腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体的制作方法

本发明涉及腺相关病毒(aav)衣壳蛋白的突变体。本发明的aav衣壳蛋白突变体尤其可用于基因转移至靶细胞中和/或在靶细胞中表达转基因。
背景技术：
：腺相关病毒(aav)是一种感染哺乳动物诸如人和灵长类动物的直径为约20nm的无包膜病毒，并且被分类为家族细小病毒科，依赖病毒属。迄今为止，已经鉴定了大量aav血清型(例如，非专利文献1)，并且已知不同血清型的aav感染不同类型的动物或细胞。aav基因组是近似4.7kb的单链dna(ssdna)，并且在两个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(itr)。itr序列自身形成watson-crick碱基对以形成t型发夹结构，其包含aav基因组的复制和包装所必需的顺式元件。aav基因组在侧接itr序列的区域中包含两个开放阅读框(orf)。一个orf(也称为“rep基因”)编码四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。另一个orf(也称为“cap基因”)编码三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)和组装活化蛋白(aap)。rep蛋白具有解旋酶活性，并且不仅是诱导外壳形成所需的，而且是将aav基因组整合至宿主细胞染色体中所需的。另一方面，vp1、vp2和vp3的总共60个分子以1:1:10的比率组装以形成二十面体aav外壳。vp1、vp2和vp3主要在n-末端区域中不同。例如，磷脂酶a2(磷脂酶a2:pla2)结构域存在于vp1的n-末端。由于pla2结构域仅存在于vp1中，所以vp1的n-末端区域也称为vp1独特区域(vp1u)。已知pla2结构域在酸性条件下暴露于aav颗粒外部（尽管其通常存在于aav颗粒内侧）。因此，据信pla2结构域是aav在aav进入细胞后从内体逃逸并转移至核中所必需的(非专利文献2)。aap是形成aav衣壳所必需的蛋白。天然的aav复制取决于辅助病毒诸如腺病毒和疱疹病毒的存在。在辅助病毒存在的情况下，aav基因组在宿主细胞中复制，并形成含有aav基因组的完整aav颗粒。然后，aav颗粒从宿主细胞释放。在辅助病毒不存在的情况下，aav基因组以附加体形式维持，或整合至宿主染色体中并变得潜伏。aav可以感染各种各样的细胞，包括人细胞，并且aav甚至感染分化终止的非分裂中的细胞，包括血细胞、肌肉细胞和神经细胞。此外，由于aav对人无致病性，所以其具有副作用的低风险。aav的病毒颗粒在物理化学上是稳定的。由于这些原因，aav最近已受到作为用于基因疗法中的基因转移的载体的实用价值的关注，所述基因疗法用于治疗先天性遗传疾病以及治疗癌症或感染。遗传修饰的aav(下文称为重组aav)的产生通常通过如下进行：以核酸构建体的形式将形成aav颗粒所必需的元件引入细胞中以产生具有产生病毒的能力的细胞(下文称为产生病毒的细胞)，和培养细胞以表达aav颗粒形成所必需的元件。通常，在aav颗粒形成所必需的元件中，需要以顺式提供的元件和可以以反式提供的元件分别作为分开的构建体引入细胞中，由此防止野生型aav的产生和重组aav在宿主中的自我复制。通常，通过将如下所述的三种类型的质粒引入细胞中来产生产生病毒的细胞。1)用于提供重组aav基因组的质粒，其在两个末端保留itr序列，从其中除去rep和cap基因，并且其携带期望的异源多核苷酸(有时称为转基因)代替除去的rep和cap基因(下文称为载体质粒)；2)用于提供rep蛋白和衣壳蛋白的质粒(下文称为包装质粒)；和3)用于在腺病毒来源的元件中仅提供aav颗粒形成所必需的元件的质粒(下文称为辅助质粒)。使用装载有期望的异源多核苷酸的重组aav颗粒使得能够将长期稳定的基因转移至各种靶细胞或靶器官中。迄今为止，已经显示基因转移至骨骼肌细胞、肝细胞(肝脏)、心肌细胞(心脏)、神经细胞、胰腺细胞和胰岛细胞中是可能的。此外，重组aav已用于人临床试验中。另一方面，通过改变衣壳蛋白来进行改变aav的细胞向性(专利文献1)或增加基因转移效率(例如，专利文献2和专利文献3)的尝试。例如，专利文献2公开了通过用另一种氨基酸置换aav的外壳表面上存在的抗原残基以避免中和抗体除去aav颗粒，aav在活体中的长期存活变得可能，并且作为结果，基因转移效率增加。专利文献3公开了通过用另一种氨基酸(例如，苯丙氨酸)置换aav的外壳表面上存在的酪氨酸残基来抑制细胞中酪氨酸的泛素化和避免泛素-蛋白酶体水解，aav在活体中的长期存活变得可能，并且作为结果，基因转移效率增加。引文列表专利文献专利文献1：wo2014/103957专利文献2：wo2014/194132专利文献3：wo2008/124724非专利文献非专利文献1：vandenberghe等人,humangenetherapy,vol.21,pp.1251-1257,2010非专利文献2：kronenberg等人,journalofvirology,vol.79,pp.5296-5303,2005。发明概述技术问题如上所述，曾经尝试通过改变aav衣壳蛋白来增加基因转移效率。然而，通过使用重组aav增加基因转移效率和/或基因表达效率的此类尝试仍有改进的空间。具体地，用aav感染靶细胞和转基因的表达通过多个步骤完成。因此，预期通过改进每个步骤可以协同地增加基因转移效率和/或基因表达效率。本发明的一个目的是提供aav衣壳蛋白的突变体，以便通过使用重组aav增加基因转移至靶细胞中的效率和/或增加基因表达的效率。问题的解决方案作为解决上述问题的大量努力的结果，本发明人发现可以通过利用aav衣壳蛋白的新型突变体以高效率将期望的基因引入靶细胞，并且可以在细胞中强烈表达该基因。因此，完成了本发明。