用作疫苗的在衣壳蛋白中包含缺失的黄病毒科突变体的制作方法

专利名称：用作疫苗的在衣壳蛋白中包含缺失的黄病毒科突变体的制作方法
用作疫苗的在衣壳蛋白中包含缺失的黄病毒科突变体本发明涉及用于疫苗的突变的黄病毒科(flaviviridae)。黄病毒科包括3个属黄病毒属(flavivirus)、瘟病毒属(pestivirus)和丙型肝 炎病毒属(hepacivirus)。黄病毒属主要包括通过蚊子或蜱(tick)传播的病毒，其中许多是人的，以及也是 动物的重要病原体。特别重要的是黄热病(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、登革热(Den)病 毒的4个血清型、蜱传脑炎(TBE)病毒以及最近也在北美作为人和各种鸟类的病原体出现 的西尼罗(WN)病毒。瘟病毒属包括具有巨大经济重要性的动物病原体，即猪瘟(classicalporcine fever, CPF)病毒、牛病毒性腹泻(BVD)病毒和边界病病毒(borderdisease virus，BDV)。丙型肝炎病毒属包括不同亚型的丙型肝炎病毒(HCV)和相关病毒。将这3个属组合在黄病毒科中，因为该科的所有代表病毒具有几乎完全相同的基 因组结构并且在许多结构和功能特性方面显示一致性。所有黄病毒是包含具有mRNA极性 的单链RNA分子(作为基因组)的相对小的包膜病毒。基因组具有长开放阅读框，其以多 蛋白(polyprotein)的形式编码所有蛋白质。单独的成熟病毒蛋白质通过病毒和细胞蛋白 酶的活性形成。单独的病毒蛋白质在基因组中的排列对于所有黄病毒都是相同的，并且在 5'末端始于衣壳蛋白、表面蛋白和一系列非结构蛋白，其最后的蛋白是病毒聚合酶。作为 独特的特征，瘟病毒还在衣壳蛋白之前包含自体蛋白酶(autoprotease)。黄病毒的核壳体 (nucleocapsid)只由1个单个的病毒蛋白即衣壳蛋白组成，并且包围病毒基因组。对于良好重叠的西尼罗病毒(Dokland等人，2004 ；PDB acc. 1SFK)和登革热病毒 (Ma等人，2004 ;PDB acc. 1R6R)，大多数衣壳蛋白的确切三维结构是已知的。此外，另外的 黄病毒科衣壳蛋白的氨基酸序列具有许多相关性，因而存在许多结构相似性。相同属的代 表病毒中的相似性自然地将比不同属的代表病毒之间的相似性甚至更大。在所有情况下， 衣壳蛋白是具有大约100至190个氨基酸的长度的相当小的蛋白质。其具有罕见地高比例 的碱性氨基酸，即高比例的氨基酸赖氨酸和精氨酸。推测碱性氨基酸对于与病毒RNA的相 互作用非常重要(Khromykh和Westaway，1996)。此外，所有黄病毒衣壳蛋白还具有特征性 疏水部分。这样的疏水部分总是由羧基末端的大约20个氨基酸形成。该部分用作基因组 序列中的表面结构蛋白的内部信号序列。通过在蛋白质合成期间被整合在内质网的膜中的 该信号序列，衣壳蛋白最初被锚定在膜中。后来，锚被蛋白水解切割。此外，还存在内部疏 水部分。在黄病毒属的代表病毒中，已描述了内部疏水结构域的功能重要性(Markoff等 人1997)。该作者已指示一系列黄病毒的该结构域的边界如下登革热病毒1 :46-67，登革 热病毒2 =46-66,登革热病毒3 =46-67,登革热病毒4 =45-65,日本脑炎病毒46_62，西尼罗 病毒46-62，墨累谷脑炎病毒(Murray Valleyenc印halitis) :46_62，圣路易士脑炎病毒 (Saint Louis encephalitis) :45_61，黄热病病毒43_58，兰力口特病毒(Langat) -.42-54, 波瓦森病毒(Powassan) =40-52, TBE病毒42-54。同样对于丙型肝炎病毒，已鉴定了功能 上重要的内部疏水结构域(Hope和McLauchlan，2000)，其从氨基酸119延伸至145，特别地 从125延伸至144。同样，瘟病毒也具有主要是疏水特征的短内部部分。
已成功地使用疫苗抗一些黄病毒。因此，存在抗YF病毒、JE病毒和CPF病毒的活 疫苗，并且使用灭活的疫苗抗JE和TBE。考虑到黄病毒在人和兽医学中的巨大重要性，存在 对开发新的和改进的疫苗的高度需要。一系列减毒黄病毒是已知的，其减毒作用基于基因组的不同区域中的突变。已在 天然发生的，通过在实验室中进行系列病毒传代获得的，通过在中和抗体存在的情况下选 择突变体制备的，或通过在重组克隆技术的帮助下靶向地导入突变而制备的株系中观察到 减毒突变。存在几种黄病毒的感染性cDNA克隆，并且本领域技术人员了解制备此类克隆的 方法。在此类感染性cDNA克隆的帮助下，根据现有技术，可将突变特异性地导入黄病毒的 基因组。在下列基因组的区段中发现已知的使黄病毒减毒的突变包膜蛋白大多数观察到的减毒突变涉及包膜蛋白E(黄病毒属)(综述于 McMirm，1997 ；新的例子，Mandl等人，2000)。同样，已描述了蛋白E (rns)(瘟病毒属)中的 减毒突变(Meyers等人，1999)。非结构蛋白=Kimjin病毒的蛋白NSl中的点突变导致延迟的复制，从而导致减毒 (Hall 等人，1999)。还描述了蛋白 NS3 (Butrapet 等人，2000)和 NS5 (Xie 等人，1998)中的
减毒突变。非编码基因组区段已描述了通过3'末端非编码区中的缺失对TBE病毒进行的 减毒(Mandl等人，1998)。对于登革热病毒，已制备了在5'和3'非编码区中都具有缺失 的实验性疫苗(Lai等人，1998)。推测此类病毒的减毒的分子基础是此类突变对病毒复制 的不利作用。EP 1373478B1描述了在衣壳蛋白中具有缺失的减毒黄病毒。本发明的目的是提供减毒黄病毒，其在衣壳蛋白内，特别地只在病毒衣壳蛋白的 一个部位上具有最少位点的突变，其能够在细胞培养物中传代并且抗至毒力表型的回复。该目的通过权利要求的主题来实现。特别地，本发明提供了黄病毒科的突变体病 毒，其在衣壳蛋白中包含至少20个连续氨基酸的缺失，除了与缺失相邻的氨基酸(其可被 置换)外，再无任何另外的缺失、置换或插入突变。因此本发明的衣壳蛋白只包含一个改变 的部位，即至少20个氨基酸的相对大的缺失。邻近该缺失的氨基酸可能是氨基酸置换突变 的对象(subject)。这可通过编码衣壳蛋白的核苷酸水平上的缺失引起。核苷酸的一个缺 失不需要一定是编码氨基酸缺失的核苷酸三联体的缺失。任一端上1个或2个核苷酸的偏 移是可能的，然而其余的序列仍必须符合读框。这意味着缺失可能在缺失的5'端移去1个 核苷酸，同时保留1个额外的核苷酸紧接与缺失的读框相邻的3'末端三联体。在该情况 下，新的5'三联体(未缺失的)将保留紧邻缺失的5'三联体的前2个核苷酸和来自缺失 的3'末端的1个核苷酸(编码最后一个缺失的氨基酸的最后一个核苷酸)。这可导致紧 接缺失的衣壳氨基酸序列的置换突变，虽然在核苷酸水平上只有1个缺失(甚至无任何置 换)发生。当然另外的组合也是可能的，其中5'(未缺失的)三联体缺少2个核苷酸并且 接受2个来源于缺失的3'末端的核苷酸，或在缺失的3'末端除去1或2个核苷酸并且通 过缺失的5'末端进行补充。从而，对于剩余的核苷酸序列，未发生移码。本发明可用于黄病毒的所有代表病毒。因此在本申请的范围内，除了在明确地指 出只表示黄病毒属的代表病毒的情况下外，术语“黄病毒”涉及黄病毒科的所有代表病毒。
