多肽的多核苷酸，和编码目的基因(goi)的多核苷酸，其中所述编码goi的多核苷酸包含位于编码第一基因开关多肽的多核苷酸与编码第二基因开关多肽的多核苷酸之间的连续开放阅读框(orf)，其中所述多核苷酸构建体进一步包含编码连接体的多核苷酸，并且其中所述goi通过所述连接体连接至每个所述第一和第二基因开关多肽。本文提供了一种多核苷酸，其包含以下至少一种：(i)编码第一基因开关多肽的第一序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域；和(ii)编码第二基因开关多肽的第二序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；其中所述第一序列和所述第二序列中的至少一种的表达由一个或多个fat应答元件调节。本文提供了一种刺激工程化细胞增殖和/或存活的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，以及(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。本文提供了一种增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，以及(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些实施方案中，在本文提供的方法中转染细胞包括对细胞进行电穿孔。在某些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。在某些情况下，该启动子是ef1a启动子或其功能变体，其具有如seqidno：58-60中任一个所示的序列。在某些情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。在某些情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。在某些情况下，该nfat应答元件具有如seqidno：50-57中任一个所示的序列。在某些情况下，该细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在其它情况下，该细胞因子是分泌形式。在另一种情况下，该细胞因子是膜结合形式。在又一种情况下，该细胞因子具有如seqidno：203-209中任一个所示的序列。在又一种情况下，该细胞是nk细胞、nkt细胞、t细胞或t细胞祖细胞。在其它情况下，本文提供的方法进一步包括向有需要的受试者施用有效量的工程化细胞。在某些情况下，施用包括立即向受试者输注所述工程化细胞。在某些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体以诱导细胞因子的表达。在某些情况下，该配体是veledimex。在一些情况下，该car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。在某些情况下，该car能够结合cd19。在某些情况下，该car能够结合cd33。在某些情况下，该转座酶是鲑鱼型tcl样转座酶。在某些情况下，该转座酶是sb11或sb100x转座酶。在某些情况下，所述一种或多种细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。在某些情况下，所述一种或多种细胞标签具有如seqidno：189-202中任一个所示的序列。本文提供了一种治疗患有实体瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接，以及(c)将所述工程化细胞群体施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述治疗方法中的细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα的融合体或il-15变体中的至少一种。在一些实施方案中，该细胞因子包括il-12。在一些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。在一些实施方案中，该启动子是ef1a启动子或其功能变体，其具有如seqidno：58-60中任一个所示的序列。在某些实施方案中，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件。在一些实施方案中，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含一个或多个nfat应答元件。在一些实施方案中，该nfat应答元件具有如seqidno：50-57中任一个所示的序列。还公开了一种工程化效应细胞，其中所述工程化效应细胞包含：(a)编码工程化受体构建体的第一多核苷酸，该工程化受体构建体选择性地结合由靶细胞表达的预定细胞表面蛋白质；(b)编码一种或多种工程化基因开关多肽的一种或多种多核苷酸，其中所述工程化基因开关多肽包含反式激活域、dna结合域和配体结合域中的一种或多种；和(c)在由所述工程化基因开关多肽调节的配体诱导型启动子控制下的异源基因；其中所述异源基因编码细胞因子。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞表面蛋白质在所述肿瘤细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述细胞表面蛋白质在人工抗原呈递细胞(aapc)中表达。在一些实施方案中，所述工程化受体构建体是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，该嵌合抗原受体结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2。在一些实施方案中，该嵌合抗原受体结合egfrviii。在一些实施方案中，所述工程化受体构建体是工程化t细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞因子是il-2、il-15、il-12、il-21或il-15与il-15rα的融合体。在一些实施方案中，所述细胞因子是il-12。在一些实施方案中，所述效应细胞进一步包含编码包含细胞标签的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，该细胞标签是截短的her1变体或cd20截短变体。在一些实施方案中，所述效应细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞是t细胞、nk细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含反式激活域、dna结合域和配体结合域。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含第一基因开关多肽和第二基因开关多肽，第一基因开关多肽包含所述与核受体配体结合域融合的dna结合域，第二基因开关多肽包含所述与核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。在一些实施方案中，该多肽连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该多肽连接体包含2a、f/t2a、gsg-2a、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink变体及其衍生物中的一种。在一些实施方案中，所述反式激活域包含vp16反式激活域。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在一些实施方案中，所述dna结合域(dbd)包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。本文进一步公开了一种调节异源基因表达的方法，该方法包括使靶细胞与本文公开的效应细胞接触。在一些情况下，该调节包括增加或降低所述异源基因的表达。在一些情况下，与在所述配体的存在下的表达相比，在不存在所述配体的情况下，所述表达减少或消除。在一些情况下，通过提供额外量的所述配体来复苏所述表达。进一步公开了一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法，该方法包括：向所述效应细胞中引入编码一种或多种工程化基因开关多肽的多核苷酸、工程化受体构建体和所述异源基因；其中所述异源基因处于诱导型启动子的控制之下；通过所述工程化受体构建体活化所述效应细胞；以及向所述效应细胞呈递配体，以便在所述活化所述效应细胞后，通过所述一种或多种工程化基因开关多肽诱导所述异源基因的表达。在一些情况下，所述活化包括使效应细胞与抗原接触。在一些情况下，该抗原是肿瘤抗原。在一些情况下，在向效应细胞呈递配体之前，该效应细胞暴露于肿瘤抗原至少7天。在一些情况下，活化效应细胞包括将效应细胞与人工抗原呈递细胞(aapc)共培养。在一些情况下，共培养至少7天、14天、21天或28天。在一些情况下，该aapc是转基因k562细胞。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含嵌合抗原受体(car)。在一些情况下，该car结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含工程化t细胞受体(tcr)。在一些情况下，效应细胞包括使效应细胞与tcr结合多肽接触。在一些情况下，该tcr结合多肽包含tcr结合抗体或其片段。在一些情况下，在向效应细胞呈递配体之前，该效应细胞暴露于tcr结合多肽至少7天。在一些情况下，该tcr结合多肽由aapc表达。在一些情况下，所述异源基因编码细胞因子。在一些情况下，该细胞因子是il-2、il-15、il-12、il-21或il-15与il-15rα的融合体。在一些情况下，该细胞因子是il-12。在一些情况下，所述异源基因编码至少一种细胞标签。在一些情况下，该细胞标签是her1截短变体或cd20截短变体。在一些情况下，所述一个或多个基因表达盒进一步包含编码细胞标签的核苷酸序列。在一些情况下，所述效应细胞是免疫效应细胞。在一些情况下，该免疫效应细胞是t细胞、nk细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含反式激活域、dna结合域和配体结合域。在一些情况下，该配体结合域包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在一些情况下，该dna结合域包含gal4(gal4dbd)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。在一些情况下，该反式激活域包含vp16反式激活域。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含能够与所述dna结合域结合的应答元件。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含超螺旋蛋白(usp)、类视黄醇受体x(rxr)或功能片段及其变体中的至少一种，其中所述功能片段及其变体能够与ecr结合。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含一种或多种多肽连接体。在一些情况下，所述一种或多种多肽连接体进一步包含2a、gsg-2a、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink变体及其衍生物中的至少一种。在一些情况下，所述配体包含以下至少一种：(2s，3r，5r，9r，10r，13r，14s，17r)-17-[(2s，3r)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1h-环戊并[a]菲-6-酮；n′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-n′-[(3r)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。本文进一步公开了一种用于工程化细胞中异源基因表达的配体诱导型控制的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：(a)编码能够结合由靶细胞表达的预定细胞表面蛋白质的工程化受体构建体的第一序列；和(b)编码一种或多种工程化基因开关多肽的第二序列，其用于通过响应于所述配体的存在调节与所述异源基因连接的启动子，对所述异源基因表达进行配体诱导型控制；其中所述工程化受体构建体和所述一种或多种工程化基因开关多肽通过多肽连接体连接。在一些实施方案中，所述多肽连接体包含可切割的连接体序列。在一些实施方案中，所述可切割的连接体序列是f2a连接体。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含第一基因开关多肽和第二基因开关多肽，第一基因开关多肽包含与核受体配体结合域融合的dna结合域，第二基因开关多肽包含与核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些实施方案中，该连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该连接体是2a连接体、gsg-2a连接体、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink变体及其衍生物。在一些实施方案中，该2a连接体是f2a连接体。在一些实施方案中，所述异源基因编码细胞因子。在一些实施方案中，该细胞因子是il-2、il-15、il-12、il-21或il-15与il-15rα的融合体。在一些实施方案中，该细胞因子是il-12。在一些实施方案中，所述异源基因编码至少一种细胞标签。在一些实施方案中，该细胞标签是her1截短变体或cd20截短变体。在一些实施方案中，将所述多核苷酸引入工程化细胞中。本文进一步公开了一种用于在靶细胞附近的宿主细胞中表达细胞因子的系统，其中该系统包含：(a)宿主细胞，其编码：(i)选择性地结合在靶细胞中表达的预定细胞表面蛋白质的工程化受体构建体；(ii)工程化基因开关多肽，其中该工程化基因开关多肽包含反式激活域、dna结合域和配体结合域中的一种或多种；和(iii)由连接至被所述工程化基因开关多肽调节的启动子的异源基因表达的细胞因子；以及(b)配体；使得当在所述配体的存在下，所述工程化受体构建体与所述细胞表面蛋白质结合后，由靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含嵌合抗原受体。在一些情况下，该嵌合抗原受体结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2。在一些情况下，该嵌合抗原受体结合egfrviii。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含工程化t细胞受体。在一些情况下，所述细胞因子是il-2、il-15、il-12、il-21或il-15与il-15rα的融合体。在一些情况下，所述细胞因子是il-12。在一些情况下，所述宿主细胞进一步编码至少一种细胞标签。在一些情况下，该细胞标签是her1截短变体或cd20截短变体。本文进一步提供了一种从靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子的方法，该方法包括在配体的存在下使本文公开的系统与所述靶细胞接触。本文进一步提供了一种调节从靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子的方法，该方法包括在配体的存在下使本文公开的系统与靶细胞接触，以及调节配体的量。在一些情况下，与在所述配体的存在下的表达相比，在不存在所述配体的情况下，所述表达减少或消除。在一些情况下，通过提供额外量的所述配体来复苏所述表达。在一些情况下，所述宿主细胞是动物细胞或哺乳动物细胞。在一些情况下，该哺乳动物细胞是人细胞。在一些情况下，该哺乳动物细胞是t细胞、nk细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，靶细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，所述系统被包含在一个或多个载体中。在一些情况下，每个载体包含质粒。在一些情况下，每个载体包含表达质粒。在一些情况下，每个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些情况下，该非病毒载体包括睡美人转座酶和sb转座子。本文进一步公开了一种用于结合egfrviii的多肽，其中该多肽包含与seqidno：233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243或244所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述多肽在工程化效应细胞中表达。在一些情况下，该效应细胞是免疫效应细胞。在一些情况下，该免疫效应细胞是t细胞、nk细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，所述多肽包含抗体或其片段。在一些情况下，所述多肽包含嵌合抗原受体(car)。在一些情况下，所述egfrviii结合所述抗体或其片段的scfv抗原结合域或所述car。在一些情况下，所述多肽不与野生型egfr交叉反应。本文进一步公开了一种多核苷酸，其编码：a)能够结合egfrviii的工程化受体构建体；b)包含反式激活域和核受体配体结合域的第一多肽；和(c)包含dna结合域和核受体配体结合域的第二多肽；其中f/t2a连接体连接工程化受体构建体、第一多肽和第二多肽中的至少两种。在一些情况下，所述f/t2a连接体将所述工程化受体构建体与所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种连接。在一些情况下，所述f/t2a连接体将第一多肽与所述第二多肽连接。在一些情况下，所述多核苷酸进一步编码ires连接体。在一些情况下，该ires连接体将第一多肽与第二多肽连接。本文进一步公开了一种包含本文公开的多核苷酸的效应细胞。在一些情况下，该效应细胞编码与能够被所述第一多肽或所述第二多肽调节的诱导型启动子连接的异源基因。本文进一步公开了一种能够结合egfrviii的嵌合抗原受体(car)，其中该car包含：(a)egfrviii结合区；(b)跨膜区；和(c)连接所述跨膜区与所述egfrviii结合区的间隔区，其中该间隔区包含含有至少一个二聚化位点的茎区，和含有与该茎区具有至少75％序列同一性的序列的茎延伸区。本文进一步公开了一种工程化效应细胞，其包含：(a)在所述工程化效应细胞表面的、有效结合egfrviii分子或其变体的egfrviii结合部分；(b)工程化基因开关多肽，其中该工程化基因开关多肽包含反式激活域、dna结合域和配体结合域中的一种或多种；和(c)编码细胞因子的异源基因，该异源基因由被所述工程化基因开关多肽调节的启动子控制。附图说明在所附权利要求书中具体阐述了本公开内容的特征。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开内容的特征和优点获得更好的理解，在附图中：图1是适于遗传修饰t细胞的睡美人(sb)系统的示意图。将表达sb转座子系统即sb11、膜结合的il-15(mbil-15)和嵌合抗原受体(car)的dna质粒转染至外周血单核细胞(pbmc)，以重定向t细胞特异性。在设计者活化和增殖细胞(aapc)上稳定表达整合体的t细胞被增殖并扩充。图2a-2d示意性地说明了不同配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。所描绘的示例性car可包括cd19car。ef1a启动子是示例性的组成型启动子。图3是配体诱导型基因开关多肽的多载体系统的示意图。图4描绘了在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第1天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。构建体1、4、5、6、7和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图5描绘了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第21天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。在流式细胞术分析前48小时加入配体。构建体1、4、5、6和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图6描绘了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第29天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。在配体添加后开启mbil-15的表达。构建体1、4、5、6、7和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图7显示了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第35天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。配体撤除后mbil-15的表达关闭。构建体1、4、5、6和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图8显示了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第40天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbil-15的表达在重新引入配体后得到保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图9显示了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第48天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbil-15的表达在重新引入配体后连续保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图10显示了在cd19特异性car阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下核转染后第50天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbil-15的表达在重新引入配体后连续保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2a-2d中示意性描绘的构建体。图11显示了在存在和不存在本文所述的配体的情况下核转染后第29、33、35和40天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中mbil-15表达的定量rt-qpcr分析，证明了该基因开关对mbil-15表达的配体依赖性调节。图12显示了细胞存活试验的结果，其说明配体调节的mbil-15表达在不存在il-2和il-21细胞因子的情况下促进优先的car-t细胞存活。图13a、13b、13c和13d显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了veledimex配体的剂量响应。图13d显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了veledimex配体的剂量响应。在fsc/ssc/live/cd3+上对细胞进行门控。在与100nm、25nm、6.25nm、1.56nm、0.4nm和0nm(dmso对照)的veledimex孵育2天后取样。图14是在存在/不存在veledimex配体的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中mb-il-15表达的western印迹分析。图15a和图15b是本文所述的通用多样化配体诱导型基因开关载体系统的不同结构组分的示意性描绘。在该示意图中，“pr”代表启动子；“ip”是用于基因转录的基因开关配体诱导型启动子；“5′utr”是5′非翻译区(用于转录成mrna)；“goi”、“goi-1”、“goi-2”是将被转录并仅表达为mrna(例如，sirna)或表达为mrna和多肽的目的基因(或第一个(goi-1)和第二个goi(goi-2))；“连接体”“是可切割的或核糖体跳跃连接体序列；”tad“是转录反式激活域(例如但不限于来自疱疹病毒的vp16tad)；”lbd“是核受体配体结合域(例如但不限于usp结构域、rxr结构域或嵌合体(例如，usp/rxr嵌合体)和来源于脊椎动物和无脊椎动物物种的置换突变lbd结构域)；“dbd”是dna结合域(例如但不限于gal4dbd)；“ecr”是蜕皮素受体配体结合域，包括截短的和置换突变的ecr结构域(如ecr结构域，其赋予在体外和体内在甾类和/或非甾类配体(激动剂)的存在下形成活性转录激活复合物的能力；包括甾类配体(如百日青蜕皮酮a和幕黎甾酮a)和非甾类配体(如二酰基肼、虫酰肼和甲氧虫酰肼)；“可选的goi”是将被转录并表达为mrna或多肽的任何可选的目的基因；而“bdpolya”是双向聚腺苷尾序列。图16a和图16b是本文所述的多样化配体诱导型基因开关载体系统的不同结构组分的示意性描绘。图17是具有重组酶附着位点的示例性配体诱导型基因开关载体系统的示意性描述。此类系统可利用重组酶(如丝氨酸重组酶)将单一载体整合到免疫细胞(例如，t细胞)中。图18a是描绘在第1、8和15天的％car阳性t细胞的表格。使用丝氨酸重组酶(sf370)介导的整合，修饰此类t细胞，以从单一载体表达car和基因开关控制的mbil-15(rts-mbil15)。图18b描绘了在第15天，在存在和不存在veledimex时mbil-15表达的诱导。该图还显示了在第22天去除veledimex后mbil15表达的丧失。图18c是rts-mbil15-组成型car构建体的示例性描绘。图19a-b示意性地说明了在组成型或t细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图20a示意性地说明了在组成型或t细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图20b-20e显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了mbil-15的表达依赖于t细胞活化(加入cona)和veledimex的存在。构建体1-6对应于如图20a中示意性描绘的构建体。图21a-21b描绘了il-12的各种构型。图22示意性地说明了在组成型或诱导型启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图23示意性地说明了多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分，其用来在组成型、诱导型启动子或组织特异性启动子(pr)的控制下表达不同形式的il-12。il-12可以被表达为单链il-12、膜结合的il-12或通过p35和p40结构域的单独表达。图24a-24d示意性地说明了在组成型或诱导型启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图25a-25b示意性地说明了在组成型、诱导型或t细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图26显示了定量流式细胞术分析，其描绘了通过使用多个供体与aapc共培养经由连续刺激离体扩充的egfrviiicart细胞中car的表达。图27显示了在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞产生il-12。图28显示了il-12表达水平的分析。图28a显示了在不存在细胞活化的情况下，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的il-12表达水平。图28b显示了在抗原特异性激活后，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的il-12表达水平。图29显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在aapc和veledimex配体(溶剂：dmso)的情况下共培养的细胞中il-12表达水平的分析。图30a和30b显示了il-12表达水平的时程分析。图30a显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)且不存在aapc的情况下共培养的细胞的il-12表达水平。在24小时时添加配体，并在48小时时撤除配体。图30b显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在veledimex配体(溶剂：dmso)且存在aapc的情况下共培养的细胞的il-12表达水平。在24小时时添加配体，并在48小时时撤除配体。在添加配体后24、48和120小时对il-12的表达进行定量。图31a和31b显示了il-12表达水平的分析。图31a显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并且通过预先在不含veledimex的培养基中与aapc共培养而扩充(循环1)的细胞在存在/不存在veledimex和aapc时的il-12表达水平。图31b显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并且通过预先在培养基中与aapc共培养而扩充(循环1)的细胞在存在/不存在veledimex和aapc时的il-12产生。图32a和32b显示了il-12表达水平的分析。图32a显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的il-12产生。在时间0时加入veledimex配体，在48小时时撤除，在168小时时再次加入，并在216小时时撤除。图32b显示了通过流式细胞术分析，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中的car表达。细胞在cd3阳性群体上门控。图33显示了在存在veledimex且存在(循环1)/不存在(循环2)aapc的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的il-12表达水平。图34显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的veledimex剂量依赖性il-12表达。图35显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生并以1∶1的效应物：靶细胞比与靶细胞共培养的car-t细胞的ifnγ产生。使用car-t细胞与el4、el4egfrviii靶细胞以及无靶细胞(单独的效应物)对照的共培养来测量ifnγ的产生。图36a和36b显示了car-t细胞的特异性细胞毒性。图36a显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生的car-t细胞的ifnγ产生。将效应car-t细胞与u87mg、u87mg-fluc-gfp、u87mg-egfrviii-fluc-gfp、u251mg、u251mg-fluc-gfp和u251mg-egfrviii-fluc-gfp靶细胞以1∶1的效应物：靶细胞比共培养24小时，之后在培养上清液中分析ifnγ表达。图36b显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生的car-t细胞对表达egfrviii的胶质母细胞瘤细胞的％裂解。将效应car-t细胞与el4、表达el4的egfrviii、k562和表达k562的egfrviii靶细胞系以不同的效应物：靶细胞比共孵育。具体实施方式以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应该理解，本公开内容不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。所有术语旨在被理解成它们将被本领域技术人员所理解的那样。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文使用的章节标题仅用于组织结构目的，不应解释为限制所描述的主题。尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本公开的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单个实施方案中实现。定义以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。在本申请中，除非另外明确指出，否则单数的使用包括复数。必须注意，如在本说明书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另外指出，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用并非限制性的。本说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其它实施方案”的提及意指关于该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其它未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。术语“约”或“大约”意指如本领域普通技术人员所测定的，在特定值的可接受误差范围内，其将部分依赖于该值是如何测量或确定的，即测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差之内。或者，“约”可指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。在另一个实例中，“约10”的量包括10以及9至11的任何量。在又一个实例中，关于参考数值的术语“约”还可以包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。或者，尤其是对于生物系统或过程，术语“约”可指在某个值的数量级之内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。当特定值在本申请和权利要求书中描述时，除非另有说明，否则应假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。如本文所用的术语“分离的”及其语法等同语是指将核酸从其天然环境中取出。如本文所用的术语“纯化的”及其语法等同语是指纯度增加的分子或组合物，无论是从自然界中取出的(包括基因组dna和mrna)还是在实验室条件下合成(包括cdna)和/或扩增的，其中“纯度”是一个相对的术语，而不是“绝对纯度”。然而，应该理解，核酸和蛋白质可以与稀释剂或佐剂一起配制，而出于实际目的仍然是分离的。例如，当用于引入细胞中时，核酸通常与可接受的载体或稀释剂混合。如本文所用的术语“基本上纯化的”及其语法等同语是指这样的核酸序列、多肽、蛋白质或其它化合物，其基本上不含，即超过约50％不含、超过约70％不含、超过约90％不含与该核酸、多肽、蛋白质或其它化合物天然关联的多核苷酸、蛋白质、多肽和其它分子。如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸或核酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸——的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链dna、三链dna以及双链和单链rna。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。如本文所用的“多肽”、“肽”、“蛋白质”及其语法等同语是指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其它修饰的蛋白质。本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环已烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、s-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环已基丙氨酸、环已基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、n’-苄基-n’-甲基-赖氨酸、n’，n’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环已烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)--羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括n-连接的和o-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码dna天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是同源的。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。用于确定序列同一性百分比的方法(例如，使用默认参数的blastp和blastn)在本文中描述并且通常是可获得的。在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”及其语法等同语或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。如本文所用的，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为约50至约200个，更通常为约100至约150个，其中可在两个序列最佳对齐后，将序列与相同连续位置数目的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以通过以下方法来进行：smith和waterman，adv.appl.math.，2：482(1981)的局部同源性算法；needleman和wunsch，j.mol.biol.，48：443(1970)的比对算法；pearson和lipman，proc.nat.acad.sciu.s.a.，85：2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(包括但不限于intelligentics，mountainviewcalif.的pc/gene程序中的clustal，wisconsingeneticssoftwarepackage，geneticscomputergroup(gcg)，575sciencedr.，madison，wis.，u.s.a.中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta)；clusal程序由以下文献很好地描述：higgins和sharp，gene，73∶237-244(1988)以及higgins和sharp，cabios，5：151-153(1989)；corpet等人，nucleicacidsres.，16：10881-10890(1988)；huang等人，computerapplicationsinthebiosciences，8：155-165(1992)；和pearson等人，methodsinmolecularbiology，24：307-331(1994)。通常还通过检查和手动对齐来进行比对。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段至少80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过blastp(或clustal，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过blastn(或clustal，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳对齐时，根据两个分子最佳对齐的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。当应用于核酸或氨基酸序列时，术语“基本上相同的”及其语法等同语的意思是，使用以上描述的程序，例如blast，使用标准参数，核酸或氨基酸序列包含的序列与参考序列相比具有至少90％或更高、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性。例如，blastn程序(对于核苷酸序列)使用以下默认值：字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序使用以下默认值：使用字长(w)为3，期望值(e)为10，以及blosum62评分矩阵(参见henikoff&henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89：10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列来确定序列同一性的百分比，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)，以使两个序列最佳比对。如下计算百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在实施方案中，基本同一性存在于长度至少约为50个残基的序列区域上，至少约100个残基的区域上，并且在实施方案中，序列在至少约150个残基上基本相同。在实施方案中，序列在编码区的整个长度上基本相同。