具体地，本发明涉及：[1]腺相关病毒(aav)衣壳蛋白的突变体，与野生型aav衣壳蛋白的氨基酸序列相比，其在pla2结构域中包含一个或多个氨基酸置换，其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自以下的一个或多个位置：在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)在位置3处的丙氨酸，(2)在位置6处的酪氨酸，(3)在位置68处的丙氨酸，(4)在位置87处的天冬氨酸，(5)在位置91处的亮氨酸，(6)在位置149处的丝氨酸，(7)在位置150处的脯氨酸，和(8)在位置156处的丝氨酸，或在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中对应于上述(1)至(8)的一个或多个位置处；[2]根据[1]所述的aav衣壳蛋白的突变体，其中所述一个或多个氨基酸置换是选自以下的一个或多个氨基酸置换：在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(a3t)，(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(y6h)，(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(a68v)，(4)用天冬酰胺置换位置87处的天冬氨酸(d87n)，(5)用脯氨酸置换位置91处的的亮氨酸(l91p)，(6)用酪氨酸置换位置149处的丝氨酸(s149y)，(7)用组氨酸置换位置150处的脯氨酸(p150h)，和(8)用酪氨酸置换位置156处的丝氨酸(s156y)，或在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中对应于上述(1)至(8)的一个或多个氨基酸置换；[3]根据[1]所述的aav衣壳蛋白的突变体，其中所述一个或多个氨基酸置换是选自以下的一个或多个氨基酸置换：在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(a3t)，(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(y6h)，和(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(a68v)，或在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中对应于上述(1)至(3)的一个或多个氨基酸置换；[4]根据[1]至[3]中任一项所述的突变体，其为aav2衣壳蛋白的突变体；[5]核酸，其编码根据[1]-[4]中任一项所述的aav衣壳蛋白的突变体；[6]细胞，其含有根据[5]所述的核酸；[7]产生重组aav颗粒的方法，所述方法包括培养根据[6]所述的细胞以产生重组aav颗粒的步骤；[8]根据[7]所述的产生重组aav颗粒的方法，其中根据[6]所述的细胞还含有编码aavrep蛋白的核酸、编码形成aav颗粒所必需的腺病毒来源的元件的核酸和具有aav基因组dna的核苷酸序列的核酸；[9]重组aav颗粒，其含有根据[1]-[4]中任一项所述的aav衣壳蛋白的突变体；[10]组合物，其含有根据[9]所述的重组aav颗粒；和[11]将基因引入靶细胞的方法，所述方法包括使根据[9]所述的重组aav颗粒与靶细胞接触的步骤。发明效果根据本发明，提供了可用于基因转移至靶细胞中的基因转移系统。本发明的重组aav颗粒可以以高效率将基因引入靶细胞中，允许引入靶细胞中的基因以高效率转录，且然后允许所述基因强烈表达。附图简述图1显示实施例1中的电泳的结果。图2显示实施例3中的荧光显微镜观察的结果。实施方案的描述如本文所用，术语“腺相关病毒(aav)”是指感染灵长类动物和包括人在内的其他哺乳动物的小病毒，并且被分类为细小病毒科，依赖病毒属。aav具有无包膜的二十面体外壳和壳内的单链基因组dna。如本文所用，如果没有另外指明，则aav包括野生型病毒及其衍生物，并且还包括所有血清型和进化枝。如本文所用，aav颗粒的血清型基于衍生衣壳的血清型。换言之，重组aav颗粒的血清型基于用于制备重组aav颗粒的cap基因的来源确定，并且不依赖于包封在重组aav颗粒中的aav基因组的血清型。例如，当衣壳蛋白衍生自aav6并且包封在重组aav颗粒中的aav基因组中的itr序列衍生自aav2时，重组aav颗粒被定义为血清型6。如本文所用，术语“衣壳蛋白”意指由存在于病毒基因组中的cap基因编码并构成病毒的外壳的蛋白。野生型aav基因组或cap基因编码三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)。如本文所用，vp1、vp2和vp3全部包括在衣壳蛋白中。如本文所用，术语“aav颗粒”意指具有完整外壳结构的颗粒。aav基因组可以包含或不包含在外壳内。换言之，如本文所用，aav颗粒还包括含有重组aav基因组的aav颗粒(有时称为aav载体)和不含aav基因组的aav样颗粒(例如，aav中空颗粒：wo2012/144446)。如本文所用，术语“重组”意指使用遗传重组技术产生。例如，重组aav颗粒意指使用遗传重组技术产生的aav颗粒，且重组dna意指使用遗传重组技术产生的dna。如本文所用，术语“野生型”意指物种中野生群体中最常见的类型。与突变型相反，野生型是指被认为是基础的表型或具有该表型的个体。野生型也称为“正常型”。另一方面，如本文所用，术语“突变体”是指表达由突变的基因引起的性状变化的蛋白、病毒、细胞、个体等。此外，如本文所用，术语“突变体”也可以是指突变的基因本身。如本文所用，术语“氨基酸置换”意指由于非同义突变而用另一种氨基酸置换蛋白分子中的氨基酸。所述氨基酸置换由于物种或个体之间的差异可以是天然存在的，或者可以是人工诱导的。人工诱导可以通过已知方法进行。例如，包含具有一个或几个氨基酸置换的氨基酸序列的多肽可以通过经由已知方法将碱基置换、缺失、添加或插入引入编码多肽的核酸中来制备。下面详细解释本发明。(i)aav衣壳蛋白突变体本发明的aav衣壳蛋白的突变体通过在aav衣壳蛋白的氨基酸序列中用另一个氨基酸置换至少一个氨基酸而产生。