5优选病毒是黄病毒(属)、瘟病毒或丙型肝炎病毒，特别地节肢动物传播病毒，在特别优选 的实施方案中，蚊媒病毒。通过其实现本发明的黄病毒的特别优选的代表病毒选自黄热病 病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的4个血清型、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、墨累谷脑炎病 毒、圣路易士脑炎病毒、波瓦森病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病病毒和丙型肝炎 病毒。由于它们的已知的对人和动物的致病性，此类代表病毒特别适合于本发明，因为对于 这些代表病毒，对合适的减毒活疫苗的需求特别高。特别优选的病毒是西尼罗病毒、日本脑 炎病毒和登革热病毒。虽然已在现有技术中描述了一系列减毒黄病毒，并且虽然EP 1373478B1将衣壳 蛋白中的缺失描述为用于黄病毒的有利的减毒原则，但令人惊讶的是根据本发明的包含大 的衣壳蛋白缺失的黄病毒导致黄病毒的可靠的减毒，可在细胞培养物中有效地产生，并且 可用作黄病毒活疫苗。尽管具有根据本发明的实质性衣壳蛋白突变，但在以活疫苗的形式 施用根据本发明的病毒后，减毒病毒的繁殖可在接种疫苗的受试者中发生。这导致一系列 优于灭活疫苗的有利方面。特别令人惊讶的发现是根据本发明的黄病毒突变体能够在细胞培养物中传代。在 细胞培养物中有效地传代活疫苗的能力可代表关于这样的疫苗的低成本生产、扩增和繁殖 的决定性有利方面。此外，根据本发明的黄病毒突变体在安全性和调控要求方面也特别有 利，因为它们可在已批准的细胞系中生产，并且不需要可能构成安全隐患的动物繁殖系统。此外，根据本发明的突变体特别抗至毒力表型的回复，从而十分适合在人中广泛 应用。特别地发现，虽然至少20个氨基酸的缺失对于大约100至180个氨基酸的衣壳蛋白 来说是很大的，但可获得能够在细胞培养物中传代的稳定病毒，从而该病毒可被有效地产 生而无需特定或脆弱的(fragile)繁殖方案和/或无需在衣壳蛋白中的其他位置上导入另 外的突变。因此，本发明具有显著优于之前描述的活疫苗形式的有利方面 更长的缺失强有力地增加安全性，因为回复至毒力表型的野生型序列的危险与 缺失的长度呈负相关， 只导入单个缺失突变而无需选择另外的突变是产生黄病毒活疫苗的更简单和 更直接的方法，和 在细胞培养物中传代活疫苗的能力对于疫苗生产是有利的并且允许以细胞培 养物生长的病毒颗粒的形式应用。术语“能够在细胞培养物中传代”在本文中用于定义病毒突变体有效地感染细胞 系并且在此类细胞的培养物中扩增和传播的特征。可如下所述选择合适的细胞系。来自此 类细胞培养物的上清液可用于感染新培养的细胞，即此类活疫苗可在细胞培养物中传代。术语“活疫苗”，如本文中所使用的，是指病毒疫苗的病毒颗粒、组分或核酸能 够在宿主中进行自我扩增和体内蛋白质表达。活疫苗的该定义包括感染性颗粒、单轮 (single-round)感染性病毒样颗粒和自我复制核酸(复制子)。所有此类制剂，作为共同 的特征，将在宿主中自我扩增和体内产生病毒组分(核酸和蛋白质)，从而如在野生型病毒 感染的过程中一样类似地刺激先天和适应性免疫应答。此外，包括能够在细胞培养物中传 代的活疫苗的亚组(如上文中定义的)。活疫苗的定义排除所有非复制型疫苗，即灭活疫 苗、亚单位疫苗(即通过从感染性病毒分离或通过重组表达而制备的病毒的蛋白组分)和
6由不能自我复制的DNA或RNA组成的非复制型核酸疫苗。术语“感染性”或“感染性的”在本文中用于描述病毒颗粒或核酸在合适的宿主细 胞中起始自我扩增的能力。因此“感染性”或“感染性的”描述过程而非特性，因为其取决 于感染剂或组分的和宿主细胞的性质以及将试剂/组分导入宿主细胞内的模式。例如，病 毒颗粒可以对于一些细胞是感染性的，但对于其他细胞不是感染性的。一些核酸，如果被适 当地转染(例如通过电穿孔或基因枪轰击)入在其中它们起始自我复制的周期的细胞，则 是感染性的，但在进行不适当的接种模式后可能不是感染性的。亚病毒颗粒可以是“单轮感 染性的”，即只能够介导自我复制型核酸进入宿主细胞1次。“减毒”或“减毒的”，如本文中所使用的，是指病毒毒力的减小。毒力定义为病毒 在特定宿主中引起疾病的能力。因此术语“减毒的”是“较少致病性的”或有时“非致病性 的(apathogenic) ”的同义词。术语“活力(viability)”在现有技术中频繁地用于病毒活疫苗的背景中。然而， 因为病毒不是自主生存的生物，而是可通过合适的宿主细胞扩增的化学结构，因此，术语活 力未被明确定义，从而避免在本发明的说明书中出现。在更广泛的意义上，病毒活力是指病 毒颗粒、组分或核酸在宿主细胞中进行自我扩增的能力。例如，在EP 1373478B1中，术语活 力以该更广的意义使用。在所述更广的意义上，术语活力与本文中定义的活疫苗的定义同 意。在更严格的意义上，病毒活力还可指“能够在细胞培养物中传代”，如本文中定义的。为了制备常规灭活疫苗，必需产生大量感染性和有毒力的病毒。同样对于重组制 备的灭活疫苗，必须产生和纯化大量抗原。对于活病毒，要产生的量显著更小，因为病毒蛋 白质和核酸可在接种疫苗的受试者的体内产生，由此活疫苗的生产成本一般显著低于灭活 疫苗的生产成本。此外，不产生有毒力的病毒，而产生非致病性病毒，从而生产不牵涉健康 风险。常规的灭活黄病毒疫苗通过用福尔马林处理灭活感染性颗粒(从而引起抗原结构的 某些变化)来制备。在接种疫苗的受试者中，主要诱导对其抗原结构不完全相应于天然形 式的结构蛋白的体液免疫应答，但不诱导对非结构蛋白(然而其重要性对于长效免疫的建 立和细胞毒性T细胞的形成非常高)的免疫应答。除了缺失以外，本发明的病毒在衣壳蛋 白内不包含另外的突变，从而剩余的未修饰的病毒蛋白和未修饰的部分是刺激免疫系统的 优良的细胞靶。本发明的减毒黄病毒，特别地根据其优选实施方案的减毒黄病毒，还具有优于用 于疫苗的常规黄病毒和通过基因工程方法制备的实验性活疫苗的另外的有利方面将目前使用的黄病毒活疫苗在实验室中正常传代许多次，这将导致许多突变，所 述突变对于此类病毒的生物学的具体意义仍未完全弄清楚并且其各自对此类病毒的减毒 的贡献以及单独的减毒突变之间的相互作用仍未完全了解(关于JE，参考Nitayaphan等 人，1990 ；关于YF,参考Post等人，1992 ；关于CPF，参考Bjorklund等人，1998)。一些突变 也位于对于免疫应答特别重要的抗原例如表面蛋白E中。因此，某些抗原决定簇，与野生型 病毒相比较，以改变的形式存在。此类病毒的减毒作用的遗传基础的复杂性不允许将构成 减毒的基础的原理直接用于其他黄病毒。相反，在根据本发明的突变的病毒中，只将明确的且通常可应用的减毒突变导入 衣壳蛋白，从而不必改变对于免疫应答特别重要的蛋白质(包膜蛋白或某些非结构蛋白例 如黄病毒属中的NSl)。根据本发明的病毒的优选实施方案从而不包含任何另外的突变，特