“转座子”或“转座因子”(te)是可以改变其在基因组内的位置的载体dna序列，其有时产生或逆转突变并改变细胞的基因组大小。转座经常导致te的复制。i类te在两个阶段中拷贝：首先，它们从dna转录为rna，然后所产生的rna被逆转录为dna。然后，拷贝的dna插入基因组的新位置。逆转录步骤由逆转录酶催化，该逆转录酶可以由te本身编码。逆转录转座子的特征类似于逆转录病毒，如hiv。ii类te的剪切-粘贴转座机制不涉及rna中间体。转座由几种转座酶催化。一些转座酶非特异性地结合dna中的任何靶位点，而其它转座酶结合特定的dna序列靶标。转座酶在靶位点处进行交错剪切，从而产生单链5’或3’dna突出端(粘端)。该步骤切下dna转座子，然后将其连接到新的靶位点；该过程涉及补平缺口的dna聚合酶和封闭糖-磷酸骨架的dna连接酶的活性。这导致靶位点的复制。dna转座子的插入位点可以通过短的定向重复序列(其可以通过在靶dna中交错剪切并通过dna聚合酶补平而产生)和随后的对转座酶切除te至关重要的一系列反向重复序列来鉴定。如果当在细胞周期的s期中供体位点已被复制但靶位点尚未复制时发生剪切-粘贴te的转座，则该剪切-粘贴te可以被复制。在i类和ii类te中，转座可被分为“自主的”或“非自主的”。自主te可以自己移动，而非自主te的移动需要存在另一te。这通常是因为非自主te缺乏转座酶(对于ii类)或逆转录酶(对于i类)。“转座酶”是指结合至转座子末端并通过剪切-粘贴机制或复制转座机制催化转座子移动到基因组另一部分的酶。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体移动到基因组。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体(例如转座子)移动到基因组。在某些实施方案中，睡美人转座酶作为mrna提供。在一些方面，该mrna包含帽和poly-a尾。可以通过“转染”、“转化”、“核转染”或“转导”将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。如本文所用的，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙dna共沉淀(参见，例如，murraye.j.(编著)，methodsinmolecularbiology，vol.7，genetransferandexpressionprotocols，humanapress(1991))；deae-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston，nature，346：776-777(1990))；以及磷酸锶dna共沉淀(brash等人，mol.cellbiol.，7：2031-2034(1987))；和核转染(trompeter等人，j.immunol.methods274：245-256(2003))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。如本文所用的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生或过表达的任何抗原物质。例如，它可以在宿主中触发免疫应答。或者，对于本公开内容来说，肿瘤抗原可以是由健康和肿瘤细胞均表达的蛋白质，但因为它们标识出某种肿瘤类型，所以是合适的治疗靶标。在实施方案中，肿瘤抗原是cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2。在一个实施方案中，该肿瘤抗原是egfrviii，它是用于治疗髓系恶性肿瘤，例如胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(gbm)的cart细胞疗法的靶标。在另一个实施方案中，该肿瘤抗原是cd19。在又一个实施方案中，该肿瘤抗原是cd33。如本文所用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的dna序列。增强子可以位于远离核酸序列编码区的数千碱基处，并且可以介导调节因子的结合、dna甲基化的模式或dna结构的改变。来自多种不同来源的大量增强子是本领域公知的，并且可作为克隆的多核苷酸(来自诸如atcc等保藏中心以及其它商业或个体来源)或在克隆的多核苷酸内获得。许多包含启动子(如常用的cmv启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可位于编码序列的上游、内部或下游。术语“ig增强子”是指衍生自定位于免疫球蛋白(ig)基因座内的增强子区域的增强子元件(这样的增强子包括例如重链(μ)5’增强子、轻链(κ)5’增强子、κ和μ内含增强子和3’增强子)(一般性地参见paulw.e.(编著)，fundamentalimmunology，第3版，ravenpress，newyork(1993)，第353-363页；以及美国专利5,885,827)。如本文所用的“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸区段。该区域或序列由5′端附近的起始密码子和3′端附近的终止密码子来界定。编码序列也可以被称为开放阅读框。如本文所用的“可操作地连接的”是指dna区段与另一dna区段的物理和/或功能连接，从而允许这些区段以其预期方式起作用。当编码基因产物的dna序列与调节序列如启动子、增强子和/或沉默子以某种方式连接，使得允许直接或间接调节该dna序列的转录时，该dna序列与调节序列可操作地连接。例如，当dna序列与启动子在启动子的转录起始位点下游连接，与该转录起始位点符合正确的阅读框架，并允许转录延伸通过该dna序列进行时，该dna序列与该启动子可操作地连接。当增强子或沉默子以某种方式连接到编码基因产物的dna序列上，从而分别增加或减少该dna序列的转录时，该增强子或沉默子与该dna序列可操作地连接。增强子和沉默子可位于dna序列的编码区的上游、下游或嵌入其中。如果信号序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则该信号序列的dna与编码该多肽的dna可操作地连接。dna序列与调节序列的连接通常通过在合适的限制位点连接或通过使用本领域技术人员已知的限制性内切核酸酶插入该序列中的衔接子或连接体来完成。术语“转录调节物”是指这样的生化元件，其在某些环境条件下用来阻止或抑制启动子驱动的dna序列的转录(例如，阻遏物或核抑制蛋白)，或者在某些环境条件下用来允许或刺激启动子驱动的dna序列的转录(例如，诱导物或增强子)。如本文所用的术语“诱导”及其语法等同语是指相对于一定的基础转录水平，由转录调节物引起的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的增加。“靶”基因或“异源”基因或“目的基因(goi)”是指通过基因转移引入宿主细胞中的基因。示例性的goi可以是抗原结合多肽，其可以包括如本文所述的抗原结合多肽、嵌合受体、car、tcr、细胞因子和/或细胞标签。如本文所用的“重组酶”是指可以促进在限定位点之间的位点特异性重组的一组酶，其中这些位点在单个dna分子上物理分离，或者这些位点位于单独的dna分子上。所定义的重组位点的dna序列不一定是相同的。重组的起始取决于蛋白质-dna相互作用，在该组内有大量蛋白质催化噬菌体整合和切除(例如，λ整合酶、.φc31)、循环质粒的解离(例如，tn3、gammadelta、cre、flp)、用于表达替代基因的dna反转(例如，hin、gln、pin)、发育期间基因的装配(例如，鱼腥藻(anabaena)固氮基因)和转座(例如，is607转座子)。基于进化和机制相关性，大多数位点特异性重组酶属于两个家族之一。它们是.λ整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如cre、flp、xerd)和解离酶(resolvase)/整合酶家族或丝氨酸重组酶家族(例如，φc31、tp901-1、tn3、gammadelta)。“重组附着位点”是被本文所述的重组酶识别的特定多核苷酸序列。通常，涉及两个不同的位点(称为“互补位点”)，一个存在于靶核酸(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)中，另一个存在于待整合至目标重组位点的核酸上。本文使用术语“attb”和“attp”，它们分别是指最初来自细菌靶标和噬菌体供体的附着(或重组)位点，尽管针对特定酶的重组位点可能具有不同的名称。重组位点通常包括由核心或间隔区隔开的左臂和右臂。因此，attb重组位点由bob′组成，其中b和b′分别是左臂和右臂，而o是核心区。类似地，attp是pop′，其中p和p′是臂，而o是核心区。在attb与attp位点之间重组并且核酸同时整合到靶标上时，整合dna侧翼的重组位点被称为“attl”和“attr”。使用上述术语，attl和attr位点因此分别由bop′和pob′组成。在本文的一些表示中，省略“o”，并且例如将attb和attp分别表示为bb′和pp′。基因表达的调节在遗传工程领域，对基因表达的精确控制是用于研究、操纵和控制发育和其它生理过程的有价值的工具。基因表达是涉及许多特定蛋白质-蛋白质相互作用的复杂生物学过程。紧密调节的诱导型基因表达系统或“基因开关”可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。然而，对于治疗，受调节的和局部化的表达对于防止脱靶效应是重要的。本文提供了在需要时和在靶细胞或位置的特定附近调节异源基因如细胞因子的表达的手段。本文进一步提供了调节异源基因如细胞因子的表达的方法，其中该细胞因子例如在配体诱导型启动子的控制下。在一些情况下，该方法在不存在配体的情况下导致异源基因表达的基础水平低或没有。在进一步的实施方案中，配体诱导型启动子是基因开关配体诱导型启动子。本文进一步提供了调节从工程化细胞表达异源基因如细胞因子的方法。本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源性状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)。在一些情况下，工程化细胞可以是工程化的免疫效应细胞。在一种情况下，工程化细胞是t细胞。在另一种情况下，工程化细胞是nk细胞。在一种情况下，在用配体诱导异源基因的表达之前，活化工程化细胞。在另一种情况下，通过将细胞暴露于抗原来活化工程化细胞。该抗原可以是被工程化细胞表达的抗原结合多肽识别的抗原。该抗原可以是肿瘤抗原或传染病抗原。在一种情况下，工程化细胞可包含结合这样的抗原的抗原结合多肽。在另一种情况下，基因开关配体诱导型启动子的基因开关组分可以通过组织特异性启动子进一步调节。在这类情况下，基因开关组分仅在组织特异性启动子被激活时表达，例如，在活化的t细胞或活化的nk细胞中表达。载体“表达载体”或“载体”是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)或通过插入宿主细胞染色体中而能够复制，其已附接有另一多核苷酸区段，以便实现所附接的区段的复制和/或表达。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可含有实现载体连接或插入所需宿主细胞中以及实现附接区段的表达所必需的多核苷酸序列。这样的序列根据宿主生物体而不同；它们包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。或者，表达载体可以能够直接表达其中编码的核酸序列产物，而无需载体连接或整合到宿主细胞dna序列中。载体还可以包含“选择标记基因”。如本文所用的，术语“选择标记基因”是指在相应选择剂的存在下允许表达核酸序列的细胞被特异性选择或排除的核酸序列。合适的选择标记基因是本领域已知的，并描述于例如国际专利申请公开wo1992/08796和wo1994/28143；wigler等人，proc.natl.acad.sci.usa，77：3567(1980)；o’hare等人，proc.natl.acad.sci.usa，78：1527(1981)；mulligan&berg，proc.natl.acad.sci.usa，78：2072(1981)；colberre-garapin等人，j.mol.biol.，150：1(1981)；santerre等人，gene，30：147(1984)；kent等人，science，237：901-903(1987)；wigler等人，cell，11：223(1977)；szybalska&szybalski，proc.natl.acad.sci.usa，48：2026(1962)；lowy等人，cell，22：817(1980)；和美国专利5,122,464和5,770,359。在一些实施方案中，所述载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在适当选择压力的存在下作为dna的染色体外区段存在于宿主细胞内(参见，例如，conese等人，genetherapy，11：1735-1742(2004))。代表性的可商购的附加型表达载体包括但不限于利用eb核抗原1(ebna1)和eb病毒(ebv)复制起点(orip)的附加型质粒。来自invitrogen(carlsbad，calif.)的载体prep4、pcep4、prep7和pcdna3.1以及来自stratagene(lajolla，calif.)的pbk-cmv代表了使用t-抗原和sv40复制起点来代替ebna1和orip的附加型载体的非限制性实例。如本文所用的，“基因表达盒”是载体的一部分，并且可含有组成型启动子如ef1a或诱导型启动子、5’utr、3’utr和polya元件以及一种或多种目的基因(goi)。在一个实施方案中，polya元件是sv40epolya(seqidno65)。在另一个实施方案中，polya元件是双向acapolya(seqidno66)。在另一个实施方案中，polya是pa2polya(seqidno67)。在一些方面，基因表达盒可以进一步包含基因开关组分，例如与核受体配体结合域融合的dna结合域和/或与核受体配体结合域融合的反式激活域。载体可包括一个或多个基因表达盒。载体修饰可用于本文所述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是优良生产规范(gmp)兼容的载体。例如，gmp载体可能比非gmp载体更纯。在一些情况下，纯度可以通过生物负荷来测量。例如，生物负荷可以是在载体组合物中存在或不存在需氧菌、厌氧菌、产芽孢菌、真菌或其组合。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素的或无内毒素的。纯度也可以通过双链引物步移测序来测量。质粒身份可以是确定载体纯度的来源。本公开内容的gmp载体可以比非gmp载体纯10％至99％。如通过存在生物负荷、内毒素、测序或其组合所测量的，gmp载体可以比非gmp载体纯10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些情况下，使用第一基因程序结束时的终止子序列。终止子序列可确保转录物在启动第二个基因程序之前终止。例如，表达载体可以含有终止转录和稳定mrna所必需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5′非翻译区以及偶尔从3′非翻译区获得。这些区域可以含有在mrna的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。包含表达载体的细胞在提供所需多肽表达的条件下于体内或体外生长。在一些情况下，可以在由载体中的多核苷酸编码的第一多肽的末端使用间隔区序列。在其它情况下，可以在载体中的第二个基因的末端使用间隔区序列。也可以在载体中的第一个基因和第二个基因之后使用间隔区序列。这些载体可用来表达由基因或目的基因的一部分编码的多肽。部分基因或基因可以通过使用任何(病毒性或非病毒性)方法插入。例如；一种方法可以是基于非病毒的技术。ires元件本文还公开了包含ires元件的构建体，以促进本文所述的多核苷酸和多肽的表达和功能。如本文所用的术语“内部核糖体进入位点(ires)”可旨在表示内部核糖体进入位点。在包含ires序列的载体中，第一基因可以通过具有其自身5′-utr的帽依赖性核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译可以通过以帽非依赖性方式直接将核糖体募集至ires来完成。ires序列可以允许真核核糖体结合并在不与5′加帽端结合的情况下开始翻译。ires序列可以允许从一个转录物表达多个基因(mountford和smith1995)。如本文所用的术语“cap”或“帽”是指经修饰的核苷酸，通常是7-甲基鸟苷，其以3′至5′(7meg-ppp-g)连接至真核nrna的5′端，其在从该mrna表达蛋白质的过程中充当正常翻译起始途径中的必需元件。在某些情况下，ires区域可以来源于病毒，如小核糖核酸病毒、脑心肌炎病毒、丙型肝炎病毒ires序列。在其它情况下，ires序列可以来源于脑心肌炎病毒。如本文所用的术语“emcv”或“脑心肌炎病毒”是指小核糖核酸病毒科的属的脑心肌炎病毒种的任何成员分离物或毒株。实例为：emcv-r(rueckert)毒株病毒，columbia-sk病毒。在一些情况下，可以使用细胞ires元件，诸如真核起始因子4g、免疫球蛋白重链结合蛋白、c-myc原癌基因、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子-1ires或其任何组合或修饰。在一些情况下，细胞ires与病毒ires相比可以具有增加的基因表达。病毒、细胞或其组合的ires序列可在载体中使用。ires可以来自脑心肌炎病毒(emcv)或脊髓灰质炎病毒(pv)。在一些情况下，ires元件选自脊髓灰质炎病毒(pv)、脑脊髓炎病毒(emcv)、口蹄疫病毒(fmdv)、猪捷申病毒-1(ptv-1)、爱知病毒(aiv)、塞尼卡谷病毒(svv)、丙型肝炎病毒(hcv)、经典猪瘟病毒(csfv)、人免疫缺陷病毒-2(hiv-2)、人免疫缺陷病毒-1(hiv-1)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人巨细胞病毒潜伏(pul138)、eb病毒(ebna-1)、疱疹病毒马立克氏病(mdvrlorf9)、sv40多顺反子19s(sv4019s)、禾谷缢管蚜病毒(rhpv)、蟋蟀麻痹病毒(crpv)、茶尺蠖小rna样病毒(eopv)、大豆尺蠖病毒(psiv)、吸血猎蝽病毒(trv)、蜜蜂麻痹双顺反子病毒(iapv，kbv)、黑醋栗逆转病毒(brv)、天竺葵花破裂病毒(pfbv)、木槿属褪绿环斑病毒(hcrsv)、感染十字花科的烟草花叶病毒(crtmv)、马铃薯卷叶病毒(plrv)、烟草蚀纹病毒(tev)、贾第虫病毒(glv)、利什曼虫rna病毒-1(lrv-1)及其组合或修饰。在一些情况下，ires选自apaf-1、xiap、hiap2/c-iap1、dap5、bc1-2、c-myc、cat-1、inr、分化lef-1、pdgf2、hif-1a、vegf、fgf2、bip、bag-1、cirp、p53、shmt1、pitslrep58、cdk1、rpr、hid、hsp70、grim、skl、antennapedia、dfoxo、dinr、adh-adhr、hsp101、adh、ure-2、gpr1、nce102、ymr181a、msn1、boi1、flo8、gic1及其任何组合或修饰。当ires元件被包含在两个开放阅读框(orf)之间时，翻译的启动可以通过第一orf中的规范5′-m7gpppn帽依赖性机制和ires元件下游的第二orf的帽非依赖性机制而发生。在一些情况下，基因可以通过内部核糖体进入位点(ires)连接。ires可以允许同时表达多个基因。例如，ires序列可以允许从单个mrna转录物产生多种蛋白质。核糖体可以以5′帽非依赖性方式与ires结合并启动翻译。在一些情况下，ires序列可以是500个碱基对或可以是约500个碱基对。ires序列可以是300个碱基对至1000个碱基对。例如，ires可以是300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对长。在一些情况下，可以降低包含ires序列的载体内的下游基因的表达。例如，ires序列之后的基因可以比ires序列之前的基因表达降低。表达降低可以是与前面的基因相比1％至99％的降低。在某些实施方案中，ires是emcvires，其包含与seqidno18的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列连接体还公开了包含连接体以促进本文所述多核苷酸和多肽的表达和功能性的构建体。在一些实施方案中，多核苷酸连接体可以在本文所述的多核苷酸中使用。多核苷酸连接体可以是含有所需限制位点的dna的双链区段，该限制位点可以被添加以产生与包含本文所述多核苷酸的载体相容的末端结构。在一些情况下，多核苷酸连接体可用于修饰包含本文所述多核苷酸的载体。例如，包含多核苷酸连接体的载体修饰可以是多克隆位点的改变，或聚组氨酸尾的添加。多核苷酸连接体也可用于使钝性插入dna的末端适应克隆到用限制酶切割的、具有粘端的载体中。多核苷酸连接体的使用可以比向载体中的钝端连接更有效，并且可以提供在下游应用中从载体释放插入物的方法。在一些情况下，插入物可以是编码可用于治疗应用的多肽的多核苷酸序列。在一些情况下，连接体可以是可切割的连接体。多核苷酸连接体可以是寡聚体。多核苷酸连接体可以是dna双链、单链或其组合。在一些情况下，连接体可以是rna。在一些情况下，多核苷酸连接体可以通过t4连接酶连接到包含本文所述多核苷酸的载体中。为了促进连接，可将过量的多核苷酸连接体添加到包含插入物和载体的组合物中。在一些情况下，插入物和载体在引入连接体之前进行预处理。例如，用甲基化酶预处理可以防止插入物dna的不希望的切割。在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码间插连接体多肽的间插序列隔开。本文中，术语“间插连接体多肽”是指隔开由多核苷酸编码的两个或更多个多肽的氨基酸序列，与术语“肽连接体”不同，后者是指任选地包括在本文公开的多肽构建体中的氨基酸序列，以将跨膜结构域连接至细胞表面多肽(例如，包含天然多肽的截短变体)。在某些情况下，间插连接体是易切割的间插连接体多肽。在一些实施方案中，该连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体。在一些实施方案中，该可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列选自2a、gsg-2a、gsg连接体、sgsg连接体、furinlink变体及其衍生物。在一些实施方案中，该2a连接体是p2a连接体、t2a连接体、f2a连接体或e2a连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的间插连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的间插连接体多肽可以是以下任何一种或多种：f/t2a、t2a、p2a、2a、gsg-p2a、gsg连接体和furinlink变体。在某些实施方案中，该连接体多肽包含下表中公开的那些：表1.连接体氨基酸序列和多核苷酸序列在一些实施方案中，间插连接体多肽包含与whitlow连接体(seqidno146)、gsg连接体(seqidno148)、sgsg连接体(seqidno149)、(g4s)3连接体(seqidno150)、弗林蛋白酶切割位点/furlink1(seqidno151)、fmdv连接体(seqidno152)、thoseaasigna病毒2a区(t2a)(seqidno153)、弗林蛋白酶-gsg-t2a(seqidno154)、弗林蛋白酶-sgsg-t2a(seqidno155)、猪捷申病毒-12a区(p2a)(seqidno156)、gsg-p2a(seqidno157)、马鼻炎a病毒2a区(e2a)(seqidno158)或口蹄疫病毒2a区(f2a)(seqidno：159)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，间插连接体多肽包含与连接体的氨基酸序列(seqidno147、161或162)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，可以使用病毒2a序列。2a元件可以比ires更短，其具有5至100个碱基对。在一些情况下，2a序列可以在长度上具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100个核苷酸。2a连接的基因可以在一个单开放阅读框中表达，并且“自切割”可以共翻译地发生在2a多肽的c-末端处的最后两个氨基酸gp之间，产生等量的共表达的蛋白质。病毒2a序列可以是约20个氨基酸。在一些情况下，病毒2a序列可以含有共有基序asp-val/ile-glu-x-asn-pro-gly-pro。共有基序序列可以共翻译地起作用。例如，可以防止在甘氨酸与脯氨酸残基之间形成正常的肽键，其可以导致核糖体跳跃和新生多肽的切割。这种效应可以产生等摩尔水平的多种基因。2a肽可允许将多个蛋白质在单个开放阅读框中翻译成多肽，该多肽随后可通过核糖体跳跃机制(funston，kallioinen等人2008)“切割”成单个多肽。在一些实施方案中，2a序列可以包括：f/t2a、t2a、p2a、2a、t2a、e2a、f2a和bmcpv2a、bmifv2a及其任何组合。在一些情况下，载体可以包含ires序列和2a连接体序列。在其它情况下，用2a肽连接的多个基因的表达可以通过2a肽之前的间隔区序列(gsg)来促进。在一些情况下，构建体可以组合间隔区、连接体、衔接子、启动子或其组合。例如，连接体可以具有带有不同2a肽的间隔区(sgsg或gsg或whitlow连接体)和弗林蛋白酶连接体(r-a-k-r)切割位点。间隔区可以是i-ceui。在一些情况下，可以对连接体进行工程化。例如，可以将连接体设计为包含化学特性，如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。在其它情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因可以被至少两个连接体隔开，如图2和图3所示。在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码连接体多肽的间插序列隔开。在某些情况下，该连接体是易切割的连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的连接体多肽可以是以下任一种或两种：以下所述的furinlink、fmdv、p2a、gsg-p2a和/或fp2a。在一些情况下，连接体是apvkqgsg(seqidno161)。在某些情况下，连接体多肽可以包含氨基酸序列“rakr”(seqidno151)。在某些情况下，弗林蛋白酶连接体多肽可由包含“cgtgcaaagcgt”(seqidno6)或“agagctaagagg”(seqidno9)的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。连接体可以是柔性连接体、刚性连接体、体内可切割连接体或其任何组合。在一些情况下，连接体可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性连接体中)或在体内释放游离功能域，如同在体内可切割连接体中那样。连接体可以改善生物学活性、增加表达产率和实现理想的药代动力学谱。连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。在一些情况下，本文所述的连接体序列可以包括柔性连接体。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性连接体。柔性连接体可以由小的非极性(例如，gly)或极性(例如，ser或thr)氨基酸组成。柔性连接体可以具有主要由gly和ser残基(“gs”连接体)段组成的序列。柔性连接体的实例可以具有(gly-gly-gly-gly-ser)n(seqidno150)的序列。通过调整拷贝数“n”，可以优化该示例性gs连接体的长度以实现功能域的适当隔离或维持必需的结构域间相互作用。除gs连接体外，其它柔性连接体也可用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性连接体也可以富含小氨基酸或极性氨基酸如gly和ser，但可以含有另外的氨基酸如thr和ala以维持柔性。在其它情况下，可以使用极性氨基酸如lys和glu来提高溶解度。包含在本文所述连接体序列中的柔性连接体可以富含小氨基酸或极性氨基酸，如gly和ser，以提供良好的柔性和溶解度。当融合蛋白结构域需要特定的移动或相互作用时，柔性连接体可能是合适的选择。另外，虽然柔性连接体可能没有刚性结构，但它们可以用作惰性连接体以保持功能域之间的距离。可以调节柔性连接体的长度以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。在一些情况下，本文所述的连接体可以进一步包括刚性连接体。刚性连接体可以用来维持多肽结构域之间的固定距离。刚性连接体的实例可以是(举几个例子来说)：α-螺旋形成连接体、富含pro的序列、(xp)n、x-pro骨架、a(eaaak)na(n＝2-5)。在一些情况下，刚性连接体可以通过采用α-螺旋结构或通过包含多个pro残基来表现出相对僵硬的结构。在一些情况下，本文所述的连接体可以是可切割的。在其它情况下，连接体是不可切割的。不可切割的连接体可将功能域共价连接在一起，以在整个体内过程或体外过程中充当一个分子。连接体也可以是体内可切割的。可以引入可切割的连接体以在体内释放游离的功能域。举几个例子来说，可通过还原剂、蛋白酶的存在来切割可切割的连接体。例如，可以利用二硫键的还原来产生可切割的连接体。在二硫键连接体的情况下，通过与硫醇如谷胱甘肽的二硫键交换的切割事件可以产生切割。在其它情况下，重组融合蛋白中连接体的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶可在病理条件(例如癌症或炎症)下于特定细胞或组织中体内表达或约束于某些细胞区室内。在一些情况下，可切割的连接体可允许靶向切割。例如，许多蛋白酶的特异性可以在约束区室中提供较慢的连接体切割。可切割的连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。例如，腙可以赋予血清稳定性。在其它情况下，腙可以允许在酸性区室中切割。酸性区室可具有最高为7的ph。连接体还可以包含硫醚。硫醚可以是不可还原的。硫醚可以被设计用于细胞内蛋白水解降解。在某些实施方案中，fmdv连接体多肽包含可以与seqidno152至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，fmdv连接体多肽是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在某些情况下，fmdv连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(orf)核酸序列编码。在一些情况下，编码fmdv的orf包含seqidno7的序列或由之组成。在某些实施方案中，编码fmdv的多核苷酸与seqidno7至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些情况下，连接体多肽可以是“p2a”连接体。在某些实施方案中，p2a多肽可以包含与seqidno156可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(orf)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码p2a的orf包含seqidno11的序列或由之组成。在某些情况下，编码p2a的多核苷酸与seqidno11可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，连接体多肽可以是“gsg-p2a”连接体。在某些实施方案中，gsg-p2a连接体多肽可以包含与seqidno157可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，gsg-p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，gsg-p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(orf)核酸序列编码。编码gsg-p2a的orf可以包含seqidno12的序列。在一些情况下，编码gsg-p2a的多核苷酸与seqidno12可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。连接体多肽可以是本文提供的“fp2a”连接体。在某些实施方案中，fp2a连接体多肽可以包含与seqidno160可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些情况下，fp2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，fp2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(orf)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码fp2a连接体的多核苷酸与seqidno15可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，连接体可以是工程化的。例如，连接体可以被设计成包含化学特性如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。序列与seqidno147、161或162的多肽序列可以或可以大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在其它情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因和一个或多个本文所述的基因开关多肽序列可以被至少两个连接体隔开，如图15和图16所示。在一些情况下，基因可以被2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个连接体隔开。连接体可以是工程化的连接体。设计连接体的方法可以是计算的。在一些情况下，计算方法可以包括图形技术。可以使用计算方法从源自数据库的三维肽结构文库中搜索合适的肽。例如，可以使用brookhavenproteindatabank(pdb)跨越连接体的选定氨基酸之间的空间距离。在一些实施方案中是编码包含弗林蛋白酶多肽和2a多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2a多肽通过包含至少三个疏水性氨基酸的多肽连接体连接。在一些情况下，至少三个疏水性氨基酸选自由甘氨酸(gly)(g)、丙氨酸(ala)(a)、缬氨酸(val)(v)、亮氨酸(leu)(l)、异亮氨酸(ile)(i)、脯氨酸(pro)(p)、苯丙氨酸(phe)(f)、甲硫氨酸(met)(m)、色氨酸(trp)(w)组成的列表。在一些情况下，多肽连接体还可以包含一个或多个gs连接体序列，例如(gs)n、(sg)n、(gsg)n(seqidno：78)和(sgsg)n(seqidno：79)，其中n可以是零到十五的任何数字。提供了获得多肽构建体的改进表达的方法，该方法包括：提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过连接体多肽连接，该连接体多肽包含与序列apvkq(seqidno162)具有至少60％同一性的序列；以及在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列apvkq具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，所述表达导致多肽构建体的改进表达。启动子“启动子”是指启动编码序列转录的多核苷酸区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于dna的同一链和上游(朝向有义链的5’区)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中在所有情况下都具有活性，而其它启动子响应于特定刺激被调节变得具有活性(例如，诱导型启动子)。另外其它的启动子是组织特异性或活化的启动子，包括但不限于t细胞特异性启动子。术语“启动子活性”及其语法等同语是指与正被测量活性的启动子可操作地连接的核苷酸序列的表达程度。启动子活性可以通过确定产生的rna转录物的量直接测定(例如通过northern印迹分析)，或通过确定由所连接的核酸序列(如与启动子连接的报告核酸序列)编码的产物的量间接测定。如本文所用的“诱导型启动子”是指通过转录调节物(例如，生物或非生物因素)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与它们可操作连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或在特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的实例是醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机理调节的启动子、温度调节的启动子和光调节的启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子是遗传开关的部分。诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮素受体的基因开关，如基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：pct/us2001/009050(wo200i/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；pct/us2001/030608(wo2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；pct/1j52002/005235(wo2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；pct/us2002/005706(wo2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；pct/u52002/005090(wo2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；pct/us2002/005234(wo2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；pct/u52002/005708(wo2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；pct/us2002/005026(wo2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；pct/us2005/015089(wo2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；pct/u52008/011270(wo2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；pct/us2008/011563(wo2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；pct/us2009/005510(wo2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；pct/us2011/029682(wo2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；pct/us2012/027515(wo2012/122025)；和美国专利9,402,919，以上每一个均通过引用整体并入。本文提供了方法，其包括向受试者施用至少一种包含编码本文所述多肽序列的多核苷酸的非病毒载体，该多肽包含至少两个功能性蛋白质或其部分；至少一个启动子；和至少一个工程化重组位点；其中所述至少一个启动子驱动所述至少两个功能性蛋白质的表达。在一些情况下，至少一个启动子可以是组成型的。在一些情况下，至少一个启动子可以是组织特异性的。在一些情况下，至少一个启动子可以是诱导型的。在一些情况下，诱导型启动子是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮素受体的基因开关。在其它情况下，可以使用启动子的组合，其中至少一个启动子可以是诱导型启动子，而至少一个启动子可以是活化特异性的。诱导型启动子利用配体对所述至少两种基因的表达进行剂量调节的控制。在一些情况下，配体可以选自蜕皮类固醇、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、n，n’-二酰基肼、噁二唑啉、二苯甲酰基烷基氰基肼、n-烷基-n，n’-二芳酰基肼、n-酰基-n-烷基羰基肼、n-芳酰基-n-烷基-n’-芳酰基肼、氨基酮(arnidoketones)、3，5-二-叔丁基-4-羟基-n-异丁基-苯甲酰胺、8-o-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(r)羟基胆甾醇、24(s)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、t0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(echs)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素iii、rg-115819(3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、rg-115932((r)-3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和rg-115830(3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)及其任何组合。