aav衣壳蛋白突变体的使用使得能够基因以高效率引入靶细胞和基因在细胞中的强烈表达。可用于本发明中的aav衣壳蛋白的血清型或来源没有特别限制，并且可以是任何已知的血清型或来源。可用于本发明中的aav衣壳蛋白的实例包括，但不限于，任何aav的衣壳蛋白，所述aav包括来自灵长类动物的aav，诸如aav1型(aav1)、aav2型(aav2)、aav3型(aav3a和aav3b)、aav4型(aav4)、aav5型(aav5)、aav6型(aav6)、aav7型(aav7)、aav8型(aav8)、aav9型(aav9)、aav10型(aav10)、aav11型(aav11)、aav12型(aav12)和aav13型(aav13)，以及来自非灵长类动物的aav，诸如禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、和山羊aav。另外，衍生自任何已知血清型aav的aav衣壳蛋白或任何已知重组aav的衣壳蛋白也可用于本发明中。例如，如本发明所鉴定的氨基酸置换可以与已知增加基因转移效率和/或基因表达效率的突变同时引入aav衣壳蛋白中，以协同地增加具有衣壳蛋白的aav的基因转移效率和/或基因表达效率。此外，本发明可以与改变稳定性或细胞向性的已知突变组合。在本发明中，可以优选使用aav2衣壳蛋白。野生型aav2vp1的氨基酸序列显示于seqidno:2中。本领域技术人员可以容易地鉴定对应于aav2衣壳蛋白的氨基酸序列中的每个氨基酸位置的除了aav2以外的aav血清型或进化枝的衣壳蛋白的氨基酸序列中的位置。参见，例如，gao等人,proc.natl.acad.sci.usa,vol.99,no.18,pp.11854-11859,2002中描述的vp1的氨基酸序列比对。本发明的aav衣壳蛋白突变体中的氨基酸置换发生在选自野生型aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的(1)位置3处的丙氨酸、(2)位置6处的酪氨酸、(3)位置68处的丙氨酸、(4)位置87处的天冬氨酸、(5)位置91处的亮氨酸、(6)位置149处的丝氨酸、(7)位置150处的脯氨酸和(8)位置156处的丝氨酸的位置，或除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的选自对应于上述(1)至(8)的位置的位置。如本文所用，术语“除了aav2以外的aav”意指除了aav2以外的血清型或进化枝的aav，并且其实例包括但不限于aav1、aav3(aav3a和aav3b)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12和aav13，以及来自非灵长类动物的aav，诸如禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav和山羊aav。如本文所用，短语“对应于…的位置”或“对应于…的一个或多个位置”，在本发明的aav衣壳蛋白突变体是aav2衣壳蛋白突变体的情况下，意指由上述(1)至(8)代表的氨基酸位置，并且在本发明的aav衣壳蛋白突变体是除了aav2以外的血清型或进化枝的aav的衣壳蛋白的突变体的情况下，意指所述血清型或进化枝的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中对应于上述(1)至(8)的位置。如上所述，本领域技术人员容易地确定除了aav2以外的aav血清型或进化枝的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的此类对应位置。氨基酸置换的位置都存在于pla2结构域中。pla2结构域存在于vp1中，但不存在于vp2和vp3中。换言之，可用于本发明中的衣壳蛋白优选是含有pla2结构域的蛋白，诸如vp1。含有pla2结构域的蛋白的实例包括但不限于全长vp1、vp1片段、pla2结构域以及pla2结构域和另一种蛋白的融合蛋白。在本发明的aav衣壳蛋白突变体中，氨基酸置换后的氨基酸残基没有特别限制，只要获得期望的功能即可。氨基酸置换后的氨基酸残基可以是天然氨基酸或人工氨基酸，只要获得期望的功能即可。除了一些特殊的氨基酸，自然界中存在20种氨基酸。天然氨基酸基于其结构被分类为几组。所述组的实例包括，但不限于，组a：甘氨酸、丙氨酸；组b：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；组c：天冬氨酸、谷氨酸；组d：天冬酰胺、谷氨酰胺；组e：丝氨酸、苏氨酸；组f：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；组g：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；组h：半胱氨酸、甲硫氨酸；和组i：脯氨酸。由于同一组中含有的氨基酸残基具有相似的特性，所以预期它们是可相互交换的。氨基酸置换的实例包括，但不限于，在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(a3t)，(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(y6h)，(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(a68v)，(4)用天冬酰胺取代置换位置87处的天冬氨酸(d87n)，(5)用脯氨酸置换位置91处的亮氨酸(l91p)，(6)用酪氨酸置换位置149处的丝氨酸(s149y)，(7)用组氨酸置换位置150处的脯氨酸(p150h)，和(8)用酪氨酸置换位置156处的丝氨酸(s156y)，以及在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应于上述(1)至(8)的氨基酸置换。如本文所用，短语“对应于...的氨基酸置换”或“对应于...