7别地不在包膜蛋白中以及参与免疫应答的其他蛋白中包含任何另外的突变。如已在上文中提及的，已描述了一系列遗传工程改造的减毒黄病毒，其中减毒基 于点突变。为此，其相对易于遗传回复。同样，也已描述通过点突变减毒的病毒通过第二点 突变回复至毒力表型(Mandl等人，2000)。相反地，在根据本发明的病毒中，通过缺失实现 减毒，其至野生型的回复是不可能的。在其他已描述的情况下，减毒基于对于免疫应答非常重要的包膜蛋白或对于复制 和翻译非常重要的基因组区段中的变化。如果要引发尽可能天然和高效的免疫应答，那么 包膜蛋白的抗原结构中的变化和对复制或翻译的实质性不利影响都是不想要的。此类不利 方面可通过本发明来克服，其中只改变内部结构组分，而不改变任何包膜蛋白、非结构蛋白 或调控性非编码区段。在另外的设置中，通过组合不同病毒(嵌合病毒)来制备病毒(Guirakhoo等人， 2000)。因为嵌合病毒是其中以非天然发生的方式将致病病毒的基因彼此重新组合的生物， 所以通过疫苗接种释放此类病毒具有此类嵌合病毒发展成其性质不可预测的新型病毒的 风险。相反地，新型病毒不构成不同病毒基因组的组合，从而通过疫苗接种进行的释放不可 能引起迄今为止非天然发生的病毒种类的形成。对于本领域技术人员来说，通过使用本身已知的方法，例如借助于重组技术(而 无需过度的实验负担)将本发明的缺失导入黄病毒的衣壳蛋白是可能的。编码各衣壳蛋白 的基因区段对于迄今为止已获得其基因组序列的所有黄病毒是已知的，并且对于新型黄病 毒序列，可通过序列比较容易地确定所述基因区段。当然，在该情况下缺失不得导致阅读框 架的任何偏移以使羧基端疏水区不受到缺失影响。使该羧基末端疏水区在很大程度上得到 维持从而不受缺失影响是必需的。通过使用所述技术，可能繁殖具有以天然形式形成的所 有病毒蛋白质(除了衣壳蛋白外)的突变的感染性病毒。此类病毒的复制和翻译因而将不 受或基本上不受限制。通过在细胞培养物中繁殖，可从可用作疫苗的此类病毒产生制剂。与 未经改变的野生型病毒相反，根据本发明的病毒，在被接种入合适的宿主生物后，展示减毒 的表型，即它们不引发疾病。然而它们诱导特异性免疫应答的形成。用本发明的黄病毒活 疫苗免疫的宿主生物将获得保护而免受随后有毒力的野生型的感染，即与不受保护的生物 相反，由野生型病毒引发的疾病将不发生。如果注意到借助于其可在适合作为疫苗的突变体的制备中提高疫苗的性质的许 多特征，本发明的衣壳蛋白区域中的缺失将特别适合用于制备适合作为活疫苗的病毒突变 体。为了制备合适的减毒的免疫原性病毒且无回复至毒力病毒类型的风险，根据本发明提 供的缺失大于20个氨基酸。本发明的黄病毒衣壳蛋白的缺失还可包含更大的缺失，特别地至少21个，优选至 少 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36 或至少 37 个连续氨基酸的缺失。在 特定的实施方案中，为了允许在细胞培养物中有效繁殖，从而使得能够稳定地产生并且程 度较低地修饰病毒衣壳，上限是48个缺失的氨基酸。因此本发明涉及具有多至47个，优选 多至46、45、44、43、42、41、40、39、38、37或多至36个氨基酸的缺失的黄病毒衣壳蛋白。优选，缺失可达到远至离氨基端20个氨基酸和/或远至正好在羧基末端信号序列 的起始之前。特别地，病毒能够在细胞培养物中传代并且，优选在至少2次传代后是稳定的。本文中使用的稳定性是指遗传稳定性，特别地衣壳蛋白的遗传稳定性。选择除了本文中定义 的缺失外不表达另外的突变的病毒。在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10次传代后病毒 可以是遗传上稳定的。黄病毒的单个病毒衣壳分子包含4个α螺旋，从而形成在一层中具有α螺旋1， 在中间层中具有螺旋2和在第三层中具有螺旋4的三层结构。α螺旋3用作间隔子。该衣 壳形成二聚体，所述二聚体接着再次二聚化成四聚体。对于该装配，螺旋1和4比螺旋2和 特别地螺旋3更重要。因此，缺失优选发生在这些中间螺旋2和3中。在一个实施方案中， 缺失整个螺旋α 2和α 3。螺旋4的N端也可受到缺失的影响。在本发明的优选实施方案 中，缺失螺旋α 2的C末端部分、完整的螺旋ci3和螺旋ci4的N末端部分。螺旋α2和4 的剩余部分可形成融合螺旋，从而形成两层而非三层。因此，在特定实施方案中，缺失包括 野生型病毒衣壳蛋白的α螺旋2的至少1个氨基酸，优选螺旋2的至少三分之一的氨基酸， 更优选螺旋2的至少一半的氨基酸。在一个实施方案中，缺失包括螺旋2的C末端氨基酸。 在另外的实施方案中，缺失包括野生型病毒衣壳蛋白的α螺旋3的至少1个氨基酸，优选 螺旋3的至少三分之一的氨基酸，更优选螺旋3的至少三分之二的氨基酸，最优选整个螺旋 3。在特定实施方案中，缺失包括野生型病毒衣壳蛋白的α螺旋4的至少1个氨基酸，优选 螺旋4的至少三分之一的氨基酸，更优选螺旋4的至少一半的氨基酸。在一个实施方案中， 缺失包括螺旋4的N末端氨基酸。优选螺旋1不受缺失影响，和/或至少三分之一，优选至 少三分之二或四分之三的螺旋4的氨基酸不受缺失影响。在优选实施方案中，衣壳蛋白的羧基末端疏水区不受缺失影响一根据本发明的 缺失不包括衣壳蛋白的羧基末端疏水区。已知该序列是在基因组上毗邻编码的包膜蛋白 的正确形成所必需的，并且其通过蛋白水解切割从成熟衣壳蛋白除去。该信号序列的长度 在个体黄病毒之间是变化的，然而其可通过建立亲水性分布图(hydrophilicity profile) (参见

图1)来容易地确定。因此，在优选实施方案中，根据本发明的缺失不包括该羧基末端 区域。羧基末端疏水区至少涉及该区域内具有-1和更少的亲水性评分(根据图1)的所 有氨基酸。特别优选地，具有低于0的亲水性的C末端区域(根据图1)保持未变。根据本发明的优选缺失涉及内部疏水结构域的区域。根据图1，可以看到所有黄病 毒的衣壳序列，除了上述在羧基端上的疏水信号序列外，还包含在另外地具有显著亲水性 的氨基酸链的中间的具有显著疏水特征的部分。使此类内部结构域的区域部分或完全除去 的缺失将产生特别合适的减毒黄病毒活疫苗。至少所有在图1中具有负的亲水性评分的此 类区域可被当作“内部疏水结构域”。在图2中，针对许多黄病毒，表征在根据本发明的病毒中可至少部分地缺失的特 别优选的疏水区。这些区域可通过计算各个氨基酸序列的疏水性分布图来确定。已使 用Kyte和Doolittle的算法(1982)(使用的窗口大小为5)计算图2中下划线标示的区 域。备选地，还可使用5至13个氨基酸残基的窗口大小，或通过其他算法例如Hopp和 Woods (1981)的算法(其中通常可选择3至11的窗口大小)来计算疏水区。按照Kyte和Doolittle (1982)的算法(使用9个氨基酸残基的窗口大小)或 Hopp和Woods (1981)的算法(使用7个氨基酸残基的窗口大小)分别计算根据图1的亲 水性图谱(hydrophilicity blot)。优选的疏水区选自下列登革热病毒1 :46_67，登革热病毒2 :46-66，登革热病毒3 :46-67，登革热病毒4 =45-65,日本脑炎病毒46_62，西尼罗病 毒46-62，墨累谷脑炎病毒46-62，圣路易士脑炎病毒45_61，黄热病病毒43_58，兰加特 病毒42-54，波瓦森病毒40-52, TBE 病毒42_54 和 HCV 119-145，特别地 125-144。与缺失相邻的可允许的置换突变优选选自点突变，通过该点突变，衣壳蛋白的疏 水性得到增强。特别优选的点突变包括带电荷的或亲水性氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨 酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、丝氨酸等)各自至极性 较小的氨基酸或非极性氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬 氨酸等)的交换。