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是非诱导型启动子。在某些情况下，启动子可以是组织特异性启动子。本文中，“组织特异性”是指基因在组织或细胞类型的子集中的受调节的表达。在一些情况下，可以在空间上调节组织特异性启动子，使得该启动子仅在生物体的某些组织或细胞类型中驱动表达。在其它情况下，可以在时间上调节组织特异性启动子，使得该启动子在时间上不同地驱动细胞类型或组织中的表达，包括在生物体的发育期间。在一些情况下，组织特异性启动子在空间和时间上都受到调节。在某些实施方案中，组织特异性启动子在细胞类型的特定时间或阶段组成型地或间歇性地在某些细胞类型中被激活。例如，组织特异性启动子可以是当特定细胞如t细胞或nk细胞被活化时被激活的启动子。t细胞可以多种方式被活化，例如，当通过mhcii类分子呈递肽抗原时或当包含抗原结合多肽的工程化t细胞与抗原接合时。在一种情况下，这样的工程化t细胞或nk细胞表达嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在一种情况下，至少一种启动子是工程化启动子或其变体。如本文所述，启动子可以并入来自il-2和以下一种或多种的最小启动子序列：活化t细胞核因子(nfat)应答元件，如seqidno51；nfil2d应答元件、nfkb/tcf应答元件、nf_at/nfil2b应答元件或nfil2a/oct应答元件。应答元件的实例描述于mattila等人，emboj.1990december；9(13)：4425-4433；其整体并入本文。在一些实施方案中，至少一种启动子包含il-2核心启动子(seqidno40)。在一个实施方案中，至少一种启动子包含il-2最小启动子(seqidno41)。在另一个实施方案中，至少一种启动子包含il-2增强子和启动子变体(seqidno42-43)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含nf-κb结合位点(seqidno44-46)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(nf-κb)1-il2启动子变体(seqidno47)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(nf-κb)3-il2启动子变体(seqidno48)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(nf-κb)6-il2启动子变体(seqidno49)。在一个实施方案中，至少一种启动子包含1xnfat应答元件-il2启动子变体(seqidno50)。在另一个实施方案中，至少一种启动子包含活化t细胞核因子(nfat)应答元件(seqidno51)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含6xnfat应答元件-il2启动子变体(seqidno52-55)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含3xnfat应答元件-il2启动子变体(seqidno56-57)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人ef1a1启动子变体(seqidno58-59)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人ef1a1启动子和增强子(seqidno60)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人ubc启动子(seqidno61)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含6位点gal4诱导型近端因子结合元件(pfb)(seqidno62)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含合成的最小启动子1(诱导型启动子)(seqidno63)。人il-2基因和5′侧翼区包含seqidno95的核苷酸序列。使用基因开关进行本文所述的il-12表达的配体诱导型控制可以通过例如允许调节的表达和改善治疗指数来改善il-12的安全性谱。然而，使用基因开关的il-12的配体剂量依赖性表达的条件是存在或不存在激活物配体(例如veledimex)。在某些实施方案中，考虑了用于诱导il-12表达的另外的条件性控制。提供了在t细胞活化的特异性启动子控制下的基因开关组件。这导致在基因开关控制下veledimex控制的转基因表达所必需的基因开关组分的条件性表达(例如，t细胞活化)。在一些实施方案中，当存在veledimex并且t细胞被活化时，这导致肿瘤特异性t细胞优先表达细胞因子如il-12或il-15。这可以导致基因开关控制的转基因表达的局部水平增加。例如，基因开关组分的t细胞活化特异性表达可以由包含活化t细胞核因子(nfat)应答元件的启动子来控制。nfat转录因子是效应t细胞状态的关键调节物。nfat是逐渐驱动消耗的早期转录检查点。在tcr刺激后，nfat在t细胞中快速活化，并与适当的共刺激信号传导诱导的ap-1形成蛋白质复合物，并调节效应基因和t细胞功能。nfat应答元件可以与其它最小启动子序列(例如，il2最小启动子)融合以响应于t细胞活化来驱动转基因的表达。活化特异性启动子的其它实例包括但不限于白介素-2(il2)启动子和程序性死亡(pd)-1(cd279)启动子。基因开关组分也可以通过将促炎信号传导途径的其它核因子如nf-κb的结合位点与最小启动子序列(例如，il2)融合而在免疫细胞活化时条件性地表达。在一些实施方案中，启动子包含nf-κb结合位点(seqidno44-46)、活化t细胞核因子(nfat)应答元件(seqidno51)、6位点gal4-诱导型近端因子结合元件(pfb)(seqidno62)或基于rpl6的合成5’utr(seqidno64)。在某些实施方案中，启动子可以是以下任何一种或多种：il-2核心启动子、il-2最小启动子、il-2增强子和启动子变体、(nf-κb)1-il2启动子变体、(nf-κb)3-il2启动子变体、(nf-κb)6-il2启动子变体、1xnfat应答元件-il2启动子变体、3xnfat应答元件-il2启动子变体、6xnfat应答元件-il2启动子变体、人eef1a1启动子变体、人eef1a1启动子和增强子、人ubc启动子和合成的最小启动子1。在某些实施方案中，启动子核苷酸包括下表中公开的那些：表2.启动子多核苷酸序列基因开关本文提供了基因开关多肽，编码配体诱导型基因开关多肽的多核苷酸，以及并入这些多肽和/或多核苷酸的方法和系统。术语“基因开关”或“基因的开关”是指与启动子关联的应答元件的组合，例如，基于ecr的系统，其在一种或多种配体的存在下，调节并入了应答元件和启动子的基因的表达。紧密调节的诱导型基因表达系统或基因开关可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。这类诱导型基因表达系统可包括配体诱导型异源基因表达系统。早期形式的基于ecr的基因开关使用黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)ecr(dmecr)和小鼠(musmusculus)rxr(mmrxr)多肽，并且显示这些受体在类固醇、百日青蜕皮酮a的存在下在哺乳动物细胞系和转基因小鼠中反式激活报告基因(christopherson等人，1992；no等人，1996)。后来，suhr等人，1998表明非甾类蜕皮素激动剂虫酰肼在不存在外源异二聚体配偶体的情况下通过家蚕(bombyxmori)ecr(bmecr)在哺乳动物细胞中诱导报告基因的高水平反式激活。国际专利申请pct/us97/05330(wo97/38117)和pct/us99/08381(wo99/58155)公开了调节外源基因表达的方法，其中包含外源基因和蜕皮素应答元件的dna构建体被包含蜕皮素受体的第二dna构建体激活，该蜕皮素受体在其配体的存在下，任选地在能够充当沉默配偶体的受体的存在下，与蜕皮素应答元件结合以诱导基因表达。在该实例中，蜕皮素受体是从黑腹果蝇中分离的。通常，此类系统需要存在沉默配偶体，优选类视黄醇x受体(rxr)，以提供最佳激活。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体(ecr)能够与哺乳动物类视黄醇x受体(rxr)异二聚化，从而用于以配体依赖性方式调节靶基因或异源基因的表达。国际专利申请pct/us98/14215(wo99/02683)披露，从蚕蛾家蚕中分离的蜕皮素受体在哺乳动物系统中是功能性的，不需要外源二聚体配偶体。在一些实施方案中，rxr包含与seqidno69至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与seqidno182至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。在一些实施方案中，基因开关包含vp16-连接体-rxr，其中vp16-连接体-rxr包含与至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸，或与seqidno183至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。美国专利6,265,173披露，类固醇/甲状腺超家族受体的各个成员可以与黑腹果蝇超螺旋受体(usp)或其至少包含usp二聚化结构域的片段相组合，以用于基因表达系统。美国专利5,880,333公开了在植物中使用的黑腹果蝇ecr和超螺旋(usp)异二聚体系统，其中反式激活域和dna结合域位于两个不同的杂合蛋白上。在这些情况中的每一种中，反式激活域和dna结合域(如国际专利申请pct/us98/14215中的天然ecr或国际专利申请pct/us97/05330中的修饰的ecr)并入单个分子中，并且其它异二聚体配偶体(usp或rxr)以其天然状态使用。在一些实施方案中，基因开关包含ecr配体结合域-vy变体，其中ecr配体结合域-vy变体包含与seqidno72或73至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与seqidno185或186至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。在其它实施方案中，基因开关包含gal4-连接体-ecr，其中gal4-连接体-ecr包含与seqidno74或75至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与seqidno187或188至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。国际专利申请pct/us01/0905公开了基于蜕皮素受体的诱导型基因表达系统，其中反式激活域和dna结合域通过将它们置于两个不同的蛋白质上而彼此分离，导致在不存在配体的情况下背景活性大大降低，而在配体的存在下，活性比背景显著增加。与申请pct/us97/05330和pct/us98/14215中公开的两种系统相比，这种双杂交系统是显著改进的诱导型基因表达调节系统。据认为，这种双杂交系统利用了一对相互作用蛋白质的以下能力：它们使转录激活域相对于dna结合域处于更有利的位置，使得当dna结合域与基因上的dna结合位点结合时，反式激活域更有效地激活启动子(参见，例如，美国专利5,283,173)。这种双杂交基因表达系统包含两个基因表达盒；第一个编码与核受体多肽融合的dna结合域，第二个编码与不同的核受体多肽融合的反式激活域。在配体的存在下，认为诱导了构象变化，这促进第一多肽与第二多肽的相互作用，从而导致dna结合域与反式激活域的二聚化。由于dna结合域和反式激活域位于两个不同的分子上，因此在不存在配体的情况下，背景活性大大降低。另一个令人惊讶的发现是，与甾类配体(例如，百日青蜕皮酮a(“pona”)或幕黎甾酮a(“mura”)相比，所述双杂交系统的某些修饰还可以提供对非甾类配体(例如，二酰基肼)的改善的敏感性。也就是说，与类固醇相比，非甾类配体在较低的配体浓度下提供较高的基因转录活性。此外，所述双杂交系统避免了由于当未修饰的rxr用作开关配偶体时可能发生的rxr过表达而导致的一些副作用。在优选的双杂交系统中，消除了ecr或rxr的天然dna结合域和反式激活域，因此，这些杂合分子与细胞中存在的其它类固醇激素受体相互作用的机会较少，从而导致副作用降低。蜕皮素受体(ecr)是核受体超家族的成员，并且被分类为亚家族1，h组(在本文中称为“h组核受体”)。每组的成员在e(配体结合)结构域中具有40-60％的氨基酸同一性(laudet等人，aunifiednomenclaturesystemforthenuclearreceptorsubfamily，1999；cell97：161-163)。除蜕皮素受体外，该核受体亚家族1，h组的其它成员还包括：遍在受体(ur)、孤儿受体1(or-1)、类固醇激素核受体1(ner-1)、rxr相互作用蛋白-15(rip-15)、肝x受体β(lxrβ)、类固醇激素受体样蛋白(rld-1)、肝x受体(lxr)、肝x受体α(lxrα)、类法尼醇x受体(fxr)、受体相互作用蛋白质14(rip-14)和法尼醇受体(hrr-1)。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如intrexoncorporation的基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：pct/us2001/009050(wo2001/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；pct/us2001/030608(wo2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；pct/1j52002/005235(wo2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；pct/us2002/005706(wo2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；pct/u52002/005090(wo2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；pct/us2002/005234(wo2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；pct/u52002/005708(wo2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；pct/us2002/005026(wo2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；pct/us2005/015089(wo2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；pct/u52008/011270(wo2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；pct/us2008/011563(wo2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；pct/us2009/005510(wo2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；pct/us2011/029682(wo2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；pct/us2012/027515(wo2012/122025)；和美国专利9,402,919，以上每一个均通过引用整体并入。提供了用于调节宿主细胞中的异源基因和白介素表达的系统，其包含表达本文公开的基因开关多肽的多核苷酸。在组成型或诱导型启动子控制下的非限制性示例性配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分示于图22中。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-64并且具有如seqidno：131所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-30并且具有如seqidno：132所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-59并且具有如seqidno：133所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-60并且具有如seqidno：134所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-61并且具有如seqidno：135所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是xon-62并且具有如seqidno：136所示的序列。在一些实施方案中是用于调节宿主细胞中的异源基因和细胞因子表达的系统，其包含第一基因表达盒，该第一基因表达盒包含编码第一多肽的第一多核苷酸；第二基因表达盒，该第二基因表达盒包含编码第二多肽的第二多核苷酸；和配体；其中所述第一和第二多肽包含以下一种或多种：(i)反式激活域；(ii)dna结合域；(iii)配体结合域；(iv)所述异源基因；和(vi)所述细胞因子，使得在所述配体的存在下使所述宿主细胞与所述第一基因表达盒和所述第二基因表达盒接触后，所述异源基因和所述细胞因子在所述宿主细胞中表达。在一些情况下，所述异源基因包含本文所述的抗原结合多肽。在一些情况下，该抗原结合多肽可以是本文所述的car，例如，结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种的car。细胞因子本文提供了编码基因开关多肽和细胞因子或其变体或衍生物的多核苷酸，以及并入该多核苷酸的方法和系统。细胞因子是一类约5-20kda的参与细胞信号传导的小蛋白质。在一些情况下，细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，趋化因子起到用于引导细胞迁移的化学引诱物的作用，并且被分类为四个亚家族：cxc、cc、cx3c和xc。示例性趋化因子包括来自cc亚家族的趋化因子：ccl1、ccl2(mcp-1)、ccl3、ccl4、ccl5(rantes)、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9(或ccl10)、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27和ccl28；来自cxc亚家族的趋化因子：cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16和cxcl17；来自xc亚家族的趋化因子：xcl1和xcl2；以及来自cx3c亚家族的趋化因子：cx3cl1。干扰素(ifn)包括i型干扰素(例如ifn-α、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ和ifn-ω)、ii型干扰素(例如ifn-γ)和iii型干扰素。在一些实施方案中，ifn-α进一步分类为约13种亚型，包括ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17和ifna21。白介素由白血球或白细胞表达，并且它们促进t和b淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。示例性白介素包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8(cxcl8)、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-35和il-36。在一些实施方案中，白介素包括mbil-15。在一些实施方案中，mbil-15是膜结合的嵌合il-15，其可以与本文所述的经修饰的效应细胞共表达。在一些实施方案中，mbil-15包含与全长il-15rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长il-15(例如，天然il-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，il-15通过连接体与il-15rα间接连接。在一些情况下，mbil-15如hurton等人，“tetheredil-15augmentsantitumoractivityandpromotesastem-cellmemorysubsetintumor-specifictcells，”pnas2016所述。肿瘤坏死因子(tnf)是一组调节凋亡的细胞因子。在一些情况下，tnf家族中约有19个成员，包括但不限于tnfα、淋巴毒素-α(lt-α)、淋巴毒素-β(lt-β)、t细胞抗原gp39(cd40l)、cd27l、cd30l、fasl、4-1bbl、ox40l和tnf相关凋亡诱导配体(trail)。集落刺激因子(csf)是分泌的糖蛋白，其与造血干细胞表面上的受体蛋白相互作用，这随后调节细胞增殖和向特定种类血细胞的分化。在一些情况下，csf包括巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)或促巨核细胞生成素(promegapoietin)。在一些实施方案中，细胞因子是膜结合细胞因子，其与本文所述的嵌合抗原受体共表达。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子的细胞因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnγ或tnf-α的细胞因子。在一些情况下，细胞因子包含至少一种趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子或其变体或组合。在一些情况下，细胞因子是白介素。在一些情况下，白介素是il-12、il-2、il-15、il-21及其功能变体和片段中的至少一种。在一些实施方案中，细胞因子是il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，细胞因子是il-15的变体(seqidno90；seqidno203)。在一个实施方案中，细胞因子包含il-15受体α(seqidno91；seqidno204)。在一些实施方案中，细胞因子可以是膜结合的或分泌的。在其它实施方案中，细胞因子可以是细胞内的。白介素可包含膜结合的il-15(mbil-15)、il-15与il-15rα(seqidno91；seqidno204)或il-15变体(seqidno90；seqidno203)的融合体。在一些实施方案中，mbil-15是膜结合的嵌合il-15，其可以与本文所述的经修饰的效应细胞共表达。在一些实施方案中，mbil-15包含与全长il-15rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长il-15(例如，天然il-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，il-15通过连接体间接连接至il-15rα。在一些实施方案中，mbil-15包含信号肽(seqidno92；seqidno205)。在一些情况下，mbil-15如hurton等人，“tetheredil-15augmentsantitumoractivityandpromotesastem-cellmemorysubsetintumor-specifictcells，”pnas2016所述。在另一方面，白介素可包含il-12。在一些实施方案中，il-12可以是单链il-12(scil-12)、蛋白酶敏感的il-12\、去稳定的il-12、膜结合的il-12或插入的il-12。在一些实施方案中，il-12是鼠il-12亚单位β(p40)(seqidno206)。在一些实施方案中，il-12是鼠il-12亚单位α(p35)(seqidno207)。在一些实施方案中，il-12是鼠单链il-12(p40-连接体-p35)(seqidno93；seqidno208)。在一些实施方案中，il-12是人单链il-12(p40-连接体-p35)(seqidno94；seqidno209)。在某些实施方案中，il-12是单链il-12。在一些情况下，il-12变体如wo2015/095249、wo2016/048903和wo2017/062953所述，所有这些文献都通过引用整体并入。本文提供了编码基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含：a)第一基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的dna结合域，和b)第二基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，该连接体可以是本文所述的连接体，例如gsg连接体，furinlink，2a连接体，如f/t2a、t2a、p2a、gsg-p2a，其变体和衍生物。在其它情况下，该连接体可以是ires。在一些实施方案中，该ires是emcvires或2xrbm3ires。示例性ires序列可见于seqidno：18和19。在某些情况下，编码2xrbm3iresa的多核苷酸可以与seqidno：19至少或至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些情况下，编码emcviresa的多核苷酸可以与seqidno：18至少或至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，dna结合域(dbd)包含本文所述的dbd，例如gal4(gal4dbd)(seqidno71；seqidno184)、lexadbd、转录因子dbd、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员dbd、细菌laczdbd和酵母dbd中的至少一种。反式激活域可包含本文所述的反式激活域，例如vp16反式激活域(seqidno68；seqidno181)、p53反式激活域和b42酸性激活物反式激活域之一。核受体配体结合域可包含蜕皮素受体(ecr)、遍在受体、孤儿受体1、ner-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇x受体相互作用蛋白-15、肝x受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝x受体、肝x受体α、类法尼醇x受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在一些情况下，与基因开关多肽通过非编码序列如ires连接的配体诱导型基因开关相比，通过多肽连接体或核糖体跳跃序列连接的基因开关多肽表现出改善的对基因表达的剂量依赖性配体诱导型控制。在一些情况下，与所述基因开关多肽被ires隔开的基因开关相比，通过2a连接体连接的基因开关多肽可以表现出改善的对异源基因表达的剂量依赖性配体诱导型控制。如本文所述的多肽和多核苷酸可以在工程化细胞中表达。本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)以编码例如基因开关多肽、目的基因(goi)、细胞标签、异源基因和本文描述的其它任何多肽和多核苷酸。配体在一些实施方案中，用于诱导型基因开关调节的配体可以选自但不限于以下任一种：n-[(1r)-1-(1，1-二甲基乙基)丁基]-n′-(2-乙基-3-甲氧基苯甲酰基)-3，5-二甲基苯并酰肼(也称为veledimex)、(2s，3r，5r，9r，10r，13r，14s，17r)-17-[(2s，3r)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1h-环戊并[a]菲-6-酮；n′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-n′-[(3r)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-n′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸n′-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-n′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-戊基)-n′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。在一些情况下，用于基于蜕皮素受体的诱导型基因开关调节的剂量调节的控制的配体可以选自但不限于以下任一种：蜕皮类固醇(如蜕皮素、20-羟基蜕皮酮、百日青蜕皮酮a、幕黎甾酮a等)、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、n，n’-二酰基肼，如美国专利6,013,836、5,117,057、5,530,028和5,378,726以及美国公开申请2005/0209283和2006/0020146所公开的那些；噁二唑啉，如美国公开申请2004/0171651中所述；二苯甲酰基烷基氰基肼，如在欧洲申请461，809中所公开的那些；n-烷基-n，n’-二芳酰基肼，如在美国专利5,225,443中所公开的那些；n-酰基-n-烷基羰基肼，如在欧洲申请234，994中所公开的那些；n-芳酰基-n-烷基-n’-芳酰基肼，如美国专利4,985,461中所述的那些；氨基酮，如美国公开申请2004/0049037中所述的那些；以上每一个均通过引用并入本文，以及其它类似材料，包括3，5-二叔丁基-4-羟基-n-异丁基-苯甲酰胺、8-o-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(r)羟基胆甾醇、24(s)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、t0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(echs)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素iii等。可用于本公开的二酰基肼配体的实例包括rg-115819(3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-n’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、rg-115932((r)-3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和rg-115830(3，5-二甲基-苯甲酸n-(1-叔丁基-丁基)-n’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见例如序列号为12/155,111的美国专利申请和pct申请pct/us2008/006757，以上两者均通过引用整体并入本文。抗原结合多肽本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环已烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、s-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环已基丙氨酸、环已基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、n’-苄基-n’-甲基-赖氨酸、n’，n’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环已烷羧酸α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。如本文所用的“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指由b细胞的单个克隆产生并结合相同表位的抗体。相反，“多克隆抗体”是指由不同b细胞产生并结合相同抗原的不同表位的抗体群体。完整抗体通常由四个多肽组成：重(h)链多肽的两个相同拷贝和轻(l)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个n端可变(vh)区和三个c端恒定(ch1、ch2和ch3)区，并且每条轻链含有一个n端可变(vl)区和一个c端恒定(cl)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。vh区和vl区具有相似的一般结构，每个区包含四个序列相对保守的框架区。框架区通过三个互补决定区(cdr)连接。被称为cdr1、cdr2和cdr3的三个cdr形成抗体的“高变区”，其负责抗原结合。“抗原识别部分”或“抗体识别结构域”是指特异性结合抗原的分子或分子部分。在一个实施方案中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，并且抗原是肿瘤抗原或传染病抗原。“抗体样分子”可以是例如作为ig超家族成员的蛋白质，其能够选择性地结合配偶体。mhc分子和t细胞受体是这样的分子。在一个实施方案中，抗体样分子是tcr。在一个实施方案中，tcr已被修饰以增加其mhc结合亲和力。术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”、“抗原结合部分”或其语法等同语在本文中可互换使用，是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(大体上参见holliger等人，nat.biotech.，23(9)：1126-1129(2005))。例如，抗体片段理想地包含一个或多个cdr、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于(i)fab片段，其为由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，其为包含两个fab片段的二价片段，该fab片段通过茎区处的二硫键连接；(iii)fv片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成；(iv)单链fv(scfv)，其为由fv片段的通过合成连接体连接的两个结构域(即vl和vh)组成的单价分子，该合成连接体使得两个结构域能够作为单个多肽链合成(参见例如，bird等人，science，242：423-426(1988)；huston等人，proc.natl.acad.sci.usa，85：5879-5883(1988)；以及osbourn等人，nat.biotechnol.，16：778(1998))，以及(v)双抗体，其为多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽连接体与vl连接的vh，该肽连接体太短而不允许同一肽链上的vh与vl之间进行配对，从而驱动不同vh-vl多肽链上的互补结构域之间进行配对以生成具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的，并且在例如美国专利8,603,950中有更详细的描述。其它抗体片段可包括重链抗体的可变片段(vhh)。当与car结合使用时，术语“功能部分”是指本公开内容的car的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为一部分的car(亲本car)的生物活性。关于编码亲本car的核酸序列，编码car的功能部分的核酸序列可编码构成亲本car的例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的蛋白质。如本文所用的，术语“功能变体”是指这样的多肽或蛋白质，其与参考多肽具有较高或显著的序列同一性或相似性，并且保留其作为变体的参照多肽的生物活性。在一些实施方案中，功能变体例如包含参考蛋白质的氨基酸序列，其具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个保守氨基酸置换。功能变体包括，例如，本文所述car(亲本car)的那些变体，其保留与亲本car相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力。关于编码亲本car的核酸序列，编码car的功能变体的核酸序列可以与编码亲本car的核酸序列例如约10％相同、约25％相同、约30％相同、约50％相同、约65％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同或约99％相同。术语“保守氨基酸置换”或“保守突变”是指将一个氨基酸置换为另一种具有共同性质的氨基酸。定义各个氨基酸之间的共同性质的功能性方法是分析同源生物体的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(schulz，g.e.andschirmer，r.h.，principlesofproteinstructure，springer-verlag，newyork(1979))。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸彼此优先交换，因此它们在对总体蛋白质结构的影响上最相似(schulz，g.e.andschirmer，r.h.，同上)。保守突变的实例包括上述亚组内的氨基酸的氨基酸置换，例如赖氨酸置换精氨酸，反之亦然，使得可以保持正电荷；谷氨酸置换天冬氨酸，反之亦然，使得可以保持负电荷；丝氨酸置换苏氨酸，使得可以保持游离的-oh；谷氨酰胺置换天冬酰胺，使得可以保持游离-nh2。备选地或另外，功能变体可包含参考蛋白质的氨基酸序列，其具有至少一个非保守氨基酸置换。术语“非保守突变”涉及不同组之间的氨基酸置换，例如，赖氨酸置换色氨酸，或苯丙氨酸置换丝氨酸等。在这种情况下，优选非保守氨基酸置换不干扰或抑制功能变体的生物学活性。非保守氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本car相比，功能变体的生物活性增加。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对于cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2是特异性的或与之结合。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scfv)，该片段包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗体的可变域轻链(vl)和可变域重链(vh)。在实施方案中，scfv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的vh和vl，例如，从n到c末端、vh-连接体-vl或vl-连接体-vh。在一些情况下，抗原结合域识别靶标的表位。在一些实施方案中，本文描述的包括car或car-t细胞，其中抗原结合域包含f(ab’)2、fab’、fab、fv或scfv。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd19是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd33是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对bcma是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd44是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对α-叶酸受体是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对caix是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd30是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对ror1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cea是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对egp-2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对egp-40是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对her2是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对her3是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对叶酸结合蛋白是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对gd2是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对gd3是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对il-13r-a2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对kdr是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对edb-f是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对间皮素是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd22是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对egfr是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对muc-1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对muc-16是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对mage-a1是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对h5t4是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对psma是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对tag-72是特异性的。