的一个或多个氨基酸置换”，在本发明的aav衣壳蛋白突变体是aav2衣壳蛋白突变体的情况下，意指由上述(1)至(8)代表的氨基酸置换，并且在本发明的aav衣壳蛋白突变体是除了aav2以外的aav血清型或进化枝的衣壳蛋白的突变体的情况下，意指在所述aav血清型或进化枝的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应于由上述(1)至(8)代表的氨基酸位置的位置中发生的对应氨基酸置换。如上所述，本领域技术人员容易地确定除了aav2以外的aav血清型或进化枝的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应氨基酸位置。氨基酸置换的优选实例包括选自在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(a3t)、(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(y6h)和(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(a68v)的一个或多个氨基酸置换，以及选自在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应于上述(1)至(3)的氨基酸置换的一个或多个氨基酸置换。氨基酸置换的更优选实例是在aav2vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的由(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(a3t)、(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(y6h)和(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(a68v)组成的三个氨基酸置换，以及在除了aav2以外的aav的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的由对应于上述(1)至(3)的氨基酸置换组成的三个氨基酸置换。例如，通过将三个氨基酸置换(a3t/y6h/a68v)引入野生型aav2的vp1而获得的由seqidno:6代表的蛋白是本发明的一个实例。(ii)编码aav衣壳蛋白突变体的核酸本发明提供了编码aav衣壳蛋白突变体的核酸。本发明的核酸编码如上文(i)中所述的aav衣壳蛋白的突变体。通过用另一种碱基置换编码aav衣壳蛋白的核酸(cap基因)的核苷酸序列中的至少一个碱基来产生本发明的核酸。本发明的核酸可以以dna的形式存在，或者可以呈rna或dna和rna的嵌合体的形式。本发明的核酸还包括互补核酸(例如，cdna)。本发明的核酸可以是单链或双链的。本发明的核酸优选为双链的。可用于本发明中的aav的cap基因的血清型或来源没有特别限制，并且可以是任何已知的血清型或来源。可用于本发明中的aav血清型的实例包括，但不限于，任何aav，诸如aav1型(aav1)、aav2型(aav2)、aav3型(aav3a和aav3b)、aav4型(aav4)、aav5型(aav5)、aav6型(aav6)、aav7型(aav7)、aav8型(aav8)、aav9型(aav9)、aav10型(aav10)、aav11型(aav11)、aav12型(aav12)和aav13型(aav13)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav和山羊aav。另外，衍生自任何已知血清型aav的cap基因或任何已知重组aav的cap基因也可用于本发明中。在本发明中，可以优选使用aav2cap基因。野生型aav2cap基因的核苷酸序列(编码vp1的核苷酸序列)显示于seqidno:1中。编码aav衣壳蛋白的突变体的核酸的实例包括，但不限于，编码aav2vp1(a68v)的核酸(seqidno:3)，和编码aav2vp1(a3t/y6h/a68v)的核酸(seqidno:5)。本发明的核酸可以与适当的调节序列可操作连接。调节序列的实例包括启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、内部核糖体进入位点(ires)和增强子。启动子序列的实例包括诱导型启动子序列和组成型启动子序列。所述调节序列可以是衍生衣壳蛋白的aav固有的或外源的，并且可以是天然序列或合成序列。在本发明中还包括包含能够表达aav衣壳蛋白突变体的本发明的核酸的重组dna。重组dna可用于在体外、离体或体内将本发明的核酸递送至细胞，以向细胞赋予表达aav衣壳蛋白突变体的能力。已经向其递送本发明的核酸的细胞可用于产生重组aav颗粒。重组dna可以尤其用于将本发明的核酸递送至或引入真核细胞，优选动物细胞，更优选哺乳动物细胞。在本发明中，用作载体的dna装载有本发明的核酸以产生重组dna。例如，可以使用质粒、噬菌体、转座子、粘粒、附加型dna、病毒基因组等。例如，质粒可以装载有编码本发明的aav衣壳蛋白突变体的核酸(cap基因)以产生包装质粒。所述包装质粒可以进一步含有任何核苷酸序列，诸如编码rep蛋白的核酸(rep基因)。包含本发明的核酸的重组dna也可以通过用另一种碱基置换装载至已知包装质粒中的cap基因的核苷酸序列中的pla2结构域编码区中的至少一个碱来产生。所述包装质粒的实例包括但不限于装载有cap基因的包装质粒，优选装载有cap基因和rep基因的包装质粒。装载有cap基因和rep基因的包装质粒的实例是paav-ad-acg2(seqidno:7)。将碱基置换引入核酸中可以通过已知方法进行，并且例如，其通过使用市售试剂诸如mutagenesisbasal试剂盒(由takarabioinc.制造)遵循试剂盒附带的说明书进行pcr来实现。(iii)含有本发明的核酸的细胞本发明还提供了含有本发明的核酸、特别是如上文(ii)中所述的重组dna的细胞，例如分离的细胞。分离的细胞是例如体外维持的细胞系。本发明的细胞可用于产生本发明的重组aav颗粒，如下所解释。