可将根据本发明的衣壳蛋白C中的缺失突变与黄病毒基因组中其他地方(编码衣 壳蛋白C的基因的外部)的突变组合，例如以进一步调整活疫苗的减毒表型。在另外的方面，本发明还涉及包含上文中定义的病毒的药物组合物，优选疫苗。药 物组合物，特别地具有活黄病毒的那些，可用作用于免疫目的的活疫苗。在根据本发明的组合物中，对于有效免疫只需要少量的病毒，从而对于根据本发 明的组合物，每施用IO1至107，优选IO2至106，特别地IO3至IO5个黄病毒感染单位是足够 的。优选，可以以该量的感染单位(作为单次剂量)施用疫苗。优选，根据本发明的组合物还包含活性物质或辅助物质。特别优选的是抗生素 例如新霉素或卡那霉素、防腐剂例如硫柳汞、和稳定剂例如人白蛋白、乳糖-山梨醇、山梨 醇-明胶、聚明胶肽或盐例如MgCl2或MgSO4W添加。一般地，优选氨基酸、多糖和(缓冲) 盐可用作添加剂。在根据本发明的活疫苗的制备中，如果其将要施用给人，那么推荐的是使用非转 化宿主细胞，因为通过该方式，可避免性质变化(例如新的不期望的突变的容易导入)的风 险和由此类细胞的组分造成的污染的风险。本发明还涉及编码根据本发明的突变病毒的衣壳蛋白的核酸(其优选是分离或 纯化的)。优选，所述核酸分子在宿主中自我复制并且除了编码衣壳蛋白的核酸序列外，可 包括RNA复制和病毒体形成所必需的黄病毒基因组的所有其他核酸。如上文中所述，编码 衣壳蛋白的核酸，与野生型病毒核酸相比较，可以只包含一个缺失，该缺失还可导致与缺失 相邻的置换。相邻的氨基酸或其编码三联体之后，没有发生移码。类似地，本发明还提供了 突变病毒本身的衣壳蛋白(其优选为分离或纯化的形式)。还可以以药物组合物优选疫苗 的形式提供此类核酸或蛋白质。除了核酸以外，这样的核酸或蛋白质制剂(特别地其为疫苗形式时)还可包含 氨基糖苷抗生素例如新霉素或卡那霉素，如由FDA对质粒疫苗所推荐的。在现有技术中， 已描述了完整系列的最多样化的策略，其使用“裸露”核酸(参见，例如，WO 90/11092，WO 94/29469，WO 97/47197，其通过引用合并入本文，脂质体介导的核酸转移，优选使用(优选 生物可降解的)微球体进行的核酸转移，......)或其组合或混合物进行疫苗接种。可制备活病毒组合物以及核酸或衣壳亚单位组合物和/或将所述组合物用于黄 病毒科病毒感染的治疗或预防。“预防”不应当理解为绝对意义(即阻止任何进一步的黄病 毒感染的发生)，而应当理解为减小黄病毒感染的风险的预防性用途的意义。组合物将导致 免疫系统的体内刺激和免疫。最后，本发明还涉及产生本发明的修饰病毒的方法，其特征在于下列步骤
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提供黄病毒或黄病毒核酸，其中黄病毒或黄病毒核酸编码上文中定义的具有缺 失的衣壳蛋白， 在合适的宿主细胞中繁殖黄病毒或黄病毒核酸，和 回收由宿主细胞繁殖的病毒颗粒。本发明还涉及产生根据本发明的修饰核酸的方法，其特征在于下列步骤 提供编码上文中定义的具有缺失的衣壳蛋白的黄病毒核酸， 将核酸插入合适的载体， 用载体转化合适的宿主细胞， 在所述宿主细胞中扩增核酸， 从宿主细胞回收核酸。编码上文中定义的具有缺失的衣壳蛋白的黄病毒核酸可以是DNA或RNA，其可通 过使用本领域内已知的合适的反向遗传系统或核酸合成系统来提供。合适的宿主细胞是例 如大肠杆菌(E.coli)。可将从宿主细胞回收的核酸转录成RNA。此外，还可进一步分离或纯化核酸或衣壳蛋白，将其配制于药物组合物优选疫苗 中。优选的宿主细胞选自鸡胚胎细胞、原代鸡胚胎细胞、人二倍体细胞系(例如 WI-38、MRC-5)、Vero细胞、CHO细胞、HEK293细胞、PER. C6 细胞、原代仓鼠肾细胞、原代犬 科动物肾细胞或二倍体胎儿恒河猴肺细胞。最优选的是Vero细胞，特别地ATCC CCL-81，和 BHK-21 细胞。可基于此类细胞对野生型病毒株系的感染的易感性来选择用于产生疫苗的宿主 细胞系。因为假定野生型与疫苗株系(在根据本发明的疫苗的情况下)的感染过程是相同 的，因此产生疫苗的宿主细胞可选自本领域技术人员已知的产生大量相应的野生型病毒的 细胞或该性质可利用公知的病毒学技术例如生长曲线分析、病毒滴度的测定和病毒蛋白质 释放的定量来容易地评估。本发明将通过下列实施例以及通过附图(然而，本发明不应限定于所述实施例以 及附图)来进行更详细地解释。附图图IA-C显示黄病毒科的3个属的每一个属的3个代表病毒的衣壳蛋白的亲水性 分布图。负值表示具有显著疏水性特征的区域。羧基末端疏水区是在基因组中跟随的包膜 蛋白的信号序列。对于各蛋白质，已例如根据Kyte和Doolittle (1982)的算法(使用9个 氨基酸残基的窗口大小)(上部)(一次)和根据Hopp和Woods (1981)的算法(使用7个 氨基酸残基的窗口大小)(下部)(一次)计算和说明了亲水性。图2显示黄病毒科的3个属的每一个属的3个代表病毒的衣壳蛋白的序列比对。 具有显著疏水特征的(根据Kyte和Doolittle，使用5的窗口大小确定的)序列部分已用 下划线标示。在该情况下，各个最靠近羧基末端排列的部分代表随后的包膜蛋白的信号序 列。在该部分中，不得存在任何缺失。其他(内部)疏水性部分代表用于减毒缺失的优选 区域。与下列图不同，显示的序列不具有位点1上的M。图3显示突变体⑶36和⑶37的特征(A至F)。用指定的病毒制剂以1的MOI感染 大约IO6个Vero细胞。将野生型病毒和感染培养基分别用作阳性和阴性对照。(A)在指定
11的时间点上通过实时PCR测量RNA的复制。(B)通过实时PCR监控突变体⑶36和⑶37的 RNA输出动力学。(C)计算48小时时间点上的输出的RNA对总RNA(细胞内+细胞外RNA) 的百分比。(D)通过血凝测定(haemagglutination assay)估量病毒颗粒至上清液内的释 放。(E)使用相同样品的上清液，通过CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega)估量 细胞毒性。代表破裂细胞的LDH释放的各OD49tl值示于左边。(F)显示WNV衣壳缺失突变体 ⑶37和⑶36的特异性感染性。通过测定病毒储备制剂中RNA(实时PCR)对感染单位(病 灶测定(focus assay))的比计算第二位点突变体的特异性感染性(表1)。显示两个独立 实验的对数平均值；误差棒表示标准差。FFU(病灶形成单位(focus forming units))。图4显示野生型(A)、缺失突变⑶10和⑶36 (B)以及缺失突变⑶7/3和⑶37 (C) 的序列的二级结构预测。在(A)中，显示了 WNV V76/1序列的二级结构预测和疏水性图谱。 只显示也存在于Kunjin蛋白C晶体结构中的残基R23至R98。在⑶和(C)中，举例说明 了野生型序列和突变体序列上的缺失(开放框)。此外，还显示所得的截短的序列(下图)， 同样地显示相应的疏水性图谱(在每一个突变体的下方)。使用PsiPred进行所有二级结 构预测，根据Kyte和Doolittle的算法产生疏水性图谱。Wt，野生型。图5(A)显示与晶体结构相比较，WNV的Kunjin亚型的二级结构预测(Dokland， Τ.等人，2004)。使用PsiPred (Jones，D. Τ.，1999)进行二级结构预测；只分析也存在于晶体 结构中的残基R23至R98。