在又一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对egfrviii是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd123是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对vegf-r2是特异性的。嵌合抗原受体(car)在一些实施方案中，本文描述的包括编码在细胞表面上表达的嵌合受体的多核苷酸。在一些情况下，嵌合受体包含能够识别和结合肿瘤抗原(例如肿瘤抗原，如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的抗原结合区。在一些情况下，抗原结合区包含抗体或结合片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、f(ab’)3、scfv、sc(fv)2、dsfv、双抗体、微抗体和纳米抗体或其结合片段。在一些情况下，抗原结合区包含scfv。在一些情况下，嵌合受体包含scfv(例如，嵌合抗原受体(car))。在一些情况下，嵌合抗原受体包含模式识别受体。在其它情况下，嵌合受体包含工程化t细胞受体(tcr)。如本文所用的术语“嵌合抗原受体(car)”、“人工t细胞受体”、“嵌合t细胞受体”或“嵌合免疫受体”是指将外源特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。在一些情况下，car包含细胞外结构域(胞外域)和细胞内结构域(胞内域)，该细胞外结构域包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域。在一些情况下，细胞内结构域进一步包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，本文所述的car包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和用于t细胞活化的信号传导结构域。在实施方案中，本公开的car包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。在实施方案中，通过工程化与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的所需抗原结合部分，将本公开的car工程化成靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定过度增殖性病症如癌症所共有的抗原。抗原结合域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。互补决定区(cdr)是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白的可变域中发现的短氨基酸序列，该短氨基酸序列与抗原互补并因此为受体提供针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链可含有三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。在一些情况下，抗原结合域包含f(ab’)2、fab’、fab、fv或scfv。在一些情况下，抗原结合域是scfv。在一些情况下，抗原结合域是fab。在一些情况下，抗原结合域是fab’。在一些情况下，抗原结合域是f(ab’)2。在一些情况下，抗原结合域是fv。在一些实施方案中，本文描述的car包含与cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的car包含与cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、muc-16、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的car包含与cd19、cd33或egfrviii上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的car包含与cd19上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的car包含与cd33上的表位结合的抗原结合域。在进一步的实施方案中，本文描述的car或嵌合受体或抗原结合多肽包含自身抗原或与hla-a2、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)、因子viii(fviii)、madcam1、sdf1或ii型胶原蛋白上的表位结合的抗原结合区。在另一个实施方案中，本文描述的car是egfrviii特异性car。“egfrviii”、“egfr变体iii”、“egfriii型突变体”、“egfr.d2-7”或“de2-7egfr”是表皮生长因子受体(egfr；erbb-1；her1)的突变形式，表皮生长因子受体是人和非人受试者中的细胞外蛋白质配体的表皮生长因子(egf)家族成员的受体。egfrviii的特征在于野生型egfr基因的外显子2-7缺失，这导致全长野生型egfr蛋白的细胞外结构域中267个氨基酸的框内缺失。egfrviii还含有插入融合连接处的新型甘氨酸残基。截短的受体egfrviii不能结合任何已知的egfr配体；然而，它显示出组成型酪氨酸激酶活性。这种组成型激活对其促致癌作用至关重要。激酶缺陷型egfrviii不能赋予类似的致癌优势。egfrviii在胶质母细胞瘤(gbm)中高度表达，并且可以在一些其它实体瘤类型中检测到，但在正常组织中检测不到。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对egfrviii(egfrviiicar)是特异性的。当在细胞表面上表达时，egfrviii特异性car将t细胞的特异性重定向至人egfrviii。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scfv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗egfrviii抗体的可变域轻链(vl)和可变域重链(vh)。在实施方案中，scfv是鼠mr1igg。在一些实施方案中，scfv是抗egfrviiiscfv克隆mr1(seqidno115；seqidno229)、抗egfrviiiscfv克隆mr1-1(seqidno116；seqidno230)、抗egfrviiiscfv克隆humr1-1(seqidno117；seqidno231)、抗egfrviiiscfv克隆humr1-2(seqidno118；seqidno232)。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的vh和vl，例如，从n末端到c末端、vh-连接体-vl或vl-连接体-vh。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno221的氨基酸序列(抗egfrviii克隆mr1vl)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vl多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno220的氨基酸序列(抗egfrviii克隆mr1vh)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vh多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno223的氨基酸序列(抗egfrviii克隆mr1-1vl)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vl多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno222的氨基酸序列(抗egfrviii克隆mr1-1vh)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vh多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno225的氨基酸序列(抗egfrviii克隆hummr1-1vl)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vl多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno224的氨基酸序列(抗egfrviii克隆hummr1-1vh)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vh多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno227的氨基酸序列(抗egfrviii克隆hummr1-2vl)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vl多肽。在实施方案中，本文描述的car包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与seqidno226的氨基酸序列(抗egfrviii克隆hummr1-2vh)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vh多肽。在一个实施方案中，本文描述的car是cd19特异性car。“cd19”、分化簇19或b-淋巴细胞抗原cd19是人体中由cd19基因编码的蛋白质。cd19基因编码与b淋巴细胞的抗原受体装配的细胞表面分子，以降低抗原受体依赖性刺激的阈值。cd19在滤泡树突细胞和b细胞上表达。事实上，它存在于在向b细胞母细胞发育过程中来自最早可识别的b谱系细胞的b细胞中，但在成熟为浆细胞时丢失。它主要作为b细胞共受体与cd21和cd81一起发挥作用。一旦激活，cd19的细胞质尾部变为磷酸化的，这导致src-家族激酶的结合和pi-3激酶的募集。与在t细胞上一样，几种表面分子形成抗原受体并在b淋巴细胞上形成复合物。(几乎)b细胞特异性cd19磷酸糖蛋白是这些分子中的一种。其它的是cd21和cd81。这些表面免疫球蛋白(slg)相关分子促进信号转导。在b细胞上，模拟外源抗原的抗免疫球蛋白抗体导致cd19与slg结合并与其内化。反向过程尚未得到证实，提示该受体复合物的形成是抗原诱导的。这种分子关联已经通过化学研究得到证实。在另一个实施方案中，本文描述的car是cd33特异性car。“cd33”、siglec-3、唾液酸结合ig样凝集素3、siglec3、siglec-3、gp67或p67是67kda单次跨膜糖蛋白，并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglecs)超家族的成员。cd33的特征在于负责唾液酸结合的v-组ig样结构域和其细胞外域中的c2-组ig样结构域。cd33mrna的可变剪接导致缺乏v-组ig样结构域以及连接v-组和c2-组ig样结构域的二硫键的较短同种型(cd33m)。在健康受试者中，cd33主要表达为在正常多能骨髓前体、单能集落形成细胞、单核细胞和成熟粒细胞上发现的髓样分化抗原。cd33在超过80％的髓样白血病细胞上表达，但在正常的造血干细胞或成熟粒细胞上不表达(andrews，r.等人，thel4f3antigenisexpressedbyunipotentandmultipotentcolony-formingcellsbutnotbytheirprecursors，blood，68(5)：1030-5(1986))。已报道cd33在恶性骨髓细胞、活化t细胞和活化nk细胞上表达，并且在绝大多数aml患者的至少一部分母细胞上发现(pollard，j.等人，correlationofcd33expressionlevelwithdiseasecharacteristicsandresponsetogemtuzumabozogamicincontainingchemotherapyinchildhoodaml，blood，119(16)：3705-11(2012))。除了在aml母细胞上的广泛表达之外，cd33还可以在导致aml的干细胞上表达。在实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd33是特异性的(cd33car)。当cd33特异性car在细胞表面上表达时，其将t细胞的特异性重定向至人cd33。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scfv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗cd33抗体的可变域轻链(vl)和可变域重链(vh)。在实施方案中，scfv是m195、m2h12、drb2和/或my9-6。在实施方案中，scfv是人源化的，例如hm195。在一些实施方案中，该抗原结合部分可包含定向连接的vh和vl，例如，从n到c末端、vh-连接体-vl或vl-连接体-vh。在一些实施方案中，cd33抗原结合域包含与seqidno214(hm195vl)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，cd33抗原结合域包含与seqidno215(hm195vh)的的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，cd33抗原结合域包含与seqidno216(具有连接体的hm195scfv)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸、多肽和方法可用于治疗过度增殖性疾病如癌症、自身免疫性疾病，或用于治疗感染，如病毒、细菌或寄生虫感染。在一些方面，抗原是在癌细胞、自身免疫细胞或被病毒、细菌或寄生虫感染的细胞中升高的抗原。可以被靶向的病原体包括但不限于疟原虫、锥虫、曲霉属(aspergillus)、假丝酵母属(candida)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、hsv、hpv、rsv、ebv、cmv、jc病毒、bk病毒或埃博拉病原体。自身免疫性疾病可包括移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、克罗恩病、合格伦综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、视神经脊髓炎、强直性脊柱炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞动脉炎、大疱性类天疱疮、银屑病、寻常型天疱疮或自身免疫性葡萄膜炎。被car识别的病原体可以基本上是任何种类的病原体，但在一些实施方案中，病原体是真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、jc病毒、bk病毒、hpv病毒科、hsv病毒科、hhv病毒科、肝炎病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属(cryptococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)、肺囊虫属(pneumocystis)和葡萄穗霉属(stachybotrys)。示例性的致病细菌包括链球菌属(streptococcus)、假单胞菌属(pseudomonas)、志贺菌属(shigella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、葡萄球菌属(staphylococcus)、螺杆菌属(helicobacter)、大肠杆菌(e.coli)、立克次体属(rickettsia)、芽孢杆菌属(bacillus)、博德特氏菌属(bordetella)、衣原体属(chlamydia)、螺旋体属(spirochetes)和沙门菌属(salmonella)。在一些实施方案中，病原体受体dectin-1可用于生成识别真菌如曲霉的细胞壁上的碳水化合物结构的car。在另一实施方案中，car可以基于识别病毒决定簇(例如来自cmv和埃博拉的糖蛋白)的抗体来制备，以中断病毒感染和病理学。在一些实施方案中，“茎”、“茎区”或“茎结构域”，其包括术语“间隔区”或“间隔域”或“铰链”、“铰链区”或“铰链域”，用于将抗原结合域与跨膜结构域连接。在一些情况下，“茎结构域”或“茎区”包括任何寡核苷酸或多肽，其起到将跨膜结构域连接到细胞外结构域或多肽链中的胞质域的作用。在一些实施方案中，其足够灵活以允许抗原结合域在不同方向上定向，从而促进抗原识别。在一些情况下，茎区包含来自igg1的铰链区。在备选的情况下，茎区包含免疫球蛋白的ch2ch3区和可选的cd3的部分。在一些情况下，茎区包含cd8α铰链区(seqidno29；seqidno170)、igg4-fc12氨基酸铰链区(eskygppcppcp)或igg4铰链区，如wo/2016/073755所述。在一些实施方案中，茎区包含至少一种与cd8α2x(seqidno30；seqidno171)、cd8α3x(seqidno31；seqidno172)或cd8α4x(seqidno32；seqidno173)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽中。在其它实施方案中，在car的细胞外结构域与跨膜结构域之间，并入间隔区。间隔区可包含茎区和茎延伸区。在一个实施方案中，间隔区可包括单个茎区。在另一个实施方案中，间隔区可包含茎区和茎延伸区。例如，间隔区可包含一(1)个茎区和0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17，18、19或20个茎区。在进一步的实施方案中，茎区可以通过连接体与茎延伸区连接。跨膜结构域可以来自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。合适的跨膜结构域可包括t细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区；或来自cd28、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154的跨膜区。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，在合成跨膜结构域的一个或两个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在一些实施方案中，长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以形成car的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体。在一些实施方案中，跨膜结构域包含cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含cd8α跨膜结构域。在其它实施方案中，跨膜结构域包含cd3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜区包含至少一种与cd8α跨膜结构域的氨基酸序列(seqidno174)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，跨膜区包含至少一种与cd28跨膜结构域的氨基酸序列(seqidno175)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。细胞内结构域可包含一个或多个共刺激结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于cd8、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合。在一些情况下，本文所述的car包含选自cd8、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的car包含选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、ox40(cd134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的car包含选自cd8、cd28、4-1bb(cd137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的car包含选自cd28、4-1bb(cd137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域cd28和4-1bb(cd137)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域cd28和ox40(cd134)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域cd8和cd28或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域cd28或其片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域4-1bb(cd137)或其片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域ox40(cd134)或其片段。在一些情况下，本文所述的car包含共刺激结构域cd8或其片段。本公开内容的car的细胞内信号传导结构域(也称为细胞质结构域)负责激活已放置car的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，t细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分时，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一些实施方案中，细胞内结构域进一步包含用于t细胞活化的信号传导结构域。在一些情况下，用于t细胞活化的信号传导结构域包含衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的结构域。在一些情况下，用于t细胞活化的信号传导结构域包含衍生自cd3ζ的结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少一种与cd28(seqidno176)、cd3ζ信号传导结构域(seqidno177)、4-1bb信号传导结构域(seqidno178)、dnax激活蛋白10(dap10)信号传导结构域(seqidno179)或dnax激活蛋白12(dap12)信号传导结构域(seqidno180)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。cd19特异性carcd19是免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白。在一些情况下，已经在诸如胰腺癌、肝癌和前列腺癌的实体瘤中检测到cd19。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd19是特异性的。当在细胞表面上表达时，cd19特异性car可以将t细胞的特异性重定向至人cd19。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scfv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗cd19抗体的可变域轻链(vl)和可变域重链(vh)。在实施方案中，scfv是sj25c1和/或fmc63。在实施方案中，scfv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的vh和vl，例如，从n到c末端、vh-连接体-vl或vl-连接体-vh。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car，其中抗原结合域包含结合cd19的scfv。在一些情况下，抗原结合域识别cd19上的表位。在一些实施方案中，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被jcar014、jcar015、jcar017或19-28zcar(junotherapeutics)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被jcar014、jcar015、jcar017或19-28zcar(junotherapeutics)识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括包含scfv抗原结合域的cd19特异性car-t细胞，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被jcar014、jcar015、jcar017或19-28zcar(junotherapeutics)识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文所述的cd19特异性car-t细胞包含us20160152723中描述的抗cd19抗体。在一些实施方案中，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被kte-c19(kitepharma，inc.)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被kte-c19识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括包含scfv抗原结合域的cd19特异性car-t细胞，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被kte-c19识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文所述的cd19特异性car-t细胞包含wo2015187528中描述的抗cd19抗体或其片段或衍生物。在一些实施方案中，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ctl019(novartis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ctl019识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括包含scfv抗原结合域的cd19特异性car-t细胞，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ctl019识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ucart19(cellectis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ucart19识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括包含scfv抗原结合域的cd19特异性car-t细胞，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被ucart19识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被bpx-401(bellicum)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被bpx-401识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括包含scfv抗原结合域的cd19特异性car-t细胞，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被bpx-401识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些情况下，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(amgen)、克托西单抗(coltuximabravtansine)(immunogeninc./sanofi-aventis)、mor208(morphosysag/xencorinc.)、medi-551(medimmune)、地宁图珠单抗(denintuzumabmafodotin)(seattlegenetics)、b4(或di-b4)(merckserono)、泰普利莫单抗(taplitumomabpaptox)(nationalcancerinstitute)、xmab5871(amgen/xencor，inc.)、mdx-1342(medarex)或afm11(affimed)识别。在一些情况下，cd19特异性car进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，本文描述的包括cd19特异性car-t细胞，其中抗原结合域包含f(ab’)2、fab’、fab、fv或scfv。在一些情况下，抗原结合域识别cd19上的表位。在一些情况下，抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(amgen)、克托西单抗(immunogeninc./sanofi-aventis)、mor208(morphosysag/xencorinc.)、medi-551(medimmune)、地宁图珠单抗(seattlegenetics)、b4(或di-b4)(merckserono)、泰普利莫单抗(nationalcancerinstitute)、xmab5871(amgen/xencor，inc.)、mdx-1342(medarex)或afm11(affimed)识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、dap12、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在一些情况下，本文所述的cd19特异性car-t细胞包含scfv抗原结合域，并且抗原结合域识别cd19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(amgen)、克托西单抗(immunogeninc./sanofi-aventis)、mor208(morphosysag/xencorinc.)、medi-551(medimmune)、地宁图珠单抗(seattlegenetics)、b4(或di-b4)(merckserono)、泰普利莫单抗(nationalcancerinstitute)、xmab5871(amgen/xencor，inc.)、mdx-1342(medarex)或afm11(affimed)识别。在一些情况下，cd19特异性car-t细胞进一步包含选自cd8α跨膜结构域或cd3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、icos、dap10、ox40(cd134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自cd3ζ的信号传导结构域。在实施方案中，本文描述的car包含与seqidno210的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的cd19特异性car(cd19-cd8α-cd28-cd3ζ)。在实施方案中，本文描述的car包含与seqidno211的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的cd19特异性car(具有信号肽的cd19-cd8α-cd28-cd3ζ)。在一些实施方案中，本文描述的car的抗原结合部分对cd19是特异性的。当cd19特异性car在细胞表面上表达时，其将t细胞的特异性重定向至人cd19。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scfv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗cd19抗体的可变域轻链(vl)和可变域重链(vh)。在实施方案中，scfv是具有whitlow连接体的抗cd19克隆fmc63scfv(seqidno213)。在实施方案中，抗cd19抗体包含抗cd19单克隆抗体克隆fmc63可变重链(seqidno212)。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的vh和vl，例如，从n到c末端、vh-连接体-vl或vl-连接体-vh。工程化t细胞受体(tcr)在一些实施方案中，由本文描述的多核苷酸编码的嵌合受体包含工程化t细胞受体。t细胞受体(tcr)由两条链(αβ或γδ)组成，这两条链在t细胞表面上配对以形成异二聚体受体。在一些情况下，αβtcr在体内的大多数t细胞上表达，并且已知参与特定mhc限制性抗原的识别。每条α和β链由两个结构域组成：恒定域(c)，其将蛋白质锚定至细胞膜并与cd3信号传导器的不变亚单位缔合；以及可变域(v)，其通过称为互补决定区(cdr)的六个环赋予抗原识别。在一些情况下，每个v结构域包含三个cdr；例如，cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr3作为高变区。这些cdr与抗原肽结合至由主要组织相容性复合物(pepmhc)编码的蛋白质而形成的复合物(例如，hla-a、hla-b、hla-c、hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dra或hla-drb1复合物)相互作用。在一些情况下，恒定域进一步包含将恒定域连接到可变域的接合区。在一些情况下，β链进一步包含构成接合区的一部分的较短的多样性区域。在一些情况下，这样的tcr对特定肿瘤抗原(例如ny-eso、magea3、titin)具有反应性。在其它情况下，这样的tcr对患者肿瘤内表达的特定新抗原(即，由肿瘤表达的患者特异性突变、体细胞突变、非同义突变)具有反应性。在一些情况下，工程化tcr可以是亲和力增强的。在一些实施方案中，使用国际免疫遗传学(imgt)tcr命名法描述tcr，并且该tcr链接至tcr序列的imgt公共数据库。例如，可存在几种类型的α链可变(vα)区和几种类型的β链可变(vβ)区，按其框架、cdr1、cdr2和cdr3序列区分。因此，vα类型可以在imgt命名法中指代为独特的trav编号。例如，“trav21”定义了具有独特框架和cdr1和cdr2序列以及cdr3序列的tcrvα区域，该cdr3序列由在tcr之间保守的氨基酸序列部分限定但也包括在tcr之间变化的氨基酸序列。类似地，“trbv5-1”定义了具有独特框架和cdr1和cdr2序列以及仅部分限定的cdr3序列的tcrvβ区域。在一些情况下，β链多样性区域在imgt命名法中用缩写trbd表示。在一些情况下，由imgt命名法定义的独特序列是公知的，并且可供tcr领域的工作人员访问。例如，它们可见于imgt公共数据库和“tcellreceptorfactsbook”，(2001)lefranc和lefranc，academicpress，isbn0-12-441352-8中。在一些实施方案中，例如，αβ异二聚体tcr作为具有胞质域和跨膜结构域的全长链转染。在一些情况下，tcr在相应恒定域的残基之间含有引入的二硫键，如例如wo2006/000830中所述。在一些情况下，本文所述的tcr是单链形式，例如参见wo2004/033685。单链形式包括vα-l-vβ、vβ-l-vα、vα-cα-l-vβ、vα-l-vβ-cβ、vα-cα-l-vβ-cβ类型的αβtcr多肽，其中vα和vβ分别是tcrα和β可变区，cα和cβ分别是tcrα和β恒定区，并且l是连接体序列。在某些实施方案中，本公开的单链tcr可以在相应恒定域的残基之间具有引入的二硫键，如wo2004/033685中所述。本文所述的tcr可以与可检测标记、治疗剂或pk修饰部分缔合。用于诊断目的的示例性可检测标记包括但不限于荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。其它遗传元件尽管细胞疗法对于人类疾病的治疗具有很大的希望，但细胞本身或其转基因产物带来的显著毒性阻碍了临床研究。在本文所述的实施方案中，可以消除已经输注到哺乳动物受试者例如人中的包含本文所述的car或tcr的免疫效应细胞，以便调节这类免疫效应细胞的效果，如果它们的使用会产生毒性的话。因此，在某些实施方案中，除了本文所述的特异性嵌合抗原受体之外，还将第二基因引入本文所述的工程化免疫效应细胞中。第二基因实际上是“杀伤开关”或“细胞标签”，其允许car或tcr或含有抗原结合多肽的细胞的消耗。在某些实施方案中，“杀伤开关”是截短的her1肽(本文称为her1t或egfrt)，其至少包含her1的抗体结合表位或其功能片段，和可选的信号多肽序列或其片段。在某些实施方案中，第二基因是her1标签，其为表皮生长因子受体(her1)或其片段或变体。在实施方案中，第二基因是her1标签，其为截短的人表皮生长因子受体1(例如her1t)(seqidno76；seqidno189)。在一些情况下，第二基因是截短的人表皮生长因子受体1的变体。在一些情况下，截短的her1的变体是her1t1(seqidno77；seqidno190)、her1t2(seqidno78；seqidno191)、her1t3(seqidno79；seqidno192)、her1t4(seqidno80；seqidno193)、her1t5(seqidno81；seqidno194)、her1t6(seqidno82；seqidno195)、her1t7(seqidno83；seqidno196)、her1t8(seqidno84；seqidno197)、her1t9(seqidno85；seqidno198)、her1t10(seqidno86；seqidno199)或her1t11(seqidno87；seqidno200)。在实施方案中，her1、her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10和her1t11中的至少一种通过允许通过施用fda批准的西妥昔单抗或识别her1、her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10和/或her1t11的任何抗体来消耗输注的car-t细胞而提供安全性机制。在实施方案中，her1t基因包含与seqidno：76的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t1基因包含与seqidno：77的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t2基因包含与seqidno：78的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t3基因包含与seqidno：79的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t4基因包含与seqidno：80的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t5基因包含与seqidno：81的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t6基因包含与seqidno：82的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t7基因包含与seqidno：83的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t8基因包含与seqidno：84的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t9基因包含与seqidno：85的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t10基因包含与seqidno：86的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，her1t11基因包含与seqidno：87的酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。截短的her1序列，例如her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10和/或her1t11，消除了egfr配体结合、egfr的同源和异源二聚化和egfr介导的信号传导的可能性，同时保持西妥昔单抗与完整受体结合(ferguson，k.