当本发明的细胞用于产生病毒颗粒时，该细胞被称为“产生病毒的细胞”(也称为包装细胞或产生细胞)。如上文(ii)中所述的本发明的重组dna可以整合至本发明的细胞的基因组中，或者可以保留在细胞内以便瞬时表达aav衣壳蛋白突变体。用于将含有本发明的核酸的重组dna(核酸构建体)引入细胞的方法的实例包括瞬时或组成型引入方法。瞬时引入方法的实例包括但不限于任何已知的瞬时引入方法，诸如磷酸钙方法，脂质转染方法，deae葡聚糖方法，聚乙烯亚胺方法和电穿孔方法。可以使用市售试剂，例如transit(注册商标)-293reagent(由mirusbiollc制造)，transit(注册商标)-2020(由mirusbiollc制造)，lipofectamine(注册商标)2000reagent(由thermofisherscientificinc.制造)，lipofectamine(注册商标)2000cdreagent(由thermofisherscientificinc.制造)，或fugene(注册商标)transfectionreagent(由promegacorporation制造)。杆状病毒也可用于将核酸构建体引入昆虫细胞中。组成型引入方法的实例包括但不限于任何已知的组成型引入方法，诸如包括使用逆转录病毒载体的方法，和包括通过如上所述的瞬时引入方法引入质粒和选择其中重组dna整合至细胞的染色体中的细胞的方法。在包括使用逆转录病毒载体的方法中，可以使用市售试剂，诸如retorovirusconstructivesystem(由takarabioinc.制造)。通过使用此类建立的技术将本发明的重组dna稳定或瞬时引入细胞中。为了稳定转化，可以将选择标记，例如，众所周知的选择标记，诸如新霉素抗性基因(编码新霉素磷酸转移酶)或潮霉素b抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶)与本发明的重组dna连接。作为向其中引入本发明的核酸的细胞，可以使用各种真核细胞，诸如哺乳动物细胞，包括啮齿动物细胞和灵长类动物细胞(例如，人细胞)，以及昆虫细胞。向其中引入本发明的核酸的细胞可以是原代培养细胞或细胞系。合适的细胞系的实例包括293细胞(atcccrl-1573)、293t细胞、293f细胞、293ft细胞、293eb细胞、cos细胞、hela细胞、vero细胞、3t3小鼠成纤维细胞、c3h10t1/2成纤维细胞、cho细胞、sf9细胞(atcccrl-1711)、aav293细胞(由stratagene制造)和衍生自这些细胞的细胞。在本发明中，例如，优选使用经修饰以便瞬时或组成型表达产生重组aav所必需的蛋白中的一种或一些的细胞，诸如组成型表达腺病毒e1蛋白的293细胞等。(iv)重组aav颗粒和产生重组aav颗粒的方法本发明的重组aav颗粒是包含aav衣壳蛋白的突变体的重组aav颗粒。重组aav颗粒可以从如上文(iii)中所述的细胞产生。本发明的重组aav颗粒可用于将基因引入靶细胞中。通过本发明的重组aav颗粒引入的基因在靶细胞中强烈表达。重组aav颗粒可以使用含有产生aav颗粒所必需的几个元件的细胞作为产生病毒的细胞来产生。第一元件是待在细胞中复制并包装在aav颗粒中的“重组aav基因组”。重组aav基因组包含期望的异源多核苷酸和位于期望的异源多核苷酸的任一侧(即5'-侧和3'-侧)的两个反向末端重复(itr)序列。期望的异源多核苷酸可以具有期望在用重组aav颗粒感染的细胞中表达的基因，以及用于表达的调节序列。itr序列的核苷酸序列是已知的。例如，对于衍生自aav2的itr序列，参见kotinr.m.等人,humangenetherapy,volume5,pages793-801,1994。可以使用衍生自任何各种aav血清型(诸如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5和aav7)的itr序列。用于本发明中的itr序列可以是衍生自野生型aav的序列，或者可以是通过核苷酸的插入、缺失或置换而改变的序列。itr序列允许在rep蛋白存在的情况下复制重组aav基因组，并允许在aav颗粒形成期间将重组aav基因组包装至衣壳颗粒中。重组aav基因组可以装载的期望的异源多核苷酸通常具有小于约5千碱基(kb)的大小。重组aav基因组可以根据目的装载有异源核苷酸，例如编码在受体中已缺失或丢失的期望蛋白的基因，编码具有期望的生物学或治疗活性(例如，抗细菌、抗病毒或抗肿瘤活性)的蛋白的基因，编码抑制或减少有害或不期望的蛋白的产生的rna的期望的核苷酸序列，编码抗原蛋白的核苷酸序列，或编码标记蛋白(例如，egfp、荧光素酶、lacz)的基因。在本发明的一个方面，所述重组aav基因组缺乏cap基因区和/或rep基因区。在这方面，当其中已包装重组aav基因组的aav颗粒感染细胞时，aav颗粒不在感染细胞中单独复制。例如，质粒可用于将第一元件(重组aav基因组)引入细胞中。当第一元件通过质粒引入细胞时，该质粒称为载体质粒。产生aav颗粒所必需的第二元件是“提供包装功能的核酸构建体”。核酸构建体编码衍生自aav的基因，其提供形成aav颗粒所必需的蛋白。换言之，所述核酸构建体含有rep基因区或cap基因区或两者，其为aav的主要orf。为了产生本发明的重组aav颗粒，将编码本发明的aav衣壳蛋白突变体的核酸用作cap基因。具有表达上述突变体的能力的如上文(iii)中所述的产生病毒的细胞可用于产生aav颗粒。aav颗粒的外壳通过组装衣壳蛋白vp1、vp2和vp3的许多分子而形成。在本发明的重组aav颗粒中，衣壳蛋白vp1的所有分子可以是突变体，或构成aav颗粒的外壳的衣壳蛋白vp1分子的一部分可以是突变体，并且剩余部分可以是野生型衣壳蛋白vp1。此外，构成本发明的重组aav颗粒的外壳的衣壳蛋白vp2和vp3也可以具有突变。在本发明的重组aav颗粒中含有的衣壳蛋白突变体可以是单一类型的突变体或多种类型的突变体。aavrep基因编码四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。