二级结构预测(Pred)示于中间，置信值列于顶部(Conf ;9高，O 低)。相应的氨基酸序列(AA)列于下面；此外，在氨基酸序列内，参与晶体结构内螺旋形成 的残基以斜体和粗体字突出显示。如晶体结构中一样命名4个螺旋，S卩α-l至α-4。(B) 显示用于本发明的WNV分离株即WNV ΝΥ99的二级结构预测。与(A)不同，氨基酸序列始 于起始子(initiator) M并且还包括C末端信号序列(G105-A123，以下划线标示)。(C-F) 显示衣壳缺失突变体⑶7/3、⑶37、⑶10和⑶36的二级结构预测。为了清楚的目的，以粗 体突出显示缺失后融合的氨基酸；此外，与野生型序列(A和B)不同，只显示融合残基的编 号。(G-H)分别显示突变体CD48和CD48重复(duplication)的二级结构预测；CD48重复 通过残基M16-E39/L88-A94的重复从⑶48产生。各自的残基分别以深灰色和浅灰色突出 显示。此外，预测形成卷曲螺旋的残基以下划线标示，通过缺失或复制融合的残基以粗体突 出显示。H，螺旋；C，卷曲；E，延伸的(β-链/折叠)。图6 (A)显示WNV ΝΥ99和WNV亚型Kunjin的衣壳蛋白序列的比对。使用 BLAST (Altschul, S. F.等人，1997)进行分析，并且将分析限定于也存在于晶体结构中的残 基(Dokland，Τ.等人，2004)。(B)显示WNV ΝΥ99的衣壳蛋白序列与登革热病毒2衣壳蛋 白的比对；如(A)中所述进行分析，并且将分析限定于残基Ν15至R98。按照WNV ΝΥ99的 序列进行编号。Cons.，共有序列。图7显示WNV衣壳蛋白中的突变。(A)分别在突变体⑶10和⑶7/3传代后鉴定的 大缺失CD36和CD37。衣壳蛋白的螺旋部分由框标示，并且螺旋o2以灰色突出显示。大缺 失的位置由箭头标示。此外，构建人工大缺失突变体(即⑶48)，其缺少已在⑶36和⑶37 中自发缺失的所有残基。精确的核苷酸缺失示于右边。(B)大缺失突变体的免疫荧光分析。 将大缺失(即⑶36、⑶37和⑶48)工程改造入感染性cDNA克隆，通过用指定的野生型或突 变体体外转录的RNA转染BHK-21细胞来检测突变体。CD36 (左)、CD37 (中)、CD48 (右)。 作为对照，使用模拟(mock)转染的细胞。转染后48小时，使用抗JEV蛋白E的多克隆抗体，通过免疫荧光染色显现细胞内蛋白E的表达，所述多克隆抗体可与WNV蛋白E交叉反应。使 用抗兔FITC-缀合物作为二抗。实施例实施例1 削弱的WNV衣壳缺失突变体的构建和具有大缺失的能够在细胞培养物 中传代的突变体的选择。实验方法细胞和病毒。将Vero(ATCC CCL-81)细胞培养在补充有10%胎牛血清(FBS，PAA)、 1. 5%谷氨酰胺(200mM, Cambrex)和青霉素/链霉素(10，000U/ml青霉素，10mg/ml链 霉素，Sigma)的Eagle' s最低必需培养基(EMEM，Cambrex)中。在2%而非10% FBS存在 的情况下进行感染。如Kofler，R.M.等人(2002)中所述，在生长培养基(补充有5%FBS，
谷氨酰胺，0. 5%新霉素(10mg/ml，Sigma)的EMEM)和维持培养基(补充有FBS，1% 谷氨酰胺，0. 5%新霉素和15mM HEPES，pH 7. 4的EMEM)中操作用于体外转录的RNA的导入 的BHK-21细胞。用于本研究的WNV株系最初于1999年分离自New York City收集的死亡乌鸦(WNV NY99，由Ernest Gould和Bob Shope友好提供)。在其分离后，在构建感染性cDNA克隆之 前将病毒在Vero细胞中传代3次。WNV cDNA克隆的构建。如Mandl，C. W.等人(1997)所述，分离WNV RNA。通过利 用Roche Applied Science的cDNA合成试剂盒和适合用于涵盖整个WNV基因组的序列特 异性引物进行WNV cDNA的合成。使用包含PacI和NotI限制性位点的引物，通过PCR将 此类cDNA用于DNA片段的扩增。除了限制性位点外，用于扩增最5'-末端和最3'-末 端的引物分别包含T7转录启动子序列(Mandl，C. W.等人，1997)和编码丁肝病毒核酶的 序列(Varnavski, A. N.等人，2000)。将所有PCR片段克隆入已通过用多克隆位点(BspEI -Swal-PacI-NotI-SwaI-AatII)置换编码四环素抗性基因的BspEI-AatII片段进行修饰的 pBR322 (Bolivar, F.等人，1977)。在最终的装配步骤后，获得2个质粒，即包含T7转录启动子和WNV基因组的5' 三分之一的cDNA(bp 1至3339)的WNV-Kl和包含WNV基因组的3 ‘三分子二(bp 3282 至11029)，接着丁肝病毒核酶的WNV-K4。由于在两种质粒中存在唯一的BstEII位点 (3321/3326)，因此通过用BstEII酶促消化，然后体外连接两种质粒来产生用于体外转录 的全长DNA模板。在大肠杆菌DH5 α细胞中扩增所有构建体，通过对完整插入物的两条链进行完全 测序来表征所述构建体。WNV衣壳缺失突变体的构建。为了将缺失导入质粒WNV-Kl内的衣壳蛋白，使用 Gene Tailor定点诱变系统(Invitrogen)。从而，构建了分别缺少氨基酸F53至159和144 至F53的突变体CD7/3和CDlO。体外RNA转录和转染。如之前的研究(Elshuber，S.等人，2003 ；Kofler, R. M.等 人，2002)中所述，进行使用T7RNA聚合酶的体外转录(Ambion T7MegaScript转录试剂盒) 和使用电穿孔的BHK-21细胞的转染。在实时PCR分析中作为标准所需要的转录反应的情 况下，通过用DNA酶I在37°C下温育15分钟来降解已通过用BstEII消化WNV-Kl而产生的 模板DNA，然后通过使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)将RNA从未整合的核苷酸中纯化和
13分离出来。根据条带的强度估计RNA的浓度，或为了确定RNA的标准浓度，利用分光光度计 进行测量。免疫荧光染色。通过包膜蛋白的间接免疫荧光(IF)染色来测定WNV特异性蛋白 的细胞内表达。因此，将RNA转染的细胞接种入24孔板中并且供应生长培养基，在转染后 第20小时将所述生长培养基更换为维持培养基。在24或48小时后，用1 1丙酮/甲醇 处理细胞以进行固定和透化。为了特异性检测WNV E蛋白，使用抗日本脑炎病毒包膜蛋白 的交叉反应性多克隆抗体(稀释度1 50)。如厂商所建议的，使用荧光素-异硫氰酸酯缀 合的抗兔二抗(Jackson Immuno Research Laboratories)进行染色。血凝测定。为了检测感染细胞的上清液中的WNV病毒和/或亚病毒颗粒，应用基于 红细胞的凝集(其由与病毒包膜蛋白的相互作用诱导)的快速测定(Guirakhoo，F.等人， 1989 ;Clarke，D. H和Casals，J.，1958)。简而言之，在含有0. 4%的牛血清白蛋白(用于稳 定颗粒)的硼酸盐缓冲盐水(120mM氯化钠，50mM硼酸钠，pH 9. 0)中以1 1稀释病毒上 清液。然后，将该混合物进一步稀释以产生几何稀释行(geometrical dilution row)。将 50 μ 1的各稀释样品与相同量的0. 