，2008.astructure-basedviewofepidermalgrowthfactorreceptorregulation.annurevbiophys，volume37，pp.353-373)。在进一步的实施方案中，除了本公开的治疗性靶标特异性嵌合抗原受体之外，引入的第二基因还有her1标签。在某些情况下，her1标签是全长her1多肽或截短的her1多肽(her1t1)、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10或her1t11。在一些情况下，her1标签是截短的her1变体。在一些情况下，her1标签，例如her1、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10或her1t11，还通过允许通过施用fda批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的car-t细胞来提供安全性机制。在某些实施方案中，her1标签具有与seqidno：189的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t1标签，并且具有与seqidno：190的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t2标签，并且具有与seqidno：191的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t3标签，并且具有与seqidno：192的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t4标签，并且具有与seqidno：193的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t5标签，并且具有与seqidno：194的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t6标签，并且具有与seqidno：195的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t7标签，并且具有与seqidno：196的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t8标签，并且具有与seqidno：197的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t9标签，并且具有与seqidno：198的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t10标签，并且具有与seqidno：199的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，her1标签是her1t11标签，并且具有与seqidno：200的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，第二基因是cd20标签(seqidno88；seqidno201)，它是活化的糖基化磷蛋白或其片段或变体。在一些情况下，第二基因是截短的cd20的变体——cd20t1(seqidno89；seqidno202)。在实施方案中，cd20标签、cd20标签的变体(cd20t1)或cd20或cd20t1标签的片段通过允许通过施用识别cd20的抗体消耗输注的car-t细胞而提供安全性机制。在实施方案中，编码cd20标签的基因包含与seqidno：88的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，编码cd20t1标签的基因包含与seqidno：89的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，除了本公开的治疗性靶标特异性嵌合抗原受体之外，引入的第二基因还有cd20标签。在一些情况下，cd20标签是全长cd20多肽或截短的cd20多肽(cd20t1)。在实施方案中，包含本文所述car的car载体进一步包含全长cd20标签，后者包含与seqidno：88的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在实施方案中，包含本文所述car的car载体进一步包含cd20标签的变体(cd20t1)，后者包含与seqidno：89的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在实施方案中，编码杀伤标签如her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10或her1t11的基因通过采用自切割肽，例如但不限于thoseaasigna病毒(t2a)肽，与car或tcr或细胞因子符合读框地遗传融合。在实施方案中，t2a肽具有与seqidno153的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，编码杀伤标签如her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10或her1t11的基因通过采用自切割肽，例如但不限于thoseaasigna病毒(t2a)肽，与细胞因子在3′端符合读框地遗传融合。在实施方案中，将两种基因均克隆到质粒中。在其它实施方案中，将细胞标签克隆到单独的慢病毒载体中。在其它实施方案中，将细胞标签基因克隆到睡美人转座子载体骨架中，与car基因符合读框。在其它实施方案中，将细胞标签如her1t、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10或her1t11克隆到多个睡美人转座子载体中。在某些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如gm-csfrα信号肽，其中该gm-csfrα信号肽与seqidno：163的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在某些实施方案中，信号肽是igk，其具有与seqidno：164的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是ige，其具有与seqidno：165的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是cd8α，其具有与seqidno：166的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是tvb2(t21a)，其具有与seqidno：167的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是cd52，其具有与seqidno：168的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是低亲和力神经生长因子受体(lngfr，tnfrsf16)，其具有与seqidno：169的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些情况下，信号肽可选自gm-csfrα、igk、ige、cd8α、t21a、cd52、低亲和力神经生长因子受体变体及其片段。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如gm-csfrα信号肽，其中该gm-csfrα信号肽由与seqidno20或seqidno21的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如igk信号肽，其中该igk信号肽由与seqidno22的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如ige信号肽，其中该igk信号肽由与seqidno23的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如cd8α信号肽，其中该cd8α信号肽由与seqidno24或seqidno25的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如tvb2(t21a)信号肽，其中该tvb2(t21a)信号肽由与seqidno26的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如cd52信号肽，其中该信号肽cd52信号肽由与seqidno27的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如，低亲和力神经生长因子受体(lngfr，tnfrsf16)信号肽，其中该低亲和力神经生长因子受体(lngfr，tnfrsf16)信号肽由与seqidno28的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。信号肽是通常位于新合成的蛋白质或多肽的n-末端的氨基酸序列，其将蛋白质或多肽引导至细胞表面。在一些实施方案中，信号肽将多肽引导至细胞表面，以便插入(例如，通过跨膜结构域)细胞膜内。在一些实施方案中，合成具有信号肽的本文所述的多肽构建体，但随后翻译后加工以切割信号肽，使得成熟多肽构建体缺乏信号肽氨基酸序列。在其它实施方案中，信号肽序列不被切割，而是保留在成熟多肽构建体中。本公开内容提供了包含能够将多肽构建体引导和/或运输至细胞表面的任何已知或未知信号肽的多肽构建体。例如，在一些实施方案中，多肽构建体包含对应于gmcsfrα、igκ、免疫球蛋白e、cd8α、tvb2(t21a)、cd52或低亲和力神经生长因子受体(lngfr，tnfrsf16)的信号肽的信号序列。在实施方案中，信号肽由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与选自由seqidno：20-28组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，信号肽包含与选自由seqidno：163-169组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。经修饰的效应细胞提供了经修饰以表达一种或多种异源基因或由本文公开的基因开关多肽调节的基因的效应细胞(也称为免疫效应细胞)。如本文所用的“t细胞”或“t淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中起重要作用的一种类型的淋巴细胞。它们与其它淋巴细胞如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)的区别可在于在细胞表面上存在t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是包含t细胞和/或自然杀伤细胞的经修饰的免疫细胞。t细胞或t淋巴细胞是参与细胞介导的免疫的白细胞亚型。示例性t细胞包括t辅助细胞、细胞毒性t细胞、th17细胞、记忆性干细胞样t细胞(tscm)、幼稚t细胞、记忆t细胞、效应t细胞、调节性t细胞或自然杀伤t细胞。“t辅助细胞”(th细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，该免疫过程包括b细胞成熟为浆细胞和记忆b细胞，以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化。在一些情况下，由于cd4糖蛋白在细胞表面上的表达，th细胞被称为cd4+t细胞。辅助性t细胞在通过mhcii类分子呈递肽抗原时被活化，该mhcii类分子在抗原呈递细胞(apc)的表面上表达。辅助性t细胞一旦被活化，就迅速分裂并分泌出被称为细胞因子的小蛋白质，该细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括th1、th2、th3、th17、th9或tfh，这些亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自apc的信号传导将t细胞引导至特定的亚型。“细胞毒性t细胞”(tc细胞或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。这些细胞也被称为cd8+t细胞，因为其在表面上表达cd8糖蛋白。这些细胞通过结合与mhci类分子缔合的抗原而识别它们的靶标，该mhci类分子存在于所有有核细胞的表面上。通过il-10、腺苷和由调节性t细胞分泌的其它分子，cd8+细胞可以被灭活至无反应状态，从而防止自身免疫性疾病。“记忆t细胞”是在感染消退后长期持续存在的抗原特异性t细胞的一个亚群。其在重新暴露于其同源抗原后迅速扩充成大量效应t细胞，从而为免疫系统提供针对以往感染的“记忆”。记忆t细胞包括以下亚型：干细胞记忆性t细胞(tscm)、中枢记忆性t细胞(tcm细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4+或cd8+。记忆t细胞可以表达细胞表面蛋白质cd45ro、cd45ra和/或ccr7。“调节性t细胞”(treg细胞)，以前称为抑制性t细胞，在维持免疫耐受性中起作用。其主要作用是在免疫反应结束时停止t细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中的阴性选择过程的自身反应性t细胞。“自然杀伤t细胞”(nkt细胞)将先天免疫系统与适应性免疫系统联系起来。与识别由主要组织相容性复合物(mhc)分子呈递的肽抗原的常规t细胞不同，nkt细胞识别由被称为cd1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被活化，这些细胞可以执行属于th细胞和tc细胞的功能(即，细胞因子产生和细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。自然杀伤(nk)细胞是先天免疫系统的一种类型的细胞毒性淋巴细胞。在一些情况下，nk细胞提供针对病毒感染和/或肿瘤形成的第一线防御。nk细胞可检测被感染细胞或癌细胞上呈递的mhc，从而触发细胞因子释放，随后诱导裂解和凋亡。nk细胞可以在不存在抗体和/或mhc的情况下进一步检测应激的细胞，从而允许快速免疫应答。经修饰的效应细胞剂量在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105个经修饰的效应细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是经修饰的t细胞。在一些情况下，经修饰的t细胞是car-t细胞。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约105至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约105至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约105至约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约106至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约106至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约107至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约105至约106个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约106至约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约107至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约108至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约106个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的car-t细胞包含约105个car-t细胞/kg。在一些实施方案中，car-t细胞是cd19特异性car-t细胞。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约105至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约105至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约105至约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约106至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约106至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约107至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约105至约106个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约106至约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约107至约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约108至约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约109个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约108个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约107个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约106个car-t细胞/kg。在一些情况下，一定量的cd19特异性car-t细胞包含约105个car-t细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰的t细胞是工程化tcrt细胞。在一些情况下，一定量的工程化tcrt细胞包含约105至约109个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约105至约108个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约105至约107个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约106至约109个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约106至约108个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约107至约109个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约105至约106个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约106至约107个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约107至约108个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约108至约109个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约109个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约108个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约107个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约106个tcr细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化tcr细胞包含约105个tcr细胞/kg。适应证在一些实施方案中，本文公开了向患有病症(例如癌症或传染病)的受试者施用编码本文所述多核苷酸的经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是与cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2的表达相关的癌症。在一些实施方案中，本文公开了向患有与cd19过表达相关的癌症的受试者施用多核苷酸、多肽或编码本文所述多核苷酸的修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与cd33过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2的过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在其它情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其它情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在一些情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，所述癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆道癌(即胆管癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发灶不明癌(cup)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌；或胶质母细胞瘤。“胶质母细胞瘤”或“多形性胶质母细胞瘤”(gbm)是一种侵袭性神经上皮脑癌。gbm可以源自神经胶质型细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞或神经干细胞。已经鉴定出四种胶质母细胞瘤亚型。经典亚型(大多数gbm)携带表皮生长因子受体(egfr)基因的额外拷贝，并且大多数具有高于正常的表皮生长因子受体(egfr)表达。在一部分病例中，egfr扩增伴随着基因重排，其中最常见的是egfr变体iii(egfrviii)。经常在胶质母细胞瘤中突变的基因tp53(p53)在经典亚型中很少发生突变。原神经亚型通常具有tp53(p53)和pdgfra(编码血小板衍生生长因子受体a的基因)和idh1(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)的高变化率。间充质亚型的特征在于nf1(编码神经纤维瘤蛋白1的基因)中的高突变或其它改变率，和egfr基因中的较少改变以及egfr低于其它类型的表达。神经亚型的特点为神经元标志物如nefl、gabra1，syt1和slc12a5的表达。已经描述了胶质母细胞瘤中的其它遗传改变，并且它们中的大多数聚集在两个途径中，即rb和pi3k/akt。胶质母细胞瘤分别在68-78％和88％的这些途径中具有改变。在一些情况下，所述癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或b细胞恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些情况下，示例性血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、高危cll、非cll/sll淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(pll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括髓样白血病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括急性髓样白血病(aml)或慢性髓样白血病(cml)。在一些情况下，本文公开了向患有血液系统恶性肿瘤的受试者施用本文所述的经修饰的效应细胞的方法，该血液系统恶性肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、高危cll、非cll/sll淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(pll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，本文公开了向患有选自aml或cml的血液系统恶性肿瘤的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在其它情况下，本文公开了向具有传染病引起的感染的受试者施用的方法。传染病可以是由细菌、病毒或真菌感染引起的疾病。在其它情况下，示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、jc病毒、bk病毒、hsv病毒科、hhv病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属、组织胞浆菌属、肺囊虫属和葡萄穗霉属。示例性的致病细菌包括链球菌属、假单胞菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属、大肠杆菌、立克次体属、芽孢杆菌属、博德特氏菌属、衣原体属、螺旋体属和沙门菌属。基于病毒的递送系统本发明还提供了递送系统，如基于病毒的系统，其中插入了本文所述的核酸。代表性的病毒表达载体包括但不限于腺相关病毒载体、基于腺病毒的载体(例如，可从crucell，inc.(leiden，thenetherlands)获得的基于腺病毒的per.c6系统)、基于慢病毒的载体(例如，来自lifetechnologies(carlsbad，calif.)的基于慢病毒的plpi)、逆转录病毒载体(例如，pfb-erv加pcfb-egsh)和基于疱疹病毒的载体。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为其可以转导非增殖细胞如肝细胞。慢病毒载体还具有低免疫原性的额外优势。在另外的实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在进一步的实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。通常来说，并且在实施方案中，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；以及美国专利6,326,193)。其它合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的dna中，或者可以包括重组位点以实现表达载体与宿主细胞染色体之间的特异性重组。这样的整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括，例如，来自invitrogen(carlsbad，calif.)的flp-in系统的组分(例如，pcdnatm5/frt)，或例如可见于来自stratagene(lajolla，calif.)的pexchange-6核心载体中的cre-lox系统。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，来自invitrogen(carlsbad，calif.)的pcdna3.1(当在没有t-抗原的情况下引入时)和来自promega(madison，wis.)的pci或pfn10a(act)flexttm。额外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。尽管最近已示出许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件，但通常这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录，这取决于启动子。合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例是人延伸生长因子1α1(hef1a1)。在实施方案中，包含本公开的car和/或tcr的载体构建体包含hef1a1功能变体。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、eb病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本公开内容不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被考虑为本公开内容的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够开启可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当需要这样的表达时)，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。诱导型启动子的其它实例包括但不限于本文所述的组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子包含nf-κb结合位点(seqidno44-46)、活化t细胞核因子(nfat)应答元件(seqidno51)、6位点gal4-诱导型近端因子结合元件(pfb)(seqidno62)或基于rpl6的合成5’utr(seqidno64)。在某些实施方案中，启动子可以是以下任何一种或多种：il-2核心启动子、il-2最小启动子、il-2增强子和启动子变体、(nf-κb)1-il2启动子变体、(nf-κb)3-il2启动子变体、(nf-κb)6-il2启动子变体、1xnfat应答元件-il2启动子变体、3xnfat应答元件-il2启动子变体、6xnfat应答元件-il2启动子变体、人eef1a1启动子变体、人eef1a1启动子和增强子、人ubc启动子和合成的最小启动子1。在某些实施方案中，启动子核苷酸包括表2中公开的那些。为了评估car或tcr多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体来转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因如新霉素抗性基因(neo)和氨苄青霉素抗性基因等。在一些实施方案中，截短的表皮生长因子受体(her1t)标签可用作选择标记基因。报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受体生物体或组织中且不由其表达的基因，其编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现。在将dna引入接受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tei等人，febsletters479：79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，示出报告基因最高表达水平的具有最小5′侧翼区的构建体被鉴别为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。在一些实施方案中，载体包含驱动转基因表达的hef1a1启动子、增强转录的牛生长激素ploya序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)以及衍生自pfugw质粒的ltr序列。将基因引入细胞以及使基因在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转移到宿主细胞中。用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。例如，参见sambrook等人(molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork(2001))。在实施方案中，用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法是磷酸钙转染或聚乙烯亚胺(pei)转染。用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人细胞)中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利5,350,674和5,585,362。用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。在利用病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以从sigma，st.louis，mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“dcp”)可以从k&klaboratories(plainview，n.y.)获得；胆固醇(“chol”)可以从calbiochem-behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其它脂质可以从avantipolarlipids，inc.(birmingham，ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(ghosh等人，glycobiology5：505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。基于非病毒的递送系统在一些情况下，还可以使用基于非病毒的递送系统如“睡美人(sb)转座子系统”将编码用于表达本文所述的car和/或tcr的基因开关多肽的多核苷酸引入t细胞中，该睡美人转座子系统是指一种合成的dna转座子系统，用于将dna序列引入脊椎动物的染色体中。该系统的一些示例性实施例描述于美国专利6,489,458、8,227,432、9,228,180和wo2016/145146中。睡美人转座子系统由睡美人(sb)转座酶和sb转座子组成。在一些实施方案中，睡美人转座子系统可包括sb11转座子系统、sb100x转座子系统或sb110转座子系统及其任何其它变体。dna转座子以简单的剪切-粘贴方式从一个dna位点易位到另一dna位点。转座是一个精确的过程，其中限定的dna片段从一个dna分子切下并移动到相同或不同dna分子或基因组中的另一位点。与其它tc1/mariner型转座酶一样，sb转座酶将转座子插入接受体dna序列中的ta二核苷酸碱基对中。插入位点可以在相同dna分子中的其它地方，或在另一dna分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组(包括人基因组)中大约有2亿个ta位点。ta插入位点在转座子整合过程中重复。这种ta序列的重复是转座的标志，并用于确定一些实验中的机理。转座酶可以在转座子内编码，或者转座酶可以由另一来源例如dna或mrna来源提供，在该情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子作为遗传工具最有用，因为在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。sb转座子被设想用作非病毒载体，用于将基因引入脊椎动物的基因组中和基因疗法。简言之，睡美人(sb)系统(hackett等人，molther18：674-83，(2010))适用于对t细胞进行遗传修饰(cooper等人，blood105：1622-31，(2005))。这涉及两个步骤：(i)表达sb转座子(即，嵌合抗原受体(car)，用于重定向t细胞特异性(jin等人，genether18：849-56，(2011)；kebriaei等人，humgenether23：444-50，(2012))和sb转座酶的dna质粒的电转移，以及(ii)稳定表达整合体的t细胞在衍生自k562细胞系的设计者人工抗原呈递细胞(aapc)(也是称为aapc(活化和扩增细胞))上的增殖和扩充。在一个实施方案中，sb转座子系统包括编码tdil-15、il-21和/或嵌合抗原受体的编码序列。这样的系统于例如singh等人，cancerres(8)：68(2008).2008年4月15日和maiti等人，jimmunother.36(2)：112-123(2013)中有述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，编码car或tcr、一种或多种基因开关多肽和mbil-15的多核苷酸在一个或多个睡美人转座子中编码，并且sb转座酶在单独的载体中编码。在实施方案中，cd19特异性car在转座子dna质粒载体中编码，mb-il15在第二转座子dna质粒载体中编码，并且sb转座酶在第三dna质粒载体中编码。在一些实施方案中，mbil-15被编码具有细胞标签。细胞标签的实例可包括截短的表皮生长因子受体标签(her1t)、her1t1、her1t2、her1t3、her1t4、her1t5、her1t6、her1t7、her1t8、her1t9、her1t10、her1t11、cd20和cd20t1。用作消耗或杀伤开关或富集标记的cd20标签或其它任何适当的细胞标签。包含细胞标签的非限制性示例性基因开关载体系统在图2a-2d、图3、图19a-19b、图20a、图22、图24a-24d和图25a-25b中示出。在一些实施方案中，her1t通过允许通过施用fda批准的西妥昔单抗或识别her1t的任何抗体来消耗输注的car-t细胞而提供安全性机制。在一些实施方案中，cd20还通过允许通过施用fda批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的car-t细胞来提供安全性机制。无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法是哪一种，为了确认宿主细胞中存在重组dna序列，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员公知的分子试验，如southern和northern印迹法、rt-pcr和pcr；“生物化学”试验，如检测是否存在特定肽，例如通过免疫学手段(elisa和western印迹法)或通过本文所述的用于鉴别落入本公开内容范围内的药剂的试验。在实施方案中，使用sb11转座子系统、sb100x转座子系统、sb110转座子系统，piggybac转座子系统(参见例如wilson等人，“piggybactransposon-mediatedgenetransferinhumancells.”moleculartherapy15：139-145(2007)，其通过引用整体并入本文)和/或piggybac转座子系统(参见例如mitra等人，“functionalcharacterizationofpiggybacfromthebatmyotislucifugusunveilsanactivemammaliandnatransposon，”proc.natl.acad.sciusa110：234-239(2013))将本文所述的经修饰的效应细胞和其它遗传元件递送至细胞。另外的转座酶和转座子系统在美国专利6,489,458；6,613,752，7,148,203；7,985,739；8,227,432；9,228,180；美国专利公开2011/0117072；mates等人，natgenet，41(6)：753-61(2009).doi：10.1038/ng.343.2009年5月3日电子发表，genether.，18(9)：849-56(2011).doi：10.1038/gt.2011.40.2011年3月31日电子发表，以及ivics等人，cell.91(4)：501-10，(1997)中提供，其各自通过引用整体并入本文。其它合适的非病毒系统可以包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的dna中，或者可以包括重组位点以使表达载体与宿主细胞染色体之间能够进行特异性重组。将转基因靶向整合到预定义的遗传基因座中是许多应用的理想目标。首先，将位点特异性重组酶的第一重组位点插入基因组位点，无论是随机位置还是预定位置。随后，用携带目的基因或dna和第二重组位点的质粒和重组酶来源(表达质粒、rna、蛋白质或病毒表达的重组酶)转染细胞。第一与第二重组位点之间的重组导致质粒dna的整合。此类整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列来促进靶向整合。例如，使用本文所述的供体多核苷酸的靶向整合可以按照常规转染技术实现，例如，用来通过同源重组产生基因敲除或敲入的技术。在其它实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列，以及通过在位点特异性重组酶的存在下使细胞与供体多核苷酸接触，来促进靶向整合。所谓位点特异性重组酶，或者简称为重组酶，意指催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽。如本文所用的，位点特异性重组酶包括天然多肽以及保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。本文还提供了用于将异源基因整合到宿主细胞中的系统，所述系统包含一个或多个基因表达盒。在一些情况下，该系统包括第一基因表达盒，其包含编码第一多肽构建体的第一多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第二基因表达盒，其包含编码第二多肽构建体的第二多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第三基因表达盒。在一个实施方案中，所述基因表达盒之一可包含编码以下一种或多种的基因开关多核苷酸：(i)反式激活域；(ii)核受体配体结合域；(iii)dna结合域；和(iv)蜕皮素受体结合域。