显示这些rep蛋白具有许多功能，例如aav基因组的dna复制起点的识别、结合和切口，dna解旋酶活性和aav衍生的启动子对转录的改变。例如，质粒可用于将第二元件(提供包装功能的核酸构建体)引入细胞中。当第二元件通过质粒引入细胞时，该质粒称为包装质粒。产生aav颗粒所必需的第三元件是用于aav复制的“辅助病毒功能(也称为辅助功能)”。为了引入辅助病毒功能，可以使用病毒或核酸构建体。当使用病毒时，尽管通常使用腺病毒，但也可以使用病毒诸如1型或2型单纯疱疹病毒或痘苗病毒。当使用病毒时，向其中引入第一元件和第二元件的细胞被作为辅助病毒的病毒感染。因为aav颗粒的包装仅需要表达腺病毒早期基因，例如，可以使用不表达晚期基因的腺病毒。可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒突变体(例如，ts100k或ts149腺病毒突变体)。当使用核酸构建体时，从分离自辅助病毒的辅助病毒功能所必需的核酸制备提供辅助病毒功能的核酸构建体，且然后引入细胞中。提供辅助病毒功能的核酸构建体包含用于提供一种或多种辅助病毒功能的核苷酸序列，并且以质粒、噬菌体、转座子、粘粒或另一种病毒的形式提供给细胞。例如，质粒可用于将第三元件(辅助病毒功能)引入细胞中。当第三元件通过质粒引入细胞时，该质粒称为辅助质粒。可以使用市售的辅助质粒，例如，phelpervector(由takarabioinc.制造)。为了产生aav颗粒，进行1)将第一元件(即重组aav基因组)引入细胞的步骤，2)将第二元件(即提供包装功能的核酸构建体)引入细胞的步骤，和3)将第三元件(即辅助病毒功能)引入细胞的步骤。这些步骤可以同时或顺依次进行。步骤1)至3)可以以任何顺序进行。培养因此产生的产生病毒的细胞。在产生病毒的细胞中，重组aav基因组通过rep基因的表达产物切除，且然后复制。表达的衣壳蛋白形成外壳，并且重组aav基因组被包装在外壳中以产生aav颗粒。当产生病毒的细胞表达aav衣壳蛋白的突变体时，产生的aav颗粒的外壳含有aav衣壳蛋白的突变体。向其中引入第一至第三元件的细胞与上文(iii)中描述的“向其中引入本发明的核酸的细胞”相同。可以在已知的培养条件下进行产生病毒的细胞的培养。培养条件的实例包括但不限于温度为30至40℃，优选37℃，湿度为90至99%，优选95%，且co2浓度为2至10%，优选co2浓度为5%。可以使用超出上述范围的温度、湿度和co2浓度，只要实现产生病毒的细胞的生长和重组aav的产生即可。培养时间没有特别限制，且其实例包括12至150小时，优选48至120小时。用于培养产生病毒的细胞的培养基可以含有细胞培养所必需的组分。培养基的实例包括基础合成培养基，诸如dmem、imdm和dmem:f-12，(如果必要)另外含有胎牛血清、生长因子和肽的基础合成培养基，以及含有增加量的氨基酸的基础合成培养基。在产生病毒的细胞中形成的重组aav颗粒保留在细胞中或释放至培养上清液中。已知产生病毒的细胞中的重组aav颗粒与培养上清液中的哪些的丰度比根据aav血清型而不同(adachi等人,genetherapyandregulation,vol.5,pp.31-55,2010)。为了从产生病毒的细胞纯化重组aav颗粒，通过使用已知方法破坏细胞或通过使细胞与酸性溶液接触来制备含有重组aav颗粒的样品(wo2015/005430)。因此制备的样品进行纯化步骤。另一方面，为了从培养上清液纯化重组aav颗粒，可以将培养上清液直接进行纯化步骤，或者可以浓缩，且然后进行纯化步骤。培养上清液可以通过已知方法或通过使用市售试剂诸如aavpro(注册商标)浓缩器(由takarabioinc.制造)进行浓缩。aav颗粒的纯化方法的实例包括但不限于各种纯化方法，诸如cscl梯度超速离心、色谱法和超滤。通过适当地使用上述纯化方法，可以从含有重组aav颗粒的样品分离和纯化aav颗粒。aav颗粒也可以通过使用市售试剂、诸如aavpro(注册商标)纯化试剂盒(所有血清型)(由takarabioinc.制造)来纯化。当在上述步骤3)(将第三元件(即辅助病毒功能)引入细胞的步骤)中使用辅助病毒时，例如，可以添加基于大小分离aav颗粒和辅助病毒的步骤。也可以基于对肝素的亲和力的差异，将aav颗粒与辅助病毒分离。此外，可以使用已知方法灭活剩余的辅助病毒。例如，腺病毒可以通过在约60℃下加热例如20分钟或更长时间来灭活。该处理对于选择性除去用作辅助病毒的腺病毒是有效的，因为aav颗粒对热极端稳定。重组aav颗粒的量显示为重组aav颗粒的滴度等。重组aav颗粒的滴度显示为，但不限于，在特定量的样品中，(a)aav基因组的数目(基因组滴度)，(b)如实验测定的aav对细胞的感染能力(感染滴度)，或(c)构成aav的蛋白的量(或纯度)。用于测定上述(a)的方法的实例包括：包括通过pcr测定含有aav颗粒的样品中的aav基因组的拷贝数(基因组拷贝:g.c.)的方法。为了测定基因组滴度，例如，使用aavpro(注册商标)滴定试剂盒(用于实时pcr)版本2(由takarabioinc.制造)，并且可以通过如所附说明书中描述的方法计算基因组滴度。用于测定上述(b)的方法的实例包括：包括用含有aav颗粒的样品的连续稀释溶液感染合适的靶细胞和检测细胞形式的变化(细胞病变)的方法，包括检测转基因的表达的方法，以及包括测定引入细胞中的aav基因组的拷贝数的方法。用于测定上述(c)的方法的实例包括：包括蛋白的sds-page分析的方法和包括通过免疫学技术定量测定蛋白的方法。(v)用于将基因引入靶细胞的方法，其包括使重组aav颗粒与靶细胞接触的步骤为了基因疗法的目的和其他目的，本发明的纯化的重组aav颗粒用于将期望的异源多核苷酸递送至靶细胞。通常，aav颗粒在体内或体外将期望得基因引入靶细胞。对于体外基因引入，使aav颗粒与从活的生物体获得的细胞接触。也可以将细胞移植至活体中。为了将细胞移植至活体中，将细胞配制为药物组合物，并且可以使用各种技术，诸如肌肉内、静脉内、皮下和腹膜内施用。对于体内基因引入，将aav颗粒配制为药物组合物，并且药物组合物通常肠胃外施用(例如，经由施用途径诸如肌肉内、皮下、肿瘤内、经皮、鞘内等施用)。