5%的鹅红细胞于圆底96孔板中混合，然后在室温下温 育3小时。病毒诱导的红细胞的凝集因缺乏沉降的红细胞而可见；通过目测进行板的检查。突变体的稳定性。为了测定转染的突变体的遗传稳定性，稀释转染细胞的上清液 直至达到感染性的终点。然后将相应于终点的上清液转移至新鲜细胞上，并且重复此类传 代至少2次。然后，分离RNA，通过使用Roche AppliedScience的cDNA合成系统和标准PCR 及测序方案进行序列分析。病毒储备液的产生。为了产生病毒储备液，如上所述将Vero细胞培养在生长培养 基中。使用细胞上清液(来源于用体外转录的突变体或野生型RNA转染的BHK-21细胞) 进行感染。然后，将感染的Vero细胞维持在其中已用牛血清白蛋白和15mM HEPES, pH 7. 4替换了 FBS的生长培养基中。在CPE开始后，通过低速离心(在Avanti JA-12转子 中在4°C，10，OOOrpm下进行30分钟)沉淀细胞碎片以澄清上清液，然后将上清液以等分 在-80°C下贮存。结果用两个部分cDNA克隆进行的感染性WNV的重建。为了产生WNV衣壳缺失突变体， 首先必需构建感染性WNV cDNA克隆。因此，如实验方法部分中所述，将WNV的基因组作为两 个部分cDNA克隆入质粒pBR322。从而产生两个质粒，分别包含WNV基因组的5'-三分之 一和3 ‘-三分之二的WNV-Kl和WNV-K4。为了产生全长感染性RNA，体外连接质粒WNV-Kl 和WNV-K4，连接产物用作体外转录的模板。然后，将全长基因组RNA用于转染BHK-21细胞。 为了检测病毒复制和蛋白质的表达，通过免疫荧光检查转染的细胞。在电穿孔后24小时， 阳性细胞的数目不超过细胞的10% ；当使用体外连接的DNA模板时，这是常见的结果。然 而，在电穿孔后48小时，100%的细胞产生免疫荧光的阳性结果，这表明产生了能够感染周 围的非转染细胞的病毒。通过将上清液转移至新鲜BHK-21或Vero细胞上，然后通过免疫荧 光和血凝测定进行检测来确认野生型病毒的感染性。从而，成功地构建了感染性WNV cDNA 克隆。WNV衣壳缺失突变体的构建和检测。为了产生抗WNV的活的减毒疫苗候选物，将 缺失导入编码WNV衣壳蛋白的区域。之前已将技术成功地用于在实验动物模型中通过蜱传脑炎病毒疫苗引发高保护性免疫应答(Kofler，R.M.等人，2002 ；Kofler, R. M.等人，2003)。 为了该目的，将7个(F53-I59)和10个(I44-F53)氨基酸的缺失导入编码衣壳蛋白的区 域，所述区域存在于包含WNV基因组的5'-三分之一的质粒WNV-Kl中。两个缺失都影响 与中央疏水序列部分重叠的螺旋α 2 (Markoff，L. 1997 ;Ma，L.等人，2004)。如之前部分中 所述，就它们复制和表达蛋白质的能力检测称为CD7/3和CDlO的所得的突变体。使用野生 型RNA转染的细胞和未转染的细胞分别作为阳性和阴性对照，在电穿孔后第24小时确定了 包膜蛋白的细胞内表达。如所预期的，两种突变体以及野生型对照能够复制和表达包膜蛋 白，如大约10%的细胞的阳性免疫荧光结果所表明的。通过在电穿孔后第48小时进行免疫荧光染色来估量WNV衣壳缺失突变体感染周 围的未转染的细胞的能力。如上所述，从电穿孔后24小时至48小时阳性细胞数目的增加 表示转染的病毒基因组的感染性。事实上，对于野生型对照，100%的细胞在电穿孔后第48 小时染色成阳性。相反地，突变体CD7/3和CDlO的感染性显著降低；后一个突变体几乎不 能产生感染性病毒后代。为了进一步评估上清液是否含有感染性材料和，此外，确定感染细胞的病毒抗原 的输出，用在电穿孔后第48小时收获的上清液感染单层Vero细胞。在感染后第6天利用 血凝测定分析上清液中包膜蛋白的含量。对于所有突变体，包膜蛋白的输出，从而还有感染 性是可检测的。然而，与野生型相比较，突变体CD7/3和CDlO输出显著更少的颗粒；对于突 变体⑶7/3和⑶10，通过血凝测定确定的滴度显示分别减少2倍和10倍。总而言之，突变体CD7/3和CDlO在产生感染性颗粒方面与野生型不同；免疫荧光 和血凝测定都显示突变体的感染性减弱。通过进行多次终点传代选择大缺失突变体。为了选择具有提高的细胞培养物生长 性质的突变体，将突变体⑶7/3和⑶10在Vero细胞中传代3次；在这些实验中，使用滴定 至感染性的终点的上清液。有趣地，突变体在细胞培养物中生长的能力得到提高，如通过血 凝测定确定的。为了研究此类表型变化是否是衣壳蛋白序列中另外的改变的直接结果，从 感染细胞的上清液分离病毒RNA，将其经历RT-PCR和序列分析。值得注意地，编码衣壳蛋白 的区域的测序的确验证了这样的突变的出现。令人惊讶地，鉴定了其中原始缺失甚至被扩 大的突变。因此，缺失突变体CD7/3和CDlO的传代分别导致37个氨基酸和36个氨基酸的 缺失(CD37和CD36)的出现。缺失的确切位置列于表1中。值得注意的是，当分析完整基 因组时未鉴定到另外的突变。然后，如在实验方法部分中所述，产生病毒储备液。值得注意地，对于原始突变体， 病毒储备液的产生是不可能的，因为第二部位的突变快速出现。相反地，CD37和CD36突变 体使得能够以大于107FFU/ml的滴度产生病毒储备液，而无需进行小鼠大脑传代。将两种 病毒储备液制剂经历3次终点传代，然后进行序列分析以确保它们保持稳定并且无另外的 突变出现。从而，确认了两种突变体的遗传稳定性(表1)。总而言之，通过在Vero细胞中进行多次传代，鉴定了在衣壳蛋白的其他地方不具 有突变的大衣壳缺失突变体，所述大衣壳缺失突变体，当与只包含7和10个氨基酸的原始 突变体相比较时，可在细胞培养物中容易地传代。此外，与⑶7/3和⑶10缺失不同，⑶37和 CD36突变体在遗传上是稳定的并且使得能够产生高滴度病毒储备液。扩大缺失提高细胞培 养物生长性质的发现确实令人惊讶。在体外转录的RNA转染后第48小时的免疫荧光染色
15(图7B)显示突变体⑶36和⑶37确实是有活力的。最后，重要地指出，此类大缺失不存在 回复至野生型的潜力。实施例2 在细胞培养物中进行的缺失突变体CD37和CD36的表征实验方法RNA复制和输出。如之前所述(Kofler，R. M.等人，2006 ;0rlinger，K. K.等人， 2006)(具有少许改动)，通过实时PCR监控细胞内RNA的复制。简而言之，以1. 0的感染 复数(MOI)将于6孔板中生长的Vero细胞与WNV野生型和突变体病毒储备液制剂一起温 育。1小时后，清洗细胞单层并且提供以含有BSA和15mM HEPES而非FBS的生长培养 基。在选择的时间点上，通过胰蛋白酶温育分离细胞，然后在含有BSA的磷酸缓冲盐水 (PBS ；pH 7.4)中清洗2次。从此类细胞纯化细胞质RNA(RNeasy mini试剂盒，Qiagen)， 按照之前的研究(Kofler，R.M.等人，2006 ;0rlinger，K. K.等人，2006)将所述RNA经历实 时 PCR(PE Applied Biosystems)定量。各自的引物(5' -TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3‘， 5 ‘ -GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-3 ‘)和探针(5 ‘ -Fam-TGCCCGACCATGGGAGAAGCT-Tamra-3 ‘