在另一个实施方案中，该系统还包括重组附着位点；和丝氨酸重组酶；使得在所述丝氨酸重组酶的存在下，在所述宿主细胞与至少所述第一基因表达盒接触时，所述异源基因被整合到所述宿主细胞中。在一些情况下，所述系统进一步包含配体；使得在所述配体的存在下，在所述宿主细胞接触时，所述异源基因在所述宿主细胞中表达。在一种情况下，该系统还包括重组附着位点。在一些情况下，一个重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attp)或细菌基因组重组附着位点(attb)。在一种情况下，宿主细胞是真核细胞。在另一种情况下，宿主细胞是人细胞。在其它情况下，宿主细胞是t细胞或k细胞。在一个实施方案中，上述系统中的异源基因包含car。在一些实施方案中，该car结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123或vegf-r2中的至少一种。在另一个实施方案中，所述系统包括含有细胞因子的异源基因。在一种情况下，该细胞因子包括il-15、il-12、il-21和il-15与il-15rα的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，所述系统包括含有至少一种细胞标签的异源基因。在一种情况下，所述细胞标签包含her1t和cd20中的至少一种。在一些实施方案中，mbil-15被编码具有细胞标签。细胞标签的实例可包括截短的表皮生长因子受体标签(her1t)、cd20标签或用作消耗或杀伤开关或富集标记的其它任何适当的细胞标签。细胞标签的示例性序列如下：表3.细胞标签氨基酸序列和多核苷酸序列在进一步的实施方案中，至少一个所述基因表达盒包含编码被反式激活域激活的启动子的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述系统被包含在一个或多个载体中。在一种情况下，所述系统被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒、第三基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在另一种情况下，丝氨酸重组酶是sf370。在其它情况下，丝氨酸重组酶在单独的载体中。可以在引入靶向载体之前、同时或之后将重组酶引入靶细胞中。重组酶可以作为蛋白质直接引入细胞中，例如，使用脂质体、包被的颗粒或显微注射。或者，可以使用合适的表达载体将编码重组酶的多核苷酸(dna或信使rna)引入细胞中。上述靶向载体组分可用于构建含有编码感兴趣的重组酶的序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以以其它方式调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节启动子(即，可以选择性地诱导或抑制其表达的启动子)的控制下。用于实施本发明的重组酶可以如前所述重组产生或纯化。具有所需重组酶活性的多肽可通过蛋白质硫酸铵沉淀、纯化领域中已知的方法纯化至所需纯度水平，包括但不限于大小分级分离、亲和色谱法、hplc、离子交换色谱法、肝素琼脂糖亲和色谱法(例如，thorpe&smith，proc.nat.acad.sci.95：5505-5510，1998)。在一个实施方案中，可以将重组酶引入真核细胞中，该真核细胞含有通过任何合适的方法需要重组的重组附着位点。例如通过显微注射或其它方法将功能性蛋白质引入细胞中的方法是本领域熟知的。纯化的重组酶蛋白质的引入确保了蛋白质及其功能的短暂存在，这通常是优选的实施方案。或者，编码重组酶的基因可以被包括在用于转化细胞的表达载体中，其中编码重组酶的多核苷酸与介导多核苷酸在真核细胞中表达的启动子可操作地连接。还可以通过编码重组酶多肽的信使rna将该重组酶多肽引入真核细胞中。通常优选重组酶仅存在将核酸片段插入被修饰的基因组中所必需的时间。因此，预计缺乏与大多数表达载体相关的持久性并非不利的。可以在引入外源目的多核苷酸之前、之后或同时将重组酶基因引入细胞中。在一个实施方案中，重组酶基因存在于携带待插入的多核苷酸的载体内；重组酶基因甚至可以被包括在多核苷酸内。在其它实施方案中，将重组酶基因引入转基因真核生物中。可以制备转基因细胞或动物，其组成型地或在细胞特异性、组织特异性、发育特异性、细胞器特异性或小分子诱导型或可阻抑型启动子下表达重组酶。重组酶还可以表达为与其它肽、蛋白质、核定位信号肽、信号肽或细胞器特异性信号肽(例如，线粒体或叶绿体转运肽，以促进在线粒体或叶绿体中的重组)的融合蛋白。例如，重组酶可以来自融合酶或解离酶家族。整合酶重组酶家族具有超过一百个成员，并且包括例如flp、cre和λ整合酶。整合酶家族，也称为酪氨酸家族或λ整合酶家族，使用催化酪氨酸的羟基对dna的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初在dna上形成切口，后来形成双链断裂。酪氨酸家族整合酶的实例包括cre、flp、ssv1和lambda(λ)整合酶。在解离酶家族(也称为丝氨酸重组酶家族)中，保守的丝氨酸残基与dna靶位点形成共价连接(grindley，等人，(2006)annrevbiochem16：16)。在一个实施方案中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包含编码重组酶的核酸序列，该重组酶选自spβc2重组酶、sf370.1重组酶、bxb1重组酶、a118重组酶和φrv1重组酶。丝氨酸重组酶的实例在美国专利9,034,652中详细描述，其通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，用于位点特异性重组的方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；使第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致重组位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导第一与第二重组位点之间的重组，第一重组位点是attp或attb，第二重组位点是attb或attp，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)噬菌体重组酶、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attb时，第二重组附着位点是attp，并且当第一重组附着位点是attp时，第二重组附着位点是attb。进一步的实施方案提供将位点特异性重组酶引入其基因组将被修饰的细胞中。一个实施方案涉及用于在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，其包括提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；使第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在重组附着位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导在第一与第二重组附着位点之间的重组，第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attp)或细菌基因组重组附着位点(attb)，第二重组附着位点是attb或attp，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attb时，第二重组附着位点是attp，并且当第一重组附着位点是attp时，第二重组附着位点是attb。在一个实施方案中，该重组酶选自a118重组酶、sf370.1重组酶、spβc2重组酶、φrv1重组酶和bxb1重组酶。在一个实施方案中，该重组导致整合。免疫效应细胞来源在某些方面，本文所述的实施方案包括制备和/或扩充抗原特异性重定向免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞或nkt细胞)的方法，其包括用含有编码car的dna(或rna)构建体的表达载体转染细胞，然后任选地用饲养细胞、重组抗原或针对受体的抗体刺激细胞，以使细胞增殖。在某些方面，经工程化以表达car或tcr的细胞(或细胞群体)是干细胞、ips细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。免疫效应细胞的来源可包括同种异体来源和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可以从干细胞或诱导多能干细胞(ipsc)分化。因此，根据实施方案的用于工程化的细胞可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或ipsc中分离。例如，可以将同种异体t细胞修饰成包括嵌合抗原受体(并且任选地缺乏功能性tcr)。在一些方面，免疫效应细胞是原代人t细胞，如来源于人外周血单核细胞(pbmc)的t细胞。pbmc可以从外周血中收集，或者在用g-csf(粒细胞集落刺激因子)刺激后从骨髓收集，或从脐带血收集。在(例如，用car表达构建体)转染或转导后，可以立即输注细胞或者可以冷冻保存细胞。在某些方面，在转染后，细胞可以在基因转移到细胞后的约1、2、3、4、5天或更多天内作为本体群体离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，在转染后，将转染体克隆，并将表现出存在单个整合的或附加体保持的表达盒或质粒以及嵌合抗原受体的表达的克隆离体扩充。选择用于扩充的克隆表现出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过用il-2或结合共同γ链的其它细胞因子(例如il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激来扩充重组t细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩充重组t细胞。重组t细胞可以在人工抗原呈递细胞上扩充，或者用与t细胞表面上的cd3交联的抗体如okt3扩充。可以使用基于磁珠的分离方法和/或荧光激活细胞分选技术进一步选择重组t细胞的亚组，并将其进一步与aapc一起培养。在另一方面，可以冷冻保存经遗传修饰的细胞。t细胞也可以从许多来源获得，包括外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤(肿瘤浸润淋巴细胞)。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数目的t细胞系。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术如分离从采集自受试者的血液单位获得t细胞。在实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，以用于随后的处理步骤。在本公开的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在替代的实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或者可能缺少许多(即便不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。本领域普通技术人员将会容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，cobe2991细胞处理器、baxtercytomate或haemoneticscellsaver5)。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液，如无ca2+、无mg2+的pbs、plasmalytea或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液中。或者，可以去除单采样品中的不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。在另一实施方案中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如，通过梯度离心或通过逆流离心淘洗)，从外周血淋巴细胞中分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的t细胞亚群，如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗-cd3/抗-cd28(即，3x28)缀合的珠子(如m-450cd3/cd28t)一起孵育足够用于所需t细胞的阳性选择的时间段来分离t细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在进一步的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一实施方案中，该时间段是10至24小时。在一个实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离t细胞，使用更长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产率。可以在t细胞与其它细胞类型相比较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损的个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(til)的情况下使用更长的孵育时间来分离t细胞。进一步地，使用更长的孵育时间可以提高捕获cd8+t细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许t细胞与cd3/cd28珠子结合的时间，和/或通过增加或减少珠子与t细胞(如本文进一步描述的)的比值，可以在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择或排除某t细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其它表面上的抗cd3和/或抗cd28抗体的比值，可以在培养起始时或在其它所需时间点优先选择或排除某t细胞亚群。技术人员将会认识到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。也可使“未选择的”细胞经历进一步轮次的选择。t细胞群体通过阴性选择的富集可以用针对阴性选择的细胞的特有表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达cd4+、cd25+、cd62lhi、gitr+和foxp3+的调节性t细胞。或者，在某些实施方案中，t调节细胞被抗cd25缀合的珠子或其它类似的选择方法消耗。为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如cd28阴性t细胞)或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且将是需要获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+t细胞。在相关的实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小。这选择表达大量待与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，cd4+t细胞表达较高水平的cd28，并且在稀释浓度下比cd8+t细胞更有效地捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是5x106/ml。在其它实施方案中，使用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml以及其间的任何整数值。在其它实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下以变化的速度在旋转器上孵育不同的时间长度。用于刺激的t细胞也可在洗涤步骤后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并在这种情况下将会是有用的，但一种方法涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基，或31.25％plasmalyte-a、31.25％右旋糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso，或含有例如hespan和plasmalytea的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或液氮中的不受控的速冻。在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法活化之前使其在室温下静置1小时。在本公开的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的经扩充细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩充细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞如t细胞，以供随后在t细胞疗法中用于将受益于t细胞疗法的任何数目的疾病或病况，例如本文所述的疾病或病况。在一个实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者，该受试者有发展出疾病的风险但尚未发展出该疾病，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻以供随后使用。在某些实施方案中，t细胞可以扩充、冷冻并在随后使用。在某些实施方案中，在任何治疗之前，在诊断如本文所述的特定疾病之后的较短时间内从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在任何数目的相关治疗方式前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，该治疗方式包括但不限于采用诸如以下的药剂的治疗：那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和fk506等免疫抑制剂、抗体或其它免疫清除剂，如campath、抗cd3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性的磷酸酶——钙依赖磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liu等人，cell66：807-815，(1991)；henderson等人，immun73：316-321，(1991)；bierer等人，curr.opin.immun5：763-773，(1993))。在进一步的实施方案中，为患者分离细胞并将其冷冻，以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的t细胞消融疗法、外照射放射疗法(xrt)、环磷酰胺或抗体如okt3或campath结合使用(例如，在其之前、同时或之后)。在另一实施方案中，细胞预先分离并且可被冷冻以供随后用于在b细胞消融疗法(如与cd20反应的药剂，例如利妥昔单抗)之后的治疗。在本公开的进一步的实施方案中，在治疗后直接从患者获得t细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在该治疗后不久且在患者通常将从治疗中恢复的时期中，所获得的t细胞的质量可能是最佳的或改善的，因为其有离体扩充的能力。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于植入和体内扩充增强的优选状态。因此，在本公开的上下文中考虑在该恢复期中收集血细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步地，在某些实施方案中，动员(例如，用gm-csf动员)和调节方案可用于在受试者体内产生这样的条件，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩充是有利的，尤其是在疗法后限定的时间窗口内。示例性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。t细胞的活化和扩充在某些实施方案中是包含编码用于表达本文所述的白介素、car和/或tcr的基因开关多肽的多核苷酸的t细胞。无论是在将t细胞遗传修饰成表达所需car之前还是之后，t细胞通常可以使用如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法进行活化和扩充。“过继性t细胞转移”是指肿瘤特异性t细胞的分离和离体或体内扩充，以获得比单独接种疫苗或患者的天然肿瘤应答所获得的更多数目的t细胞。然后将肿瘤特异性t细胞输注到癌症患者体内，试图通过可以攻击和杀死癌的t细胞使其免疫系统具有压倒剩余的肿瘤的能力。有许多形式的过继性t细胞疗法用于癌症治疗；培养肿瘤浸润淋巴细胞或til，分离并扩充一种特定的t细胞或克隆，甚至使用经过工程化以有效识别并攻击肿瘤的t细胞。在一些方面，过继性t细胞疗法可以包括经过修饰并立即输注到患者体内的工程化抗原特异性t细胞，从而允许在患者体内发生抗原特异性t细胞的体内扩充。在一些情况下，本文所述的t细胞通过与已附接有药剂(刺激cd3/tcr复合物相关信号)和配体(刺激t细胞表面上的共刺激分子)的表面接触而活化和/或扩充。特别地，可以如本文所述地刺激t细胞群体，如通过与固定在表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段或抗cd2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶c激活剂接触(例如，苔藓抑制素)。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激t细胞增殖的条件下，使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖，采用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括9.3，b-t3，xr-cd28(diaclone，besancon，france)，其可以与本领域公知的其它方法一样使用(berg等人，transplantproc.30(8)：3975-3977，(1998)；haanen等人，j.exp.med.190(9)：13191328，(1999)；garland等人，j.immunolmeth.227(1-2)：53-63，(1999))。在某些实施方案中，t细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同表面(即，“顺式”排列)或不同表面(即“反式”排列)。或者，可以将一种药剂偶联到表面而另一药剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂结合到细胞表面，并且提供主要激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，两种药剂可以都在溶液中。在另一实施方案中，药剂可以是可溶形式，并然后交联至表面，如表达fc受体的细胞或将会与该药剂结合的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开20040101519和20060034810中的预期用于活化和扩增本公开的t细胞的人工抗原呈递细胞(aapc)。在一个实施方案中，将两种药剂固定在珠子上(固定在相同的珠子上，即“顺式”，或者固定在不同的珠子上，即“反式”)。例如，提供主要激活信号的药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定到相同的珠子。在一个实施方案中，用于cd4+t细胞扩充和t细胞生长的与珠子结合的每种抗体使用1∶1的比值。在本公开的某些方面，使用这样的与珠子结合的抗cd3抗体：抗cd28抗体比，使得与使用1∶1的比值观察到的扩充相比，观察到t细胞扩充增加。在一个特定的实施方案中，与使用1∶1的比值观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的cd3抗体：cd28抗体的比值范围为100∶1至1∶100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗cd3抗体相比，更多的抗cd28抗体与颗粒结合，即cd3∶cd28比小于1。在本公开的某些实施方案中，与珠子结合的抗cd28抗体与抗cd3抗体的比值大于2∶1。在一个特定的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶100的cd3∶cd28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶75的cd3∶cd28比。在进一步的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶50的cd3∶cd28比。在另一的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶30的cd3∶cd28比。在实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶10的cd3∶cd28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶3的cd3∶cd28比。在又一实施方案中，与珠子结合的抗体使用3∶1的cd3∶cd28比。从1∶500至500∶1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比值可用于刺激t细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以容易理解，颗粒与细胞的比值可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，大小较小的珠子只能结合少量细胞，而较大的珠子可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比值范围为1∶100至100∶1以及其间的任何整数值，并且在进一步的实施方案中，该比值包括1∶9至9∶1以及其间的任何整数值，也可用于刺激t细胞。如上所述，抗cd3和抗cd28偶联的颗粒与t细胞的导致t细胞刺激的比值可以变化，但是某些值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，其中一个比值是t细胞/颗粒为至少1∶1。在一个实施方案中，使用1∶1或更小的颗粒：细胞比。在一个特定的实施方案中，颗粒：细胞比为1∶5。在进一步的实施方案中，颗粒：细胞比可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒：细胞比在第一天为1∶1至10∶1，并且之后每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞，持续至多10天，最终比值为1∶1至1∶10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，颗粒：细胞比在刺激的第一天为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1∶5。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1∶5。在另一实施方案中，颗粒：细胞比在刺激的第一天为2∶1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1∶10。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1∶10。本领域技术人员将会理解，多种其它比值可适用于本公开。特别地，比值将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在本公开的进一步的实施方案中，将细胞如t细胞与药剂包被的珠子组合，然后将珠子和细胞分离，并随后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，未分离药剂包被的珠子和细胞，而是将其一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。举例来说，可以通过允许抗cd3和抗cd28所附接至的顺磁珠(3x28个珠子)与t细胞接触来连接细胞表面蛋白质。在一个实施方案中，将细胞(例如，104到109个t细胞)和珠子(例如，比值为1∶1的m-450cd3/cd28t顺磁珠，或来自miltenyibiotec的microbeads)在缓冲液例如pbs(无二价阳离子，如钙和镁)中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见并且仅构成0.01％的样品，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本公开的情况的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩充增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱低表达感兴趣的靶抗原的细胞，如cd28阴性t细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且在某些实施方案中需要获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+t细胞。在本公开的一个实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何整数小时的值。在另一实施方案中，可以将混合物培养21天。在本公开的一个实施方案中，将珠子和t细胞一起培养约8天。在另一实施方案中，将珠子和t细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得t细胞的培养时间可以是60天或更长。适合t细胞培养的条件包括可含有增殖和生存所必需的因子的适当培养基(例如，基本必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo15，(lonza))，该因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使t细胞生长和扩充的量的细胞因子的rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15和x-vivo20、optimizer。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％cq2)。已暴露于不同刺激时间的t细胞可展现不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性t细胞群体或抑制性t细胞群体(tc，cd8+)的辅助t细胞群体(th，cd4+)。通过刺激cd3和cd28受体体外扩充t细胞产生t细胞群体，该t细胞群体在约第8-9天之前主要由th细胞组成，而在约第8-9天之后，该t细胞群体包含越来越多的tc细胞群体。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要由th细胞构成的t细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离了tc细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩展到更大程度可能是有益的。进一步地，除了cd4和cd8标志物之外，其它表型标志物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩充过程中该变化可再现。因此，这样的再现性使得能够针对特定目的定制激活的t细胞产物。在一些情况下，将实施方案的免疫效应细胞(例如，t细胞)与活化和增殖细胞(aapc)共培养，以帮助细胞扩充。aapc也可称为人工抗原呈递细胞(aapc)。例如，抗原呈递细胞(apc)可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞疗法产品。在一个方面，aapc可以是转基因k562细胞。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如美国专利6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开wo2007/103009，其各自通过引用并入本文。在实施方案的又一方面，培养转基因car细胞包括在刺激表达car的免疫效应细胞扩充的树突细胞或活化和增殖细胞(aapc)的存在下培养转基因car细胞。在更进一步的方面，aapc包含在aapc表面上表达的car结合抗体或其片段。在其它实施方案中，aapc包含在aapc表面上表达的tcr结合多肽或tcr结合抗体或其片段。在一些情况下，aapc可以包括活化或共刺激t细胞的其它分子。在一些情况下，其它分子可以包括膜结合的cγ细胞因子。在更进一步的方面，aapc被灭活或辐射，或已经过测试并证实不含感染性物质。在更进一步的方面，在aapc的存在下培养转基因car细胞包括在包含可溶性细胞因子如il-15、il-21和/或il-2的培养基中培养转基因car细胞。细胞可以以约10∶1至约1∶10、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(免疫效应细胞比aapc)或其中可导出的任何范围的比值培养。例如，t细胞和aapc的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比值。在一个方面，aapc可以表达cd137l。在其它方面，aapc可以进一步表达cd19、cd64、cd86或mil15。在某些方面，aapc可以表达至少一种抗cd3抗体克隆，例如okt3和/或ucht1。在一个方面，aapc可以被处理(例如，辐射或丝裂霉素c)以消除其生长潜力。在一个方面，aapc可能已经过测试并证实不含感染性物质。用于产生这样的aapc的方法是本领域已知的。在一个方面，将car修饰的t细胞群体与aapc一起培养可以包括以约10∶1至约1∶10、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(t细胞比aapc)或其中可导出的任何范围的比值培养细胞。例如，t细胞和aapc的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比值。在一个方面，培养步骤可以进一步包括用氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)培养。在进一步的方面，培养和/或刺激car-t细胞群体不超过7、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。在一些实施方案中，培养和/或刺激car-t细胞群体至少0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激car-t细胞群体至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激car-t细胞群体至少7、14、21、28、35、42、49、56、63天或更多天。在其它实施方案中，刺激包括car-t细胞与aapc的共培养以促进car阳性t细胞的生长。在另一方面，刺激转基因car细胞群体不超过：1x刺激、2x刺激、3x刺激、4x刺激、5x刺激、5x刺激、6x刺激、7x刺激、8x刺激、9x刺激或10x刺激。在一些情况下，转基因细胞不在aapc的存在下离体培养。在一些具体情况下，实施方案的方法进一步包括在转染和/或培养步骤后富集细胞群体中的表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)。富集可以包括荧光激活细胞分选(facs)和针对car表达细胞的分选。在进一步的方面，针对表达car的细胞的分选包括使用car结合抗体。富集还可以包括cd56+细胞的消耗。在实施方案的又一方面，方法进一步包括冷冻保存转基因car细胞群体的样品。在一些情况下，将aapc与最佳长度的肽一起孵育，该最佳长度允许肽直接结合mhc分子而无需额外处理。或者，细胞可以表达感兴趣的抗原(即，在不依赖mhc的抗原识别的情况下)。此外，在一些情况下，apc可以表达抗体，该抗体与特定car多肽结合或与一般的car多肽结合(例如，通用活化和增殖细胞(uapc))。这样的方法公开于wo/2014/190273中，其通过引用并入本文。除了肽-mhc分子或感兴趣的抗原之外，aapc系统还可包含至少一种外源辅助分子。可以采用任何合适数目的辅助分子和辅助分子的组合。辅助分子可选自诸如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1以前称为b7，并且也称为cd80)，除其它分子外，它们还与t细胞表面上的cd28和/或ctla-4分子结合，从而影响例如t细胞扩增、th1分化、短期t细胞存活和细胞因子分泌，如白介素(il)-2。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋白如选择蛋白、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白质如钙黏着蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白如细胞间粘附分子(icam)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，如icam-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂例示于例如美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中，其通过引用并入本文。选择成为aapc的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内mhci类或ii类分子-肽负载方面存在缺陷，或者是变温的(即，相较于哺乳动物细胞系对温度攻击的敏感性更低)，或具有缺陷和变温性质二者。优选地，选择成为aapc的细胞还缺乏表达被引入细胞中的外源性mhci类或ii类分子和辅助分子组分的至少一种内源性对应物(例如，如上所述的内源性mhci类或ii类分子和/或内源性辅助分子)的能力。此外，aapc优选地保留细胞在其修饰以生成aapc之前所具有的缺陷和变温性质。示例性aapc由与抗原加工(tap)缺陷型细胞系如昆虫细胞系相关的转运蛋白构成或衍生。示例性的变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，如schneider2细胞系(参见例如，schneider1972，美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供了用于schneider2细胞的制备、生长和培养的说明性方法)。在一个实施方案中，还使aapc经历冻融循环。在示例性的冻融循环中，可以通过使容纳aapc的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即干冰)或类似的低温材料接触来冷冻aapc，使得冷冻迅速发生。然后通过将aapc从低温材料中取出并暴露于室温条件下，或者通过促进解冻过程(其中采用温水浴或温暖的手来缩短解冻时间)来解冻冷冻的apc。此外，可以将aapc冷冻并在解冻之前储存一段延长的时间。也可以将冷冻的aapc解冻并随后在进一步使用前冻干。优选地，可能对冻融程序产生不利影响的防腐剂，如二甲基亚砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其它防腐剂不存在于含有经历冻融循环的aapc的培养基中，或例如通过将aapc转移到基本上不含这样的防腐剂的培养基中而基本上去除。在进一步的实施方案中，相对于aapc的异种核酸和内源核酸可以通过交联而灭活，使得在灭活后基本上不发生细胞生长、复制或核酸表达。在一个实施方案中，aapc在外源性mhc和辅助分子表达、这些分子在aapc表面上呈递，以及所呈递的mhc分子负载选定的一种或多种肽之后的某一点处灭活。因此，这样的灭活且负载选定肽的aapc虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选定的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物(如细菌和病毒)的aapc，而基本上不降低aapc的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的aapc功能，同时有助于减轻对使用aapc开发的细胞疗法产品的安全性的担忧。对于与交联和aapc相关的方法，参见例如美国专利申请公开20090017000，其通过引用并入本文。在某些实施方案中，进一步提供了工程化抗原呈递细胞(apc)。例如，如上所述，这样的细胞可用于使免疫效应细胞离体增殖。在进一步的方面，工程化apc本身可以施用于患者，由此在体内刺激免疫效应细胞的扩充。实施方案的工程化apc本身可用作治疗剂。在其它实施方案中，工程化apc可以用作治疗剂，其可以刺激对靶抗原特异的内源性免疫效应细胞的活化和/或增加对靶抗原特异的过继转移免疫效应细胞的活性或持久性。如本文所用的，术语“工程化apc”是指包含至少第一转基因的细胞，其中第一转基因编码hla。这样的工程化apc可以进一步包含用于表达抗原的第二转基因，使得抗原与hla复合呈递在apc表面。在一些方面，工程化apc可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突细胞)。在进一步的方面，工程化apc可以由通常不呈递抗原的细胞类型如t细胞或t细胞祖细胞(称为“t-apc”)产生。