包含aav颗粒的药物组合物含有药学上可接受的载体和任选其他试剂，诸如药物、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂和稀释剂。作为靶细胞，例如，可以使用各种真核细胞，诸如哺乳动物细胞，包括啮齿动物细胞，和灵长类动物细胞(例如，人细胞)和昆虫细胞。所述靶细胞可以是原代培养细胞或细胞系。其实例包括但不限于cho细胞，且优选cho-k1细胞。如本文所用，术语“基因转移效率”意指在经历基因引入的细胞数目中获得aav基因组的细胞数目的比例。此外，可基于每个靶细胞引入期望的异源核苷酸的程度、即每个细胞的aav基因组的拷贝数来估计基因转移效率。引入的aav基因组可以整合至靶细胞的染色体中或者以附加体方式维持。当使用本发明的重组aav颗粒时，可实现等于或高于使用常规重组aav颗粒实现的基因转移效率的基因转移效率。如本文所用，术语“基因表达效率”意指每个靶细胞表达期望的异源核苷酸的程度。甚至当测量转录物(mrna)的量而不是表达产物(蛋白)的量时，本文也使用术语“基因表达效率”。当使用本发明的重组aav颗粒时，可实现使用常规重组aav颗粒实现的基因转移效率的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的基因转移效率。实施例本发明将通过下面描述的实施例更具体地解释，本发明的范围不应限于此。实施例1狨猴aav的分离从老年普通狨猴(10岁或更大，死于衰弱)的大脑、心脏和骨骼肌收集基因组dna。然后，用基因组dna、pad5(由agilenttechnologiesinc.制造)、psv3neo-larget和pe1δ55(wo2012/144446)转染293eb细胞，且然后培养。收集细胞，且制备细胞裂解物。然后，用裂解物和5型腺病毒(ad5)转染293细胞，且然后培养。收集细胞，且制备细胞裂解物。使用作为模板的裂解物、针对aav的高度保守区域设计的引物组和tksgflex(商标)dna聚合酶(由takarabioinc.制造)，将pcr进行50个循环的在98℃下10秒和在61℃下15秒。当将pcr扩增产物装载在琼脂糖凝胶上并电泳时，在源自用大脑来源的基因组dna转染的293eb细胞的样品中发现对应于aav的扩增产物的条带(图1)。克隆从该条带提取的dna片段，并测定其核苷酸序列。作为结果，获得了几种狨猴aav克隆。实施例2狨猴aav与aav2的比较当将实施例1中测定的狨猴aav的vp1的氨基酸序列与aav2的vp1的氨基酸序列(seqidno:2)比较时，在11个位置发现不同的氨基酸(a3t、y6h、a68v、d87n、l91p、s149y、p150h、s156y、y444f、y500f、y730f)。它们中，n-末端侧的8个位置处的氨基酸残基(位置3处的苏氨酸，位置6处的组氨酸，位置68处的缬氨酸，位置87处的天冬酰胺，位置91处的脯氨酸，位置149处的酪氨酸，位置150处的组氨酸，位置156处的酪氨酸)在其他aav血清型中从未发现，并且都位于vp1独特区域(vp1u)中。另一方面，c-末端侧的3个位置处的氨基酸残基(位置444、位置500和位置730处的苯丙氨酸)在其他aav血清型中是已知的，并且位于vp1、vp2和vp3的共同区域中。实施例3aav2突变体的制备将突变引入aav2的cap基因以制备两种aav2突变体，其中vp1的氨基酸序列的一部分用衍生自狨猴aav的vp1的氨基酸序列置换，即aav2(a68v)和aav2(a3t/y6h/a68v)。对于每种aav2突变体的vp1，编码vp1的cap基因的核苷酸序列和全长vp1的氨基酸序列显示于表1中。[表1]核苷酸序列氨基酸序列aav2vp1(a68v)seqidno:3seqidno:4aav2vp1(a3t/y6h/a68v)seqidno:5seqidno:6这些aav2突变体的病毒基因组装载有egfp基因。用aav2突变体感染的细胞可以表达egfp。下面显示用于产生aav2突变体的方法。(1)包装质粒突变体的制备包装质粒paav-ad-acg2(seqidno:7)含有aav2的rep基因和aav2的cap基因。通过使用作为模板的paav-ad-acg2、突变体-1f引物(seqidno:8)、突变体-1r引物(seqidno:9)和primestar(注册商标)mutagenesisbasal试剂盒(由takarabioinc.制造)遵循试剂盒附带的说明进行pcr，产生包装质粒突变体paav-ad-acg2(a68v)。存在于该突变体质粒上的cap基因在vp1编码区中含有由seqidno:3显示的核苷酸序列。类似地，通过使用作为模板的上述paav-ad-acg2(a68v)、突变体-2f引物(seqidno:10)和突变体-2r引物(seqidno:11)进行pcr来产生paav-ad-acg2(a3t/y6h/a68v)。存在于该突变体质粒上的cap基因在vp1编码区中含有由seqidno:5显示的核苷酸序列。(2)将质粒引入293eb细胞将实施例3-(1)中制备的每种包装质粒突变体、辅助质粒(phelpervector，由takarabioinc.制造)和载体质粒(paav-cb-egfp，seqidno:12)通过使用聚乙烯亚胺(由cosmobioinc.制造)的转染方法引入293eb细胞中。将293eb细胞在含有1/100体积的glutamax(由gibco制造)的dmem培养基中在37℃和5%co2下培养3天。(3)aav2突变体的纯化从如实施例3-(2)中所述培养的293eb细胞和培养上清液纯化aav2突变体。通过使用aavpro(注册商标)纯化试剂盒(所有血清型)(由takarabioinc.制造)遵循试剂盒附带的说明，从293eb细胞纯化aav2突变体。通过使用aavpro(注册商标)浓缩器(由takarabioinc.制造)遵循试剂盒附带的说明，从培养上清液纯化aav2突变体。将从293eb细胞纯化的aav2突变体和从培养上清液纯化的aav2突变体混合并用于下一实验。