)靶向WNV基因组RNA的包膜基因内的区域。最终根据基于已知浓度的RNA制剂(其在阴 性对照细胞的细胞裂解物中系列稀释且根据相同方案纯化)的标准曲线测定RNA等价物。如最近在Orlinger，K. K.等人(2006)中所公布的，测量转染细胞的上清液中RNA 的含量。因此，在利用实时PCR进行定量之前，通过低速离心澄清上清液的等分，如由厂商 所建议的，使用QIAamp viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN)纯化RNA。最终通过测定上清液 中RNA等价物与包含细胞内和细胞外RNA的总RNA制剂的RNA等价物之间的比率来计算 RNA的输出。细胞毒性测定。除了生长培养基不包含BSA外，与RNA复制和输出实验类似，将 Vero细胞接种入6孔板中，用WNV储备液制剂以1. 0的MOI感染所述细胞。将上清液的等分 转移至96孔板中，按照厂商说明书通过使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega) 测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放来估量细胞毒性。噬菌斑形态学和免疫细胞化学。将Vero细胞在12孔板中培养至80%汇合，然后 与在感染培养基中系列稀释的病毒悬浮液一起温育1小时。然后用含有5% FBS, 1. 5%谷 氨酰胺，青霉素/链霉素，15mM HEPES和0. 25%琼脂糖(Sigma)的EMEM覆盖细胞。在 感染后4至6天的温育期后，测定噬菌斑形态学。因此，用含有4%甲醛和0. 1 %结晶紫的 溶液固定和染色细胞。通过免疫细胞化学测定感染或病灶形成单位(FFU)。在温育2至4天后，除去琼脂 糖覆盖层，用1 1的丙酮/甲醇固定细胞。在室温下用含有5%绵羊血清的PBS PH 7. 4再 水化细胞，进行30分钟。然后，将细胞在37°C下与WNV特异性多克隆抗血清(Y-WN/KIS/2) (于含有0.2% Tween和3%绵羊血清的PBS pH 7. 4中以1 3000稀释)一起温育1小 时。用含有0. 2% Tween和3%绵羊血清的PBS pH 7. 4清洗细胞2次，用含有0. 2% Tween 和3%绵羊血清的TBS缓冲液(137mM氯化钠，3mM氯化钾，25mM Tris pH 8. 0)清洗1次。 在室温下于含有0. 2% Tween和3%绵羊血清的TBS缓冲液中进行使用以1 400稀释的 抗兔碱性磷酸酶缀合的二抗的温育，进行45分钟。在使用相同缓冲液进行2次清洗后，通 过与SIGMAFAST Fast Red TR/Naphthol AS-MX —起温育10分钟来检测WNV特异性病灶。结果
与野生型WNV相比较，突变体⑶36和⑶37的RNA输出和特异性感染性适度降低。 尽管突变体⑶36和⑶37缺少多于三分之一的包括完整疏水性结构域的大部分的蛋白C，但 发现它们具有感染性并且在遗传上是稳定的。为了详细地表征它们复制、输出和感染的能 力，进行与野生型病毒相比较的定量检测。用病毒储备液(lxl07FFU/ml)以1的MOI感染 Vero细胞，通过实时定量PCR(qPCR)估量细胞内RNA合成和至上清液内的RNA输出。如图 3A中所示，在感染后第24和48小时两种突变体的细胞内RNA复制与野生型相似。在感染 后第72和96小时，突变体CD37的细胞内RNA值仍然在野生型水平上，然而突变体CD36的 细胞内RNA值减少。该减少伴随在这些时间点上引起细胞数量急剧减少的强CPE。为了确 认视觉上观察到的CPE，通过测量乳酸脱氢酶(LDH)至感染细胞的上清液内的释放来定量 估计细胞毒性。如图3E中所示，直至感染后48小时，用突变体CD36感染的细胞的LDH释 放在与野生型和突变体CD37相同的范围内。相反地，在更迟的时间点上，CD36感染的细胞 的上清液中LDH水平比其他的显著更高，从而确认了其高细胞毒性并且表明在感染后第72 和96小时对于CD36减少的细胞内RNA值确实是过度细胞死亡的结果(比较图3A与3E)。释放至上清液内的RNA的定量显示蛋白C缺失突变体与野生型病毒之间的适度差 异。与野生型相比较，突变体⑶36和特别地⑶37在感染后24小时释放更少的病毒RNA至 上清液内(图3B)。然而，尽管CD37在更迟的时间点上获得野生型水平，但CD36在所有时 间上保持低于野生型对照大约1个数量级(在48小时后，值不断减小)，推测这是由上述产 生性细胞的损失(其由该突变体的显著的细胞毒性引起)而导致的。为了更好地比较突变 体RNA和野生型RNA的输出效率，计算48小时时间点(在该时间点上，细胞毒性的作用仍 然较低并且在样品间是相当的)释放至上清液中的总(细胞外和细胞内)RNA等价物的百 分比。如图3C中举例说明的，突变体⑶36和⑶37的输出效率为野生型值的大约三分之二 和一半，这表明突变的衣壳蛋白，虽然在RNA的包装和/或病毒体的装配上明显效率较低， 但仍然能够促进显著百分比的总RNA从感染细胞输出。为了进一步测定病毒颗粒的输出， 将与用于病毒RNA定量的相同的上清液经历血凝测定。如图3D中所示，该分析的结果与图 3B中显示的RNA数据十分吻合。对于突变体CD37，病毒颗粒的释放被延迟，但在最迟的时 间点上达到几乎野生型水平。相反地，突变体⑶36在所有时间上保持低于野生型大约3个 log2稀释度(即大约8倍)，与在RNA值中观察到的大约10倍的差异相似。为了定量比较突变体与野生型病毒的特异性感染性，将病毒制剂经历qPCR以测 定RNA等价物的数量(假定其与病毒体的数量相关)和经历病灶测定以定量这些制剂中的 感染单位。然后计算RNA等价物对FFU的比率，将结果绘制于图3F中。虽然该比率对于 野生型病毒为大约10 (S卩，10个RNA等价物/病毒体中有1个引起感染病灶(infectious focus))，但在两个缺失突变体的情况下其高10至100倍，从而表明减少的特异性感染性。总而言之，定量比较表明，缺失突变引起病毒输出和进入的适度但显著的削弱。病毒颗粒在细胞培养物中的生长性质。改变的噬菌斑和病灶形态学是关于毒力 的变化的良好指标。因此，估量突变体⑶37和⑶36在Vero细胞单层上形成噬菌斑的能 力。然而，在温育6天后，对于两种突变体未能鉴定到噬菌斑，而野生型病毒噬菌斑达到8 至15mm(12. 6+/_2. 4mm，表2)的噬菌斑大小。相反地，所有突变体能够在Vero细胞单层上 形成病灶。然而，当与野生型病灶相比较时，这些病灶至少小4倍(表2)。突变体⑶37和⑶36的减少的噬菌斑形成以及减小的病灶大小已表明已为减毒表