因此，在一些方面，实施方案的工程化apc包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(hla)的第二转基因，使得hla与靶抗原的表位复合地在工程化apc的表面上表达。在某些具体方面，在工程化apc中表达的hla是hla-a2。在一些方面，实施方案的工程化apc可以进一步包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激分子可以是共刺激细胞因子，其可以是膜结合的cγ细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是il-15，如膜结合的il-15。在一些进一步的方面，工程化apc可包含经编辑的(删除的)基因。例如，可以编辑抑制基因，如pd-1、lim-3、ctla-4或tcr以减少或消除该基因的表达。实施方案的工程化apc可以进一步包含编码任何感兴趣的靶抗原的转基因。例如，靶抗原可以是感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(taa)。调节表达的方法在一个实施方案中，提供了调节工程化细胞中异源基因表达的方法。提供了编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽、抗原结合多肽和异源基因的多核苷酸。在一些情况下，所述多核苷酸位于一个或多个基因表达盒中，如图1至16中任一个所示。在另一种情况下，通过病毒或非病毒载体将多核苷酸并入工程化细胞中。病毒载体可包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。非病毒载体可包括睡美人转座子。在其它情况下，通过重组酶或基因编辑技术将多核苷酸整合到工程化细胞中。重组酶的实例是如本文所述的丝氨酸重组酶。基因编辑技术的实例可包括crispr或argnonaute系统。在本文中，“crispr系统”的“crispr基因编辑系统”是指任何rna指导的cas蛋白介导的过程，其用于将dna序列的改变靶向至基因组的特定区域。在本文中，“argonaute基因编辑系统”是指任何单链dna指导的argonaute内切核酸酶介导的过程，其用于将dna序列的改变靶向至基因组的特定区域。在一些情况下，所述抗原结合多肽可以是抗原结合多肽或配体结合多肽。例如，抗原结合多肽可以是抗体或其片段、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、重链抗体的可变片段(vhh)、car或工程化tcr。作为另一个实例，配体结合多肽可以是受体。在某些方面，异源基因是细胞因子。该细胞因子可以是il-2、il-15、il-12、il-21或il-15与il-15r(mbil-15)的融合体。在某些情况下，该细胞因子是il-12。例如，il-12是单链il-12(scil-12)、蛋白酶敏感的il-12、去稳定化的il-12、膜结合的il-12、插入的il-12。在一些情况下，异源基因处于诱导型启动子的控制之下。例如，诱导型启动子是用于基因转录的基因开关配体诱导型启动子。在某些情况下，所述细胞是工程化细胞。在本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)。在一些情况下，工程化细胞可以是工程化的免疫效应细胞。本文提供了调节异源基因表达的方法，其中该异源基因处于配体诱导型启动子的控制下。在一些情况下，该方法在不存在配体的情况下导致异源基因表达的基础水平低或没有。在一种情况下，在用配体诱导异源基因的表达之前，活化工程化细胞。在另一种情况下，通过将细胞暴露于抗原来活化工程化细胞。该抗原可以是被工程化细胞表达的抗原结合多肽识别的抗原。该抗原可以是肿瘤抗原或传染病抗原。工程化细胞可以暴露于抗原至少：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在一些情况下，工程化细胞可以暴露于抗原至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时。在另一种情况下，已经用包含基因开关多肽和目的可诱导基因的载体转导的免疫效应细胞群体(在此在图2a-2d、图3、图19a-19b、图20a、图22、图24a-24d和图25a-25b中描述)用实施方案的工程化aapc培养和/或刺激至少1x刺激、2x刺激、3x刺激或4x刺激。在一些情况下，工程化aapc包含被工程化细胞上表达的结合多肽识别的抗原或配体。在最后一次刺激之后，使细胞休息，然后输注到患者体内。然后给患者施用适当剂量的用于诱导型基因开关调节的配体以激活并表达目的基因。在一个方面，该配体是veledimex。另一方面，veledimex以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。定点照护在本公开的一个实施方案中，本文所述的免疫效应细胞在照护点场所处被修饰。在一些情况下，照护点场所位于需要治疗的受试者附近的医院或设施(例如，医疗设施)。受试者经历单采血液成分术，并且获得的外周血单核细胞(pbmc)可以例如通过淘洗来富集。在一种情况下，使用含有人血清白蛋白的缓冲溶液进行淘洗过程。可通过本文所述的选择方法分离免疫效应细胞，如t细胞。在一种情况下，t细胞的选择方法包括对t细胞上的cd3和cd8具有特异性的珠子。在一种情况下，该珠子可以是顺磁珠子。收获的免疫效应细胞可以在修饰前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。免疫效应细胞在输注前可以解冻长达24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。解冻的细胞在修饰前可以置于细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(fbs)的细胞培养缓冲液(例如rpmi)中，或置于包含il-2和il-21的缓冲液中。另一方面，可以立即修饰收获的免疫效应细胞而不需要冷冻保存。在一些情况下，通过将嵌合受体、一种或多种细胞标签和/或细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在一些情况下，免疫效应细胞的来源可包括同种异体和自体来源。在一种情况下，免疫效应细胞可以是t细胞或nk细胞。在一种情况下，嵌合受体可以是car或tcr。在另一种情况下，细胞因子可以是mbil-15。在一种情况下，该mbil-15是seqidno：15，或其变体或片段。在又一种情况下，mbil-15的表达由本文所述的配体诱导型基因开关表达系统调节。例如，可以将诸如veledimex的配体递送至受试者以调节mbil-15的表达。另一方面，以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供veledimex。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。在一个实施方案中，在输注经修饰的免疫效应细胞之前0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天将veledimex施用于受试者。在另一个实施方案中，大约每12小时一次、大约每24小时一次、大约每36小时一次或大约每48小时一次向受试者施用veledimex，在输注经修饰的免疫效应细胞后持续一段有效的时间。在一个实施方案中，施用veledimex的有效时间段为约：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在其它实施方案中，可以在休息期之后、休药期之后或当受试者经历复发时再次施用veledimex。在某些情况下，当观察到对受试者的不利影响或不需要治疗时，可以例如通过西妥昔单抗激活细胞标签，以用于条件性体内消融包含本文所述的细胞标签如截短的表皮生长因子受体标签的经修饰的免疫效应细胞。在一些实施方案中，此类免疫效应细胞通过电穿孔用如图2a-2d、图3、图19a-19b、图20a、图22、图24a-24d和图25a-25b所述的构建体修饰。在一种情况下，用电穿孔仪如lonza的nucleofectortm电穿孔仪进行电穿孔。在其它实施方案中，包含上述构建体的载体是非病毒或病毒载体。在一种情况下，非病毒载体包括睡美人转座子-转座酶系统。在一种情况下，使用特定序列对免疫效应细胞进行电穿孔。例如，免疫效应细胞可以用一个转座子进行电穿孔，然后用编码转座酶的dna，接着用第二个转座子进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以同时用所有转座子和转座酶进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以用转座酶进行电穿孔，然后用两个转座子或一次一个转座子进行电穿孔。在进行连续电穿孔时，免疫效应细胞可以在下一个电穿孔步骤之前休息一段时间。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历增殖和激活步骤。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历孵育或培养步骤(例如离体增殖)。在某些情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于包含il-2和il21的缓冲液中。在其它情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于或静置在细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(fbs)的细胞培养缓冲液(例如rpmi)中。在输注之前，可以收获经修饰的免疫效应细胞，洗涤，并在盐水缓冲液中配制以准备输注到受试者体内。在一种情况下，受试者在输注前已进行淋巴细胞消耗。在其它情况下，不需要淋巴细胞消耗，而是将经修饰的免疫效应细胞快速输注到受试者体内。示例性淋巴细胞消耗方案在以下表4和表5中列出：表4.方案1d-6加入/iv补水d-5氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2d-4氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2d-3氟达拉滨25mg/m2iv，环磷酰胺250mg/m2d-2休息d-1休息d0t细胞输注表5.方案2d-6加入/iv补水d-5氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2d-4氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2d-3氟达拉滨30mg/m2iv，环磷酰胺500mg/m2d-2休息d-1休息d0t细胞输注在另一种情况下，受试者经历最小的淋巴细胞消耗。本文中的最小的淋巴细胞消耗是指减少的淋巴细胞消耗方案，使得受试者可以在淋巴细胞消耗方案后1天、2天或3天内输注。在一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可包括较低剂量的氟达拉滨和/或环磷酰胺。在另一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可以包括缩短的淋巴细胞消化期，例如1天或2天。在一个实施方案中，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述细胞中，然后在至少0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50小时内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中，然后在0天、＜1天、＜2天、＜3天、＜4天、＜5天、＜6天或＜7天内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在另一个实施方案中，经修饰的效应细胞是car+或tcr+和cd3+细胞。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞104但≤105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞105但≤106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞106但≤107个经修饰的效应细胞/kg。在其它实施方案中，刺激工程化细胞的增殖和/或存活的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在一种情况下，体外增殖工程化细胞的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在另一个实施方案中，增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一些情况下，转座子编码嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一些情况下，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在另一个实施方案中，治疗患有实体瘤的受试者的方法包括从受试者获得细胞样品，用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该样品的细胞，并将工程化细胞群体施用于该受试者。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在一些情况下，所述一个或多个转座子编码嵌合抗原受体(car)或tcr、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将dna有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶。在一些情况下，基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的dna结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，通过电穿孔转染细胞。在一些情况下，编码基因开关多肽的多核苷酸由启动子调节。在一些情况下，该启动子是组织特异性启动子或ef1a启动子或其功能变体。在一些情况下，该组织特异性启动子包含t细胞特异性应答元件或nfat应答元件。在一些情况下，该细胞因子包括il-1、il-2、il-15、il-12、il-21、il-15与il-15rα或il-15变体的融合体中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子是分泌形式。在一些情况下，该细胞因子是膜结合形式。在一些情况下，所述细胞是nk细胞、nkt细胞、t细胞或t细胞祖细胞。在一些情况下，将细胞施用于受试者(例如通过向受试者输注工程化细胞)。在一些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体(例如veledimex)以诱导细胞因子的表达。在一些情况下，所述car能够结合cd19、cd33、bcma、cd44、α-叶酸受体、caix、cd30、ror1、cea、egp-2、egp-40、her2、her3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、il-13r-a2、kdr、edb-f、间皮素、cd22、egfr、muc-1、mage-a1、muc-16、h5t4、psma、tag-72、egfrviii、cd123和vegf-r2中的至少一种。在一些情况下，转座酶是鲑鱼型tc1样转座酶。在一些情况下，转座酶是sb11或sb100x转座酶。在一些情况下，细胞标签包含her1截短变体和cd20截短变体中的至少一种。药物组合物和剂量在一些实施方案中，本文公开了用于在受试者中施用的包含本文公开的多核苷酸或多肽的组合物。在一些情况下是编码本文公开的多核苷酸或多肽并且任选地含有细胞因子和/或另外的治疗剂的经修饰的效应细胞组合物。在一些情况下，本文还包括编码用于调节嵌合抗原受体的表达的基因开关多肽的载体，以用于效应细胞的修饰。在一些情况下，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制经修饰的效应细胞或编码基因开关多肽和嵌合抗原受体的载体的药物组合物，该载剂包括有助于将活性化合物加工成可药用的制剂的赋形剂和助剂。适当的配方取决于选定的结药途径。本文所述药物组合物的综述可见于例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第十九版(easton，pa.：mackpublishingcompany，1995)；hoover，johne.，remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pennsylvania1975；liberman，h.a.和lachman，l.，编著，pharmaceuticaldosageforms，marceldecker，newyork，n.y.，1980；以及pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，第七版(lippincottwilliams&wilkins1999)。任选地以常规方式制备药物组合物，仅举例来说，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩方法。在某些实施方案中，组合物还可包含一种或多种ph调节剂或缓冲剂，包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。所包含的这类酸、碱和缓冲液的量是将组合物的ph维持在可接受范围内所需的量。在其它实施方案中，组合物还可包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这类盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。本文所述的药物组合物通过任何合适的给药途径施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、颊部、舌下或直肠给药途径。在一些情况下，配制药物组合物用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)给药。将本文所述的药物组合物配制成任何合适的剂型，包括但不限于用于由待治疗个体口服摄取的水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，固体口服剂型、气雾剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂，以及立即和控制释放混合型制剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制成胶囊。在一些实施方案中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于iv给药)。在一些情况下，将药物组合物配制成输注剂。在一些情况下，将药物组合物配制成注射剂。本文所述的药物固体剂型任选地包含本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，如相容的载剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、湿润剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。在其它方面，使用标准包衣程序，如remington′spharmaceuticalsciences，第20版(2000)中所述的标准包衣程序，在组合物周围提供膜包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且对一些或所有颗粒进行包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且将一些或所有颗粒制成微胶囊。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且一些或所有颗粒未制成微胶囊且未包衣。在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，如硼酸苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定化的二氧化氯；以及季铵化合物，如苯扎氯铵、十六烷基三甲基澳化铵和西吡氯铵。如本文所提及的“增殖性疾病”是指统一的概念，即细胞的过度增殖和细胞基质的更新对包括癌症在内的若干疾病的发病机理有显著贡献。如本文所用的“患者”或“受试者”是指被诊断为患有或怀疑患有或发展为生理状况，例如癌症或自身免疫性病况或感染的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，术语“患者”是指具有高于平均的发生癌症可能性的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其它可以受益于本文公开的疗法的哺乳动物。示例性的人类患者可以是男性和/或女性。“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文中是指被诊断为患有或怀疑患有疾病或病症，例如但不限于增殖性疾病如癌症的患者。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其它情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在一些情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆道癌(即胆管癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发灶不明癌(cup)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌；或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，白血病可以是例如急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)和慢性髓样白血病(cml)。“施用”在本文中是指向患者提供本公开的组合物。作为实例而非限制的，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射进行。可以采用一种或多种这样的途径。肠胃外施用可以是，例如，通过推注或通过随时间平缓灌注。备选地地或同时地，可通过口服途径施用。此外，还可以通过手术沉积细胞团或细胞丸或放置医疗装置来施用。在一个实施方案中，本公开的组合物可包含表达本文所述核酸序列的工程化细胞或宿主细胞，或包含至少一种本文所述核酸序列的载体，其量可有效治疗或预防增殖性病症。药物组合物可包含本文所述的靶细胞群体，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。如本文所用的，术语“治疗”、“处理”及其语法等同语是指获得所需的药理学和/或生理学效果。在实施方案中，该效果是治疗性的，即该效果部分或完全地治愈疾病和/或由该疾病引起的不良症状。为此，本文所述的方法包括施用“治疗有效量”的组合物，该组合物包含表达本文所述的核酸序列的宿主细胞，或包含本文所述的核酸序列的载体。术语“治疗有效量”、“治疗量”、“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或其语法等同语是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及本文所述组合物在个体中引发所需反应的能力而变化。待施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异的情况下确定。或者，向患者或受试者施用一种或多种本文所述组合物的药理学和/或生理学效果可以是“预防性的”，即该效果完全或部分地预防疾病或其症状。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需预防结果(例如，疾病发作的预防)的量。“消泡剂”减少加工过程中的起泡，这种起泡可以造成水性分散体的凝聚、成品膜中的气泡或通常受损的加工。示例性的消泡剂包括硅乳剂或失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitansesquoleate)。“抗氧化剂”包括例如丁羟甲苯(bht)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方案中，如需要，抗氧化剂增强化学稳定性。本文所述的制剂可受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基的化合物和其它普通稳定剂。这类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油；(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v一硫代甘油，(d)约1mm至约10mmedta，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(1)多硫酸戊聚糖酯和其它类肝素类，(m)二价阳离子，如镁和锌；或(n)其组合。“粘合剂”赋予粘结性质，并且包括例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如)、乙基纤维素(例如)和微晶纤维素(例如)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯聚吡咯烷酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖，如蔗糖(例如)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇(例如)和乳糖；天然或合成树胶，如阿拉伯胶、黄蓍胶、茄替胶、车前籽胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如cl、cl、xl-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。“载剂”或“载剂材料”包括任何在制药学中常用的赋形剂，并且应根据与本文公开的化合物如依鲁替尼和抗癌剂化合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择。示例性的载剂材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载剂材料可包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第十九版(easton，pa.：mackpublishingcompany，1995)；hoover，johne.，remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pennsylvania1975；liberman，h.a.和lachman，l.编著，pharmaceuticaldosageforms，marceldecker，newyork，n.y.，1980；以及pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，第七版(lippincottwilliams&wilkins1999)。“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或混合方法控制药物的扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些药剂还有助于包被或侵蚀基质的有效性。示例性扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、60或80、peg、聚乙烯吡咯烷酮(pvp；商品名为)和基于碳水化合物的分散剂，如羟丙基纤维素(例如，hpc、hpc-sl和hpc-l)、羟丙基甲基纤维素(例如，hpmck100、hpmck4m、hpmck15m和hpmck100m)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(hpmcas)、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(pva)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚聚合物与环氧乙烷和甲醛(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，和它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙胺(例如，tetronic也称为poloxamine它是由将环氧丙烷和环氧乙烷依次添加至乙二胺而得到的四官能嵌段共聚物(basfcorporation，parsippany，n.j.))、聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s-630)、聚乙二醇例如可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、树胶如黄蓍树胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素制品如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(pva)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。一种或多种蚀解促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可以在本发明的组合物中使用。术语“稀释剂”是指用来在递送前稀释感兴趣的化合物的化学化合物。稀释剂也可用来稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也可提供ph控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如(amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，peg-4000)或甲氧基聚乙二醇如carbowaxtm，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如syloidtm，淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。“增塑剂”是用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如peg300、peg400、peg600、peg1450、peg3350和peg800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。在一些实施方案中，增塑剂也可用作分散剂或润湿剂。“增溶剂”包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素etpgs、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、n-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素etpgs、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如(basf)等化合物。一些其它表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。“粘度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素etpgs、铵盐等化合物。药盒/制品在某些实施方案中，本文公开了与一种或多种本文所述的方法一起使用的药盒和制品。这样的药盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。例如，容器包含编码基因开关多肽以用于本文所述car的调节表达的car-t细胞(例如，cd19特异性car-t细胞)，并且任选地还包含本文公开的细胞因子和/或化疗剂。这样的药盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。药盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。在一些实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其它字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。实施例提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。实施例1.sb基因开关系统对pbmc的核转染通过核转染，将表达sb转座子系统即sb11、膜结合的il-15(mbil-15)和嵌合抗原受体(car)的各种dna质粒转染至外周血单核细胞(pbmc)，以重定向t细胞特异性(图1)。在第0天，将2000万个pbmc重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶(sb11)混合的100μlamaxahumantcellnucleofector溶液(目录号vpa-1002；lonza，basel，switzerland)中，并进行电穿孔。次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量car表达。cart细胞用γ-照射的(100gy)或丝裂霉素c处理的aapc以1∶1的比例刺激。使用的aapc细胞是表达cd19抗原的k562-aapc。培养物仅针对第一轮刺激补充il-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人il-2(50iu/ml)和il-21(30ng/ml)(peprotech)。在每个刺激周期结束时对t细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。使用蛋白l或识别cd19特异性car的抗独特型抗体，通过多参数流式细胞术对培养物进行car表达的表型分型。还密切监测培养物中nk细胞的生长(定义为cd3negcd56+群体)，并且当百分比超过总细胞群体的10％时，使用cd56特异性磁珠(stemcelltechnologies和/或miltenyibiotec)根据制造商的说明从cart细胞培养物中移出。实施例2.on-offsb基因开关系统的流式细胞术分析从pb或ucb衍生的单核细胞(mnc)产生cd19特异性t细胞，其中使用sb转座引入car，然后加入aapc，以car依赖性方式数值扩充t细胞。对于用来评估各种标志物和目的基因的表达的流式细胞术分析，将细胞轻轻地重悬浮，并使用台盼蓝排除法用countess仪器测量细胞数和活力。还记录细胞直径大小。对每个样品在10℃下以330xg4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与hbss中的10％人ab血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物在hbss+0.1％bsa+2mmedta中包括一种或多种cd4(克隆rpa-t4)、cd8(克隆sk1)、cd3(克隆ucht1)、cd56、cd19特异性car(抗独特型抗体)、il-15和il-15ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关荧光-1/同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用facs缓冲液(fibss+0.5％bsa+2mmedta)洗涤样品，并用fixableviabilitydye(ebiosciences)在冰上染色30min。将细胞用facs缓冲液洗涤，然后用4％低聚甲醛溶液(bdcytofix；bdbiosciences)固定。所有样品在lsrii流式细胞仪、fortessax-20流式细胞仪(bdbiosciences)或iquescreenerplus(intellicyt)上运行，并使用flowjov10(treestar，ashland，or)或iquescreener软件分析数据。为了使用配体(veledimex)诱导表达，以1×106个细胞/ml收获aapc刺激的car-t细胞。向培养物中加入veledimex或dmso(以使dmso浓度在两种培养物中保持恒定)。veledimex的使用浓度为20nm、50nm、100nm或如所述。然后将细胞在37℃下在veledimex或dmso的存在下培养2-3天。培养2-3天后，对每个样品在10℃下以330×g4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与hbss中的10％人ab血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物包括在hbss+0.1％bsa+2mmedta中包括一种或多种cd4(克隆rpa-t4)、cd8(克隆sk1)、cd3(克隆ucht1)、cd56、cd19特异性car(抗独特型抗体)、il-15和il-15ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用facs缓冲液(fibss+0.5％bsa+2mmedta)洗涤样品，并用fixableviabilitydye(ebiosciences)在冰上染色30min。将细胞用facs缓冲液洗涤，并用4％低聚甲醛溶液(bdcytofix；bdbiosciences)固定。所有样品在lsrii流式细胞仪、fortessax-20流式细胞仪(bdbiosciences)或iquescreenerplus(intellicyt)上运行，并使用flowjov10(treestar，ashland，or)或iquescreener软件分析数据。对于veledimexon-off-on实验，首先将veledimex以所述浓度(一般在20-100nm之间)加入细胞培养物中2-3天。收获等份细胞，并通过如上所述的流式细胞术分析各种蛋白质的表达(on)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并重悬浮于不含veledimex的完全培养基中并培养最多5天。收获等份细胞，并如上所述通过流式细胞术在提及的时间分析表达(off)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并用含有veledimex的完全培养基重悬浮，以使靶基因的表达重新开始。培养2-3天后，收获等份细胞，并通过流式细胞术分析表达。实施例3.存活实验通过核转染，将编码rts-膜结合的il-15(rts-mbil-15)、cd19特异性嵌合抗原受体(cd19car)的多个睡美人转座子dna质粒(设计9，图2)与编码睡美人转座酶sb11的质粒dna一起转染到外周血单核细胞(pbmc)中(图1)。在第0天，将2000万个pbmc重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶混合的100μlamaxahumantcellnucleofector溶液(目录号vpa-1002；lonza，basel，switzerland)中，并核转染到细胞中。次日(第1天)对细胞进行计数，并使用流式细胞术测量car表达。细胞用γ-照射的(100gy)或丝裂霉素c处理的在其表面上表达cd19的基于k562的aapc以1∶1的比例刺激。培养物仅针对第一轮刺激补充il-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人il-2(50iu/ml)和il-21(30ng/ml)(peprotech)。在每个刺激周期结束时对t细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。通过多参数流式细胞术，利用抗独特型抗体染色检测cd19特异性car-t细胞，对培养物进行car表达的表型分型。还密切监测培养物中nk细胞的生长(定义为cd3negcd56+群体)，并且当百分比超过总细胞群体的10％时，使用针对cd56的磁珠(stemcelltechnologies和/或miltenyibiotec)根据制造商的说明从cart细胞培养物中移出。为了测量从培养基中撤除细胞因子(il-2和il-21)后共表达rts-mbil-15的cd19特异性car-t细胞的持久性，收获car-t细胞，并以1×106个细胞/ml的浓度接种于6孔板中含有或不含il-2和il-21的完全rpmi培养基中。将veledimex(50nm终浓度)或dmso对照加入培养基中。每2-3天更换培养基，收获小等份的细胞用于流动分析。进行流动分析以测量mbil-15表达，并在培养基中存在或不存在细胞因子的情况下测量培养物中活细胞的百分比。在存在和不存在细胞因子的情况下，car-t细胞的存活显示于图12中。在培养物中不存在细胞因子的情况下，当加入veledimex以诱导mbil-15表达时，观察到car-t细胞的存活率提高。当未添加veledimex(未诱导mbil-15表达)时，细胞在离体培养物中不能存活。实施例4.western印迹分析用睡美人系统的质粒对pbmc进行核转染，以表达在组成型启动子下的cd19特异性car(单独的cd19car)，或均在组成型启动子下的cd19特异性car和mbll-15(cd19car+组成型-mbil-15)，或在组成型启动子下的cd19特异性car和rts-mbil-15(cd19car+rts-mbil-15)。如实施例1所述，在aapc的存在下培养经核转染的细胞。经过四轮刺激后，细胞在不存在(仅cd19car、cd19car+组成型-mbil-15和cd19car+rts-mbil-15)或存在(cd19car+rts-mbil-15)veledimex的情况下培养2-3天。