这两种aav2突变体命名为aav2(a68v)和aav2(a3t/y6h/a68v)。(4)aav2突变体的滴度测定将实施例3-(3)中获得的aav2突变体溶液(5μl)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)(84.5μl)、20mmmgcl2(10μl)和250u/μlbenzonase(0.5μl)混合，并且在室温下孵育1小时以降解游离的基因组dna和质粒dna。添加100μlpbs之后，使用dneasyblood&tissue试剂盒(由qiagen制造)遵循试剂盒附带的说明，纯化aav的基因组dna。使用作为模板的该aav基因组dna、itr-f引物(seqidno:13)、itr-r引物(seqidno:14)和sybr(注册商标)premixdimereraser(商标)(perfectrealtime)(由takarabioinc.制造)，遵循试剂盒附带的说明进行定量pcr。另一方面，作为标准，除了使用通过用限制酶saci消化线性化的载体质粒以外，在与上述相同的条件下进行定量pcr，且然后制备标准曲线。因此，测定实施例3-(3)中获得的aav2突变体的基因组滴度。实施例4用aav2突变体感染用实施例3-(3)中获得的每种aav2突变体的5×105g.c./细胞，感染cho-k1细胞(2×104个细胞)(n=3)。作为对照，在相同条件下用野生型aav2感染cho-k1细胞。将这些cho-k1细胞在胶原包被的96孔板上在37℃和5%co2下培养48小时，且然后用荧光显微镜观察egfp的表达(图2)。将裂解缓冲液(由thermofisherscientificinc.制造)以100μl/孔添加至cho-k1细胞，然后在75℃孵育10分钟以提取dna和rna的混合物。将dna和rna的混合物储存在-80℃，直至使用。然后，进行如下三个实验。首先，使用作为模板的混合物中的dna、仓鼠-肌动蛋白-f引物(seqidno:15)、仓鼠-肌动蛋白-r引物(seqidno:16)和sybr(注册商标)premixextaq(商标)(tlirnasehplus)(由takarabioinc.制造)进行定量pcr。遵循试剂盒附带的说明进行pcr。从实验结果测定每个孔中的细胞数(细胞)。接下来，使用作为模板的混合物中的dna、itr-f引物(seqidno:13)、itr-r引物(seqidno:14)和sybr(注册商标)premixdimereraser(商标)(perfectrealtime)(由takarabioinc.制造)进行定量pcr。遵循试剂盒附带的说明进行pcr。从实验结果测定每个孔中存在的aav的基因组拷贝数(基因组拷贝：g.c.)。基于这些值，计算每个细胞的aav基因组拷贝数(g.c./细胞)。此外，使用作为模板的混合物中的rna、high-capacitycdna逆转录试剂盒(由thermofisherscientificinc.制造)、egfp-f引物(seqidno:17)和egfp-r引物(seqidno:18)进行定量rt-pcr。遵循试剂盒附带的说明进行rt-pcr。从实验结果测定每个孔中的egfp基因的转录量(egfp)。基于egfp的转录量(egfp)和细胞数(细胞)，计算每个细胞的egfp转录量(egfp/细胞)。基于每个细胞的aav基因组拷贝数(g.c./细胞)和每个细胞的egfp转录量(egfp/细胞)，计算每个基因组拷贝的egfp转录量(egfp/g.c.)。在表2中显示相对于野生型aav2的结果的结果。[表2]g.c./细胞egfp/细胞egfp/g.c.aav2111aav2(a68v)1.74.32.5aav2(a3t/y6h/a68v)1.118.016.8g.c.=基因组拷贝。至于每个细胞的aav基因组拷贝数(g.c./细胞)，每种aav2突变体显示不超过野生型aav2的值的2倍的值，并且没有大的差异。该结果表明aav的感染效率和基因转移效率在野生型aav2和aav2突变体之间差异不大。然而，至于每个细胞的egfp转录量(egfp/细胞)和每个基因组拷贝的egfp转录量(egfp/g.c.)，aav2(a68v)和aav2(a3t/y6h/a68v)两者均与野生型aav2相比显示高值。具体地，aav2(a3t/y6h/a68v)显示非常高的值，其中每个细胞的egfp转录量(egfp/细胞)和每个基因组拷贝的egfp转录量(egfp/g.c.)分别是野生型aav2的egfp/细胞和egfp/g.c.的18.0倍和16.8倍。这些结果显示，引入靶细胞的基因的转录效率高，且因此每个细胞的外源基因的转录量也高。换言之，提示了通过使用例如aav2(a3t/y6h/a68v)可以在靶细胞中有效转录和表达外源基因。产业适用性根据本发明，提供了腺相关病毒(aav)衣壳蛋白的突变体。本发明的aav衣壳蛋白突变体尤其可用于将基因引入靶细胞和/或在靶细胞中表达转基因。序列表自由文本seqidno:1：编码aav2vp1的核苷酸序列seqidno:2：aav2vp1的氨基酸序列seqidno:3：编码aav2vp1(a68v)的核苷酸序列seqidno:4：aav2vp1(a68v)的氨基酸序列seqidno:5：编码aav2vp1(a3t/y6h/a68v)的核苷酸序列seqidno:6：aav2vp1(a3t/y6h/a68v)的氨基酸序列seqidno:7：paav-ad-acg2的核苷酸序列seqidno:8：突变体-1f引物的核苷酸序列seqidno:9：突变体-1r引物的核苷酸序列seqidno:10：突变体-2f引物的核苷酸序列seqidno:11：突变体-2r引物的核苷酸序列seqidno:12：paav-cb-egfp的核苷酸序列seqidno:13：itr-f引物的核苷酸序列seqidno:14：itr-r引物的核苷酸序列seqidno:15：仓鼠-肌动蛋白-f引物的核苷酸序列seqidno:16：仓鼠-肌动蛋白-r引物的核苷酸序列seqidno:17：egfp-f引物的核苷酸序列seqidno:18：egfp-r引物的核苷酸序列。当前第1页12