17型。为了更详细地研究细胞培养物生长，测定特异性感染性，即，RNA等价物对感染性颗粒 的比率，如通过免疫细胞化学测定的。如图3F中所示，对于两种突变体，特异性感染性显著 降低，或者，换句话说，需要更多的RNA等价物来产生1个感染单位(FFU)。总之，与野生型相比，WNV衣壳缺失突变体在细胞培养物中显示改变的生长性质。 在细胞培养物中观察到的生长性质非常重要，因为它们是动物模型中减毒表型的良好指 标。实施例3 作为活的减毒疫苗的大缺失突变体实施方法动物模型。为了建立动物模型，用不同剂量的WNV野生型病毒腹膜内(i.p)接种 4周龄雌性BALB/c小鼠。在也用作阴性对照的细胞培养基中进行稀释。在感染后，监控动 物的存活，进行28天。50%的动物死于感染时的剂量(LD50)提供了计算攻击剂量的基础， 所述攻击剂量被设置至100倍的LD50。突变体病毒的体内表征。为了表征突变体病毒的毒力和免疫原性，用WNV储备液 制剂的系列稀释物腹膜内(i.p.)接种4周龄的雌性BALB/c小鼠。野生型病毒和细胞培养 基分别用作阳性和阴性对照。在4周的观察期后，通过尾静脉从存活小鼠采集血液。除了 将50 μ 1 0. 25 μ g/ml福尔马林灭活的WNV用于板的包被外，如Heinz等人(1983)中所述， 通过ELISA检测血清转换(seroconversion)。为了检测血清转换的小鼠是否已发展保护性 免疫，用攻击剂量的野生型株系接种小鼠(参见下文)。在攻击后记录存活，进行4周。结果动物模型。为了建立动物模型，用野生型WNV的系列稀释物腹膜内接种成组(每组 10只)的4周龄雌性BALB/c小鼠。致死感染的小鼠在感染后7至10天死于感染。如表3 中所示，在两个高剂量组(50和500FFU)中，没有一只动物存活。相反地，当用5和0. 5FFU 接种小鼠时，分别地10只小鼠中有8只以及9只小鼠中有7只在使用野生型病毒的感染后 存活。当使用0.05FFU的野生型病毒时，没有一只动物被致死感染。此外，阴性对照组的所 有动物都存活。有趣地，所有存活动物不显示任何病征。总之，这些数据表明存活确实是剂 量依赖性的。此外，验证了动物模型的可靠性。50%的动物死于感染时的剂量(LD50)是用于估量病毒的毒力的重要参数。此外， 该参数允许计算用于免疫研究的攻击剂量，通常将该剂量设置为100倍的LD50。对于表3中 显示的实验，LD50在5至50FFU之间。因此，大约100倍的LD50或攻击剂量相应于103FFU。在动物模型中测试疫苗候选物。为了在动物模型中测试突变体CD37和CD36，用不 同剂量的两种疫苗候选物免疫4周龄雌性BALB/c小鼠。在外周接种后，有毒力的神经侵袭 性(neuroinvasivdWNV株系在几乎所有的感染动物中引起致死的脑炎，然而减毒株系引 起诱导特异性抗体应答的无症状感染。对于每一个候选物，通过使用范围在100至IO6FFU 之间的剂量来测试7组动物(每组10只动物)。如表3中所示，即使当用高剂量的疫苗候 选物接种小鼠时，所有动物都存活。因此，LD50大于106FFU。此外，没有一只动物显示任何 病征；这意味着突变体⑶37和⑶36的低毒力。感染后4周，如实验方法部分中所述，通过WNV特异性ELISA估量已接种疫苗的动 物的血清转换。为了测试使用突变体CD37和CD36的免疫是否导致保护性免疫应答，用致 死剂量的野生型病毒(IO3FFU)攻击动物。如表3中所示，血清转换与保护良好相关。
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总之，⑶37和⑶36的低毒力和保护性潜力得到清楚地证明。表1 :WNV衣壳缺失突变体。
权利要求
黄病毒科的突变体病毒，其在衣壳蛋白中包含至少20个连续氨基酸的缺失，除了可被置换的与所述缺失相邻的氨基酸外，在衣壳蛋白内无任何另外的缺失、置换或插入突变。
2.权利要求1的病毒，其特征在于所述衣壳蛋白的羧基末端疏水区不受缺失影响。
3.权利要求1或2的病毒，其特征在于所述病毒是黄病毒属病毒、瘟病毒属病毒或丙型 肝炎病毒属病毒，优选节肢动物传播病毒，特别优选蚊媒病毒。
4.权利要求3的病毒，其特征在于所述病毒选自黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒 (JEV)、登革热病毒(DV)、蜱传脑炎病毒(TBE病毒)、西尼罗病毒(WNV)、墨累谷脑炎病毒 (MVEV)、圣路易士脑炎病毒(SLEV)、波瓦森病毒(PV)、猪瘟病毒(CPFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BDV)、边界病病毒(BDV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
5.权利要求1至4的任一项的病毒，其特征在于所述缺失是至少22个，优选至少24、 26、28、30、32或34个连续氨基酸的缺失。
6.权利要求1至5的任一项的病毒，其特征在于所述缺失是多至48个，优选多至46、 44、42、40或38个氨基酸的缺失。
7.权利要求1至6的任一项的病毒，其特征在于所述病毒能够在细胞培养物中传代并 且，优选在至少2次传代后，在遗传上是稳定的。
8.权利要求1至7的任一项的病毒，其特征在于所述缺失包含野生型病毒衣壳蛋白的 α螺旋2的至少1个氨基酸，优选螺旋2的至少三分之一的氨基酸，更优选螺旋2的C末端 氨基酸。
9.权利要求1至8的任一项的病毒，其特征在于所述缺失包含野生型病毒衣壳蛋白的 α螺旋3的至少1个氨基酸，优选螺旋3的至少三分之一的氨基酸，更优选螺旋3的至少三 分之二的氨基酸，最优选整个螺旋3。
10.权利要求1至9的任一项的病毒，其特征在于所述缺失包含野生型病毒衣壳蛋白的 α螺旋4的至少1个氨基酸，优选螺旋4的至少三分之一的氨基酸，更优选螺旋4的N末端 氨基酸。
11.权利要求1至10的任一项的病毒，其特征在于其在所述衣壳蛋白的外部包含突变。
12.—种药物组合物，优选疫苗，其包含权利要求1至11的任一项的病毒。
13.权利要求12的药物组合物，其特征在于其包含IO1至IOM尤选IO2至106，特别地 IO3至IO5个感染单位的所述病毒。
14.权利要求12或13的药物组合物，其特征在于其还包含抗生素、防腐剂、稳定剂、缓 冲物质或其混合物。
15.编码权利要求1至11的任一项的突变病毒的衣壳蛋白的核酸。
16.权利要求1至11的任一项的突变病毒的衣壳蛋白。
17.一种药物组合物，优选疫苗，其包含权利要求15的核酸或权利要求16的衣壳蛋白。
18.权利要求17的药物组合物，其特征在于其包含氨基糖苷抗生素，特别地新霉素或 卡那霉素、脂质体、微球体或其混合物。
19.权利要求12至14、17或18的组合物，其用于黄病毒科病毒感染的治疗或预防。
20.产生权利要求1至11的任一项的修饰的病毒的方法，其特征在于下列步骤 提供黄病毒或黄病毒核酸，其中所述黄病毒或黄病毒核酸编码具有权利要求1至11的任一项中定义的缺失的衣壳蛋白， 在合适的宿主细胞中繁殖所述黄病毒或黄病毒核酸，和 回收由所述宿主细胞繁殖的病毒颗粒。
21.权利要求20的方法，其特征在于所述宿主细胞选自鸡胚胎细胞、原代鸡胚胎细胞、 人二倍体细胞系、Vero细胞、CHO细胞、HEK293细胞、PER. C6 细胞、原代仓鼠肾细胞、原代 犬科动物肾细胞或二倍体胎儿恒河猴肺细胞。
22.产生权利要求15的修饰的核酸的方法，其特征在于下列步骤 提供编码具有权利要求1至11的任一项中定义的缺失的衣壳蛋白的黄病毒核酸， 将所述核酸插入合适的载体， 用所述载体转化合适的宿主细胞， 在所述宿主细胞中扩增所述核酸， 从所述宿主细胞回收所述核酸。
全文摘要
本发明涉及黄病毒科的突变体病毒，其在衣壳蛋白中包含至少20个连续氨基酸的缺失，除了可被置换的紧接缺失的氨基酸外，无任何另外的缺失、置换或插入突变。
文档编号C12N7/04GK101970467SQ200980104415
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月8日
发明者A·迈因克, C·曼德尔, F·X·海因茨, P·施利克 申请人:英特塞尔股份公司