制备细胞裂解物以供western印迹分析。nupage10％bis-tris凝胶的每个泳道加载大约10μg裂解物。使用(lifetechnologies)半干转移装置将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。使用在pbs+吐温-20(pbst；1xpbs+0.05％吐温-20)溶液中的5％(w/v)奶粉溶液封闭膜，用山羊抗人il-15(r&dsystems)第一抗体和兔抗山羊igghrp(kpllaboratories)第二抗体染色。使用用于增强化学发光(ecl)检测的supersignaltmwestpicochemiluminescentsubstrate(thermofisherscientific)。使用digitaldarkroom软件和alpha软件(proteinsimple)在fluorchemtmeimager(proteinsimple，sanjose，ca)系统上捕获western印迹的图像。图14显示了了western印迹的图像。当不存在veledimex时(cd19car+rts-mbil-15)，通过western印迹分析未检测到mbil-15表达，但是当向培养物中添加veledimex时观察到mbil-15的强表达。在仅cd19car的阴性对照中，未观察到mbil-15表达。在cd19car+组成型-mbil-15阳性对照中，检测到mbil-15的表达。实施例5.t细胞活化和mbil-15转基因表达的配体特异性控制将睡美人转座子设计用于稳定表达cd19特异性car、细胞标签以及基因开关控制的mbil-15。一种或两种基因开关组分(例如，vp16/rxr和gal4/ecr)的表达在t细胞活化特异性启动子的控制下进行。在该实施例中，利用由与最小il-2启动子融合的6xnfat应答元件产生的t细胞活化依赖性启动子(nfat6-il2启动子)来驱动基因开关组分-vp16-rxr和/或gal4-ecr融合蛋白的表达，以用于mbil-15的条件性表达。当基因开关的组分处于nfat6-il2启动子的控制下时，mbil-15的表达需要满足两个条件：1)t细胞被活化；和2)存在激活物配体——veledimex。图20a所示的sb转座子构建体组合与sb11转座酶一起在供体t细胞中转染。在第0天，将1000-2000万个t细胞重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶(sb11)混合的100μlamaxahumantcellnucleofector溶液(目录号vpa-1002；lonza，basel，switzerland)中，并进行电穿孔。次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量car表达。cart细胞通过每7-10天用γ-照射的(100gy)或丝裂霉素c处理的aapc以1∶1的比例连续数轮刺激多达4个循环而离体选择性扩充。使用的aapc细胞是表达cd19抗原的k562-aapc。培养物仅针对第一轮刺激补充il-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人il-2(50iu/ml)和il-21(30ng/ml)(peprotech)。对于用来评估各种标志物和目的基因的表达的流式细胞术分析，将细胞轻轻地重悬浮，并使用台盼蓝排除法用countess仪器测量细胞数和活力。还记录细胞直径大小。对每个样品在10℃下以330xg4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与hbss中的10％人ab血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物在hbss+0.1％bsa+2mmedta中包括一种或多种cd4、cd8、cd3、cd56、cd19特异性car(抗独特型抗体)、il-15和/或il-15ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关荧光-1/同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用facs缓冲液(fibss+0.5％bsa+2mmedta)洗涤样品，并用fixableviabilitydye(ebiosciences)在冰上染色30min。将细胞用facs缓冲液洗涤，然后用4％低聚甲醛溶液(bdcytofix；bdbiosciences)固定。所有样品在lsrii流式细胞仪、fortessax-20流式细胞仪(bdbiosciences)或iquescreenerplus(intellicyt)上运行，并使用flowjov10(treestar，ashland，or)或iquescreener软件分析数据。为了评估t细胞活化对mbil-15表达的影响，在最后一次aapc刺激后将细胞保持在培养基中至少7天以测试基线(无刺激)表达水平。在用veledimex或dmso处理之前，使用不同剂量的cona(1或5μg/ml)活化t细胞48小时或用pma/离子霉素活化t细胞24小时。收获未活化的或活化的car-t细胞，并向培养物中加入100nmveledimex或dmso(以使dmso浓度在两种培养物中保持恒定)。然后在veledimex或dmso的存在下将细胞在37℃下培养至少24小时，然后进行流式细胞术分析以测量转基因表达。在静息t细胞(图20b)或存在或不存在veledimex时的活化t细胞(图20c：cona1μg/ml；cona5μg/ml：图20d，pma/离子霉素：图20e)中对car和mbil-15的表达进行定量。图20b显示，在不存在t细胞活化的情况下，仅有携带用于在组成型启动子下表达基因开关组分(例如vp16/rxr和ga14/ecr)的转座子的car-t细胞能够在向培养物中加入veledimex时表达mbil-15。如图20c至20e所示，携带用于在nfat6-il-2启动子下表达一种或多种基因开关组分的转座子(构建体#3、4和6)的car-t细胞在向培养物中加入veledimex时表现出mbil-15的表达，显示出car-t细胞诱导型表达mbil-15必须满足两个条件。此外，在固定浓度的veledimex的存在下，mbil-15表达水平随着t细胞活化水平的增加而增加(图20c和图20d)。对于所有测试的构建体组合，在不存在veledimex的情况下，通过流式细胞术检测到极低水平的mbil-15表达。与这些配体诱导型开关系统的设计一致，只有car+t细胞能够在veledimex的存在下诱导mbil-15。实施例6.使用基因开关系统的il-12表达睡美人转座子如图22所示设计，以稳定表达egfrviii特异性car、细胞标签和rts-il-12。如前所述，将转座子质粒在几个供体t细胞中电穿孔。egfrviii-car-t细胞通过每7-10天在补充有il-2和il-21的培养基中用γ-照射的或丝裂霉素c处理的充当“饲养细胞”的aapc以1∶1的比例连续数轮刺激多达4个循环而离体选择性扩充。使用的aapc细胞是表达egfrviii抗原的k562-aapc。图26描绘了在car+t细胞离体选择性扩增时，来自多个供体的t细胞中的car表达。veledimexon-off循环实验：对于每个on-off循环，首先将veledimex以先前提到的浓度(一般在20-100nm之间)加入(on)至细胞培养物中2-3天。收获等份细胞，并在指定的时间点通过流式细胞术和/或elisa分析各种蛋白质的表达(on)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并重悬浮于不含veledimex的完全培养基中(off)并培养最多5天。收获等份细胞，并如上所述通过流式细胞术和/或elisa提及的时间分析表达(off)。通过重复该过程，可以用剩余细胞培养物再次重复veledimexon-off循环。为了测定egfrviii-car-t细胞中的il-12诱导，在含有il-21的培养基中，在aapc的存在下，用dmso(对照)或veledemix处理核转染后24小时的pant细胞。在核转染后48小时后，通过elisa分析培养上清液的il-12水平。图27显示，用veledimex处理诱导了t细胞的il-12表达，所述t细胞用sb转座子转染以共表达car和rts-il-12。然而，缺乏rts-il-12的car-t细胞未能在培养上清液中产生il-12。用dmso对照处理显示il-12诱导的低背景水平。此外，在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下评估rts-il-12/car-t细胞产生诱导型il-12的能力。通过用egfrviii+aapc连续三轮刺激来离体扩充egfrviii-car/rts-il-12t细胞。在不存在(图28a)或存在(图28b)egfrviii+aapc的情况下，将veledimex(100nm)或dmso(对照)加入到egfrviii-car/rts-il-12t细胞的培养物中48小时，之后分析培养上清液中的il-12水平。如图28a和图28b所示，egfrviii-car/rts-il-12t细胞表达veledimex诱导的il-12的能力在egfrviii抗原特异性刺激的存在下大大增强，在不存在veledimex的情况下具有低背景水平的il-12表达。实施例7.使用rts基因开关系统在egfrviiicar表达细胞中的veledimexon-off循环通过与aapc共培养，在存在和不存在抗原特异性t细胞活化的情况下，在体外测定了重复处理和撤除veledimex对携带诱导型il-12基因的egfrviii-car-t细胞的影响。在配体处理的第一个循环(on-off)中，通过用egfrviii+aapc连续四轮刺激而离体扩充的car-t细胞(106/m1)用dmso或veledimex处理，并在含有il-21和il-2的培养基中在存在或不存在aapc的情况下培养。处理后48小时，彻底洗涤细胞以除去配体，并在新培养容器中在含有il-21和il-2的培养基中培养5天。然后分析处理后24-120小时收获的培养上清液中il-12和ifnγ的表达。在配体处理的第二个循环(on-off)中，在撤除veledimex(在循环1中)后5天收集来自在循环1中在aapc的存在下用dmso或veledimex处理的培养物的car-t细胞，并在存在或不存在通过与aapc共培养发生抗原特异性t细胞活化的情况下用dmso或veledimex进行第二循环的配体处理。处理后48小时，彻底洗涤细胞以除去配体，并在新培养容器中在含有il-21加il-2的培养基中培养5天。然后分析在处理后24-120小时收获的培养上清液中il-12和ifnγ的表达。图29a显示，在也携带诱导型il-12构建体(xon-61或xon-62；seqidno135或136)的egfrviii-car-t细胞中用veledimex处理导致相对于用dmso处理，在处理后48小时的培养上清液中的il-12表达增加。与不存在抗原特异性刺激相比，在aapc介导的抗原特异性刺激的存在下，il-12诱导水平增强。在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下，在没有veledimex的情况下，观察到非常低的il-12表达背景水平。不含诱导型il-12的egfrviii-car-t细胞在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下未能表达任何il-12。撤除veledimex对il-12表达的影响显示在图30a(在不存在aapc的情况下培养的细胞)和图30b(在aapc的存在下培养的细胞)中。在存在和不存在aapc介导的抗原特异性刺激的情况下，在处理后48小时撤除veledimex均导致il-12表达减少。与存在抗原特异性刺激(图30b)相比，在不存在抗原特异性刺激的情况下，il-12诱导水平显著降低(图30a)。但是，在撤除veledimex后，il-12的水平逐渐降低回基线水平，表现出对诱导型基因表达的严格控制。图31a和图31b显示了在循环1期间撤除试剂后，在采用veledimex或dmso的第2循环期间，配体处理后48小时的培养上清液中的il-12诱导水平。在循环1中在表达egfrviii的aapc的存在下培养的dmso或veledimex处理的细胞，在循环2中在存在或不存在egfrviii+aapc的情况下用veledimex(或dmso)处理。结果显示，相对于在循环1期间用dmso和egfrviii+aapc处理的细胞(图31a)，当在循环1期间用veledimex和egfrviii+-aapc处理时(图31b)，在循环2中用veledimex和egfrviii+aapc处理的细胞显示出增加的il-12诱导。在不存在veledimex的情况下，再次观察到非常低的il-12表达背景水平。用veledimex处理两个循环后rts-il-12表达的动力学在图32a中捕获。如上所述，通过两个循环的配体处理，评价携带诱导型il-12构建体(xon-61或xon-62；seqidno135或136)的egfrviii-car-t细胞在存在或不存在veledimex的情况下诱导il-12表达的能力。设计本实施例中的配体诱导型基因开关载体，使得只有表达两种转座子的细胞才能进行基因开关控制的il-12表达。在配体处理的循环1开始之前，通过流式细胞术在t细胞中对egfrviiicar的表达进行定量，如图34b所示。细胞在cd3上门控。如图32a所示，通过在延长的培养期间添加或撤除激活物配体veledimex，可以反复打开和关闭这些car-t细胞的il-12表达。il-12表达在撤除veledimex后降至基线水平，并且在加入veledimex后可以重新开始。该数据是来自一个供体的代表性数据。图33显示了用veledimex处理两个循环后rts-il-12表达的动力学的另一个实例。如上所述，通过两个循环的配体处理，评价携带诱导型il-12构建体(xon-61或xon-62；seqidno135或136)的egfrviii-car-t细胞在存在或不存在veledimex的情况下诱导il-12表达的能力。在这种情况下，在egfrviii+aapc的存在下进行第一个处理循环，并在不存在egfrviii+aapc的情况下进行第二个循环。与先前的发现一致，veledimex可以在延长的培养期间经反复处理和撤除来调节egfrviii-car-t细胞的il-12表达。在循环2期间去除aapc介导的egfrviii特异性刺激导致il-12水平的相应降低。该数据是来自第二个供体的代表性数据。实施例8.veledimex剂量响应通过用egfrviii+aapcs连续三轮刺激来离体扩充具有或不具有rts-il-12的egfrviii-cart细胞。然后用从0nm(dmso对照)到100nm的不同剂量的veledimex处理t细胞。在veledimex处理后48小时，收获培养上清液，并通过elisa分析il-12水平。所有组中的egfrviii-car表达均用流式细胞术来确认，并且随着剂量逐渐增加的veledimex(数据未示出)而稳定，如在组成型启动子控制下的car表达所预期的那样。结果显示在图34中。结果显示，egfrviii-car/rts-il-12t细胞以veledimex剂量依赖性方式产生il-12。与缺乏细胞标签表达的细胞相比，在用除了car和il-12之外还表达细胞标签的转座子转染的细胞中，对于给定的veledimex浓度观察到较低的il-12表达水平。不具有rts-il-12的egfrviii-car-t细胞不能表达il-12。实施例9.egfrviii-car-t细胞对egfrviii+靶细胞的特异性细胞毒性测试了表达egfrviii-car的t细胞响应于egfrvlii+靶细胞的能力。通过用egfrvlii+aapc连续四轮刺激来离体扩充具有或不具有rts-il-12的egfrviii-cart细胞。将这些效应egfrviii-car-t细胞在含有2％fbs和l-谷氨酰胺的rpmi中静置48h，然后在不存在veledimex的情况下与egfrviii+和egfrviiineg靶细胞以1∶1的效应细胞：靶细胞之比共培养。培养后24h收集培养上清液，并分析ifnγ作为egfrviii-car-t细胞的特异性的功能读数。图35显示了在与靶细胞共培养后24h，car-t细胞的egfrviii抗原特异性ifnγ产生。与单独的egfrviiinegel4细胞系或效应car-t细胞共培养不导致ifnγ表达。图36a显示了在与表达egfrviii的胶质母细胞瘤靶细胞共培养(无veledimex)后24h，培养上清液中的ifnγ。结果显示，egfrviii+胶质母细胞瘤靶细胞(u251mg-egfrviii-fluc-gfp和u87mg-egfrviii-fluc-gfp)诱导egfrviii-cart细胞的ifnγ分泌，而单独的egfrviiineg靶细胞(u251mg、u251mg-egfrviii-fluc-gfp、u87mg和u87mg-fluc-gfp)或效应细胞不能诱导ifnγ分泌。在2小时铕释放试验中检测egfrvii-car-t细胞对egfrviii+和egfrviiineg靶细胞的细胞毒性。使用delfiabatda试剂(delfiaeutda细胞毒性试验；perkinelmer)标记靶细胞系。将egfrviii-car-t效应(e)细胞与标记的靶(t)细胞以3∶1、1∶1或0.3∶1的(e∶t)比在rpmi-1640+5％热灭活的fbs中共培养。2小时后，收获来自共培养物的上清液，并加入delfia铕试剂进行显色，并在时间分辨荧光仪器上读数以测量靶细胞的细胞毒性。示例实验的结果在图36b中示出。如图36b所示，具有或不具有rts-il-12的egfrviii-car-t细胞显示出靶细胞的egfrviii抗原特异性、剂量依赖性细胞毒性。实施例10.用丝氨酸重组酶系统对pbmc的核转染通过核转染将如图17所示含有丝氨酸重组酶附着位点和基因开关系统组分的各种dna质粒转染到外周血单核细胞(pbmc)中以重定向t细胞特异性。具体而言，在存在和不存在丝氨酸重组酶sf370的情况下测试3种单一载体：(i)car：her1t+组成型mbil15(阳性对照)(ii)car：her1t+无启动子mbil15(阴性对照)(iii)car：her1t+rts：mbil15每周(在第1天、第8天、第15天和第22天)评价car和mbil15的表达。在每次流动之前24-48h用dmso或veledimex处理等份细胞以评估诱导型mbil15表达。每周以1∶1的比例向aapc克隆1添加car+细胞。仅观察到接受car/mbil15载体构建体+sf370重组酶的细胞扩充；尽管转染效率相似，但其它所有培养物在一周内均未能扩充。该结果指示测试构建体的重组酶介导的整合。her1t表达仅在第22天和第29天评价，并且与car表达很好地相关(数据未示出)。转染后两周，veledimex处理(～48h)导致mbil-15表达的诱导。在不存在veledimex的情况下，mbil-15表达在阴性对照“无启动子mbil15”样品的范围内。去除veledimex导致mbil15表达的完全丧失。尽管本文中已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所述的实施方案的各种替代方案，或者这里描述的这些实施方案或方面中的一个或多个的组合，可用于实施本发明。旨在以下述权利要求书限定本公开的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。序列表<110>英特拉克森公司<120>通过新基因开关表达系统调节多肽的表达<130>50471-706.601<140><141><150>62/464,958<151>2017-02-28<150>62/444,775<151>2017-01-10<160>244<170>patentinversion3.5<210>1<211>54<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="whitlow连接体"<400>1ggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggc54<210>2<211>78<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="连接体"<400>2tctggcggaggatctggaggaggcggatctggaggaggaggcagtggaggcggaggatct60ggcggaggatctctgcag78<210>3<211>9<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="gsg连接体"<400>3ggaagcgga9<210>4<211>12<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="sgsg连接体"<400>4agtggcagcggc12<210>5<211>45<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="(g4s)3连接体"<400>5ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct45<210>6<211>12<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="弗林蛋白酶切割位点/弗林蛋白酶link1"<400>6cgtgcaaagcgt12<210>7<211>84<212>dna<213>口蹄疫病毒<220><221>来源<223>/备注="fmdv"<400>7agagccaagagggcaccggtgaaacagactttgaattttgaccttctgaagttggcagga60gacgttgagtccaaccctgggccc84<210>8<211>54<212>dna<213>thoseaasigna病毒<220><221>来源<223>/备注="thoseaasigna病毒2a区(t2a)"<400>8gagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct54<210>9<211>75<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="弗林蛋白酶-gsg-t2a"<400>9agagctaagaggggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgag60gagaatcctggacct75<210>10<211>78<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="弗林蛋白酶-sgsg-t2a"<400>10agggccaagaggagtggcagcggcgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtg60gaggagaatcccggccct78<210>11<211>57<212>dna<213>porcinetescho病毒<220><221>来源<223>/备注="porcinetescho病毒-12a区(p2a)"<400>11gcaacgaacttctctctcctaaaacaggctggtgatgtggaggagaatcctggtcca57<210>12<211>66<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="gsg-p2a"<400>12ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccct60ggacct66<210>13<211>60<212>dna<213>马鼻炎a病毒<220><221>来源<223>/备注="马鼻炎a病毒2a区(e2a)"<400>13cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaaccctggacct60<210>14<211>66<212>dna<213>口蹄疫病毒<220><221>来源<223>/备注="口蹄疫病毒2a区(f2a)"<400>14gtcaaacagaccctaaactttgatctgctaaaactggccggggatgtggaaagtaatccc60ggcccc66<210>15<211>93<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="fp2a"<400>15cgtgcaaagcgtgcaccggtgaaacagggaagcggagctactaacttcagcctgctgaag60caggctggagacgtggaggagaaccctggacct93<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="连接体-gsg"<400>16gcaccggtgaaacagggaagcgga24<210>17<211>15<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="连接体"<400>17gcaccggtgaaacag15<210>18<211>570<212>dna<213>脑心肌炎病毒<220><221>来源<223>/备注="emcvires"<400>18ccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggt60gtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggccc120ggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaag180gaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagac240aaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcc300tctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcc360acgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaaca420aggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggt480gcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgg540ggacgtggttttcctttgaaaaacacgatc570<210>19<211>73<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="2xrbm3ires"<400>19actagttttataatttcttcttccagaatttctgacattttataatttcttcttccagaa60gactcacaacctc73<210>20<211>66<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="gm-csfr-alpha信号肽"<400>20atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg60atccca66<210>21<211>66<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="gm-csfr-alpha信号肽"<400>21atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgtgagctgccccaccccgcctttctgctg60atcccc66<210>22<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="igkappa信号肽"<400>22atgaggctccctgctcagctcctggggctgctaatgctctgggtcccaggatccagtggg60<210>23<211>54<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="ige信号肽"<400>23atggattggacctggattctgtttctggtggccgctgccacaagagtgcacagc54<210>24<211>63<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="cd8-alpha信号肽"<400>24atggcgctgcccgtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccg63<210>25<211>63<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="cd8-alpha信号肽"<400>25atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccg63<210>26<211>63<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="tvb2(t21a)信号肽"<400>26atgggcaccagcctcctctgctggatggccctgtgtctcctgggggcagatcacgcagat60gct63<210>27<211>72<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="cd52信号肽"<400>27atgaagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctggttatggtacagatacaa60actggactctca72<210>28<211>84<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="低亲和力神经生长因子受体(lngfr,tnfrsf16)信号肽"<400>28atg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220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="egfrviiicar(humr1-1scfv.cd8alpha4x铰链&tm.4-1bb.cd3-zeta)"<400>128gacatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgacc60atcacctgtatgaccagcaccgacatcgacgacgacatgaactggtatcagcagaagccc120ggcaagacccccaagctgctgatctacgagggcaacaccctgaggcctggcgtgcccagc180agattttctggcagcggctccggcaccgacttcatcttcaccatcagctccctgcagccc240gaggatatcgccacctactactgcctgcagagctggaacgtgcccctgacctttggcgga300ggcaccaaggtggaaatcaagggcggaggcggatctggcggcggaggatctgggggaggc360ggctctcaggtgcagctgcaggaatctggcggagggctcgtgaagcctggcggaagcctg420aagctgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaagttcggcatgagctgggtgcgc480cagacccccgacaagagactggaatgggtggccagcatcagcaccggcggctacaatacc540tactacagcgacaacgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaacgccaagaacacc600ctgtacctgcagatgagcagcctgaagtccgaggacaccgccatgtactactgtgccaga660ggctacagcccctacagctacgccatggattactggggccagggcacaatggtcaccgtg720tcctctaagcctaccaccacccccgcacctcgtcctccaacccctgcacctacgattgcc780agtcagcctctttcactgcggcctgaggccagcagaccagctgccggcggtgccgtccat840acaagaggactggacttcgcgtccgataaacctactaccactccagccccaaggccccca900accccagcaccgactatcgcatcacagcctttgtcactgcgtcctgaagccagccggcca960gctgcagggggggccgtccacacaaggggactcgactttgcgagtgataaacctactaca1020actcctgccccccggcctcctacaccagctcctactatcgcctcccagccactcagtctc1080agacccgaggcttctaggccagcggccggaggcgcggtccacacccgcgggctggacttt1140gcatccgataagcccaccaccacccctgcccctagacctccaaccccagcccctacaatc1200gccagccagcccctgagcctgaggcccgaagcctgtagacctgccgctggcggagccgtg1260cacaccagaggcctggatttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacc1320tgtggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgcaaccaccggaataagaga1380ggccggaagaaactgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacc1440caggaagaggacggctgcagctgccggttccccgaggaagaggaaggcggctgcgaactg1500cgggtgaagttcagccggagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaaccagctg1560tacaacgagctgaacctgggccggagggaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggc1620cgggaccctgagatgggcggcaagccccggagaaagaaccctcaggagggcctgtataac1680gaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcgg1740cggaggggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggatacc1800tacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga1836<210>129<211>1695<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="egfrviiicar(humr1-2scfv.cd8alpha3x铰链&tm.4-1bb.cd3-zeta)"<400>129gacatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgacc60atcacctgtatgaccagcaccgacatcgacgacgacatgaactggtatcagcagaagccc120ggcaagacccccaagctgctgatctacgagggcaacaccctgaggcctggcgtgcccagc180agattttctggcagcggctccggcaccgacttcatcttcaccatcagctccctgcagccc240gaggatatcgccacctactactgcctgcagagctggaacgtgcccctgacctttggcgga300ggcaccaaggtggaaatcaagggcggaggcggatctggcggcggaggatctgggggaggc360ggctctcaggtgcagctgcaggaatctggcggagggctcgtgaagcctggcggaagcctg420aagctgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaagttcggcatgagctgggtgcgc480cagacccccgacaagagactggaatgggtggccagcatcagcaccggcggctacaacacc540ttctacagcgacaacgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaacgccaagaacacc600ctgtacctgcagatgagcagcctgaagtccgaggacaccgccatgtactactgtgccaga660ggctacagcccctacagcttcgccatggattactggggccagggcacaatggtcaccgtg720tcctctaagcctaccaccacccccgcacctcgtcctccaacccctgcacctacgattgcc780agtcagcctctttcactgcggcctgaggccagcagaccagctgccggcggtgccgtccat840acaagaggactggacttcgcgtccgataaacctactaccactccagccccaaggccccca900accccagcaccgactatcgcatcacagcctttgtcactgcgtcctgaagccagccggcca960gctgcagggggggccgtccacacaaggggactcgactttgcgagtgataagcccaccacc1020acccctgcccctagacctccaaccccagcccctacaatcgccagccagcccctgagcctg1080aggcccgaagcctgtagacctgccgctggcggagccgtgcacaccagaggcctggatttc1140gcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagc1200ctggtcatcaccctgtactgcaaccaccggaataagagaggccggaagaaactgctgtac1260atcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgcagc1320tgccggttccccgaggaagaggaaggcggctgcgaactgcgggtgaagttcagccggagc1380gccgacgcccctgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggc1440cggagggaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccctgagatgggcggc1500aagccccggagaaagaaccctcaggagggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatg1560gccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggcggaggggcaagggccacgac1620ggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcag1680gccctgccccccaga1695<210>130<211>1836<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/备注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/备注="egfrviiicar(humr1-2scfv.cd8alpha4x铰链&tm.4-1bb.cd3-zeta"<400>130gacatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgacc60atcacctgtatgaccagcaccgacatcgacgacgacatgaactggtatcagcagaagccc120ggcaagacccccaagctgctgatctacgagggcaacaccctgaggcctggcgtgcccagc180agattttctggcagcggctccggcaccgacttcatcttcaccatcagctccctgcagccc240gaggatatcgccacctactactgcctgcagagctggaacgtgcccctgacctttggcgga300ggcaccaaggtggaaatcaagggcggaggcggatctggcggcggaggatctgggggaggc360ggctctcaggtgcagctgcaggaatctggcggagggctcgtgaagcctggcggaagcctg420aagctgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaagttcggcatgagctgggtgcgc480cagacccccgacaagagactggaatgggtggccagcatcagcaccggcggctacaacacc540ttctacagcgacaacgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaacgccaagaacacc600ctgtacctgcagatgagcagcctgaagtccgaggacaccgccatgtactactgtgccaga660ggctacagcccctacagcttcgccatggattactggggccagggcacaatggtcaccgtg720tcctctaagcctaccaccacccccgcacctcgtcctccaacccctgcacctacgattgcc780agtcagcctc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