介导膜稳定cd40l基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒制备方法与应用的制作方法

专利名称：介导膜稳定cd40l基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及介导膜稳定CD40L-M基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。
背景技术：
肺癌是中国乃至世界死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管近年来肺癌的早期诊断及综合治疗取得了一定的进步，但仍有90%的肺癌在发现时已发生转移，其5年生存率不足15%。因此，迫切需要寻找治疗肺癌原发灶及其转移灶的新途径。目前,免疫基因治疗被视为最有前景的肿瘤治疗方式之一。肿瘤免疫涉及全身免疫和局部免疫，包含着复杂的过程。肿瘤微环境(microenvironment)是肿瘤细胞和宿主免疫系统的“战场(battlefield)”，研究证实它对发挥宿主抗肿瘤免疫起着关键性作用。肿瘤细胞为了逃避宿主的免疫攻击，在微环境中运用各种方法去减弱或反击宿主的免疫系统，诸如下调人类白细胞抗原I类分子(HLA-1 )和肿瘤抗原，分泌免疫抑制因子，减弱共刺激信号等，从而使宿主处于免疫抑制状态，阻碍了肿瘤疫苗的系统治疗效果。因此，改变肿瘤微环境的免疫抑制(immune-compromised)状态为免疫激活(immune-competent)状态是成功进行肿瘤免疫基因治疗的关键。研究表明，协同刺激因子⑶40L的表达缺失及⑶40的持续表达可能与肿瘤的发生以及肿瘤的免疫逃逸、肿瘤微环境的免疫抑制状态相关。⑶40L也称gp39、肿瘤坏死因子相关激活蛋白(TNF associated activation protein, TRAP)、T细胞-B细胞活化分子(T cell-B cell-activating molecule, T-BAM),为 33kD 的 II 型跨膜糖蛋白，共 266aa,是目前免疫基因治疗研究的热点之一。研究发现，CD40/CD40L间相互反应可阻断肿瘤细胞的细胞周期，诱导细胞凋 亡，提高肿瘤细胞对其他凋亡诱导剂(如顺钼、TNF-a )的敏感性。CD40L能够上调肿瘤内源的多肽及共刺激分子的表达，增强CD40+肿瘤细胞对内源性抗原的呈递作用，使某些肿瘤细胞分泌更多的具有免疫刺激作用的细胞因子；可增强树突状细胞(Dendritic Cell，DC)、单核细胞、B细胞等抗原呈递细胞CD54、CD80、CD86、ICAM-1、LFA-4等协同分子的表达，促进其与T细胞间的相互作用，增强T细胞的活化与增殖；还可抑制IL-10和TGF-P的产生，诱导肿瘤部位的Thl反应，进而抑制肿瘤的发生。⑶40L与⑶40的结合能诱导各种细胞因子和化学因子的产生，如IL-6、IL-8、IL-12、TNF-a、INF- y等；还可通过诱导产生的IL-12上调T细胞表面⑶40L的表达，与其它共刺激分子(如B7-l、B7-2)协同作用，促使⑶40L的表达量提高。DC是激发B和T淋巴细胞介导免疫反应的重要的高效专职抗原提呈细胞；CD40L通过活化DC上调上皮癌细胞共刺激分子的表达和细胞因子的产生而增加肿瘤的免疫原性；通过刺激DC的CD83等共刺激分子的表达，力口速DC表型的成熟；通过诱导外周血单个核细胞，使其分化为表达⑶la、⑶80、⑶83、HLA-DR的DC。同时，⑶40L还直接作用于T细胞，通过Flt3与⑶40L的共同反应产生更强的抗肿瘤反应；CD40L激活DC后，又进一步提高DC与T细胞及肿瘤细胞间的相互反应和免疫效应功能。因此，CD40L和CD40的相互作用对于机体抗原提呈细胞的活化、体液免疫和细胞免疫应答的启动、免疫应答效率的提高起着重要作用，这在调节肿瘤微环境，诱导抗肿瘤免疫及抑制肿瘤生长中具有非常关键的地位(Loskog AS, Eliopoulos AG :The Janusfaces ofCD40 in cancer. Semin Immunol 2009;21:301-7.)。目前，CD40L 相关的治疗在 B 细胞恶性肿瘤、多种实体瘤及肿瘤转移灶的前临床试验中均取得了令人鼓舞的疗效。而CD40L相关的治疗方法，包括联合传统的(如5_FU)或新颖的(如溶瘤病毒)方法，也在前临床试验中展示出很好的疗效。CD40L已成为肿瘤免疫基因治疗的最佳目的基因之一。正如其他的跨膜糖蛋白，⑶40L在细胞表面可被基质金属蛋白酶切割，释放出⑶40L可溶性片段(s⑶40L)，后者可形成三聚体进入血循环，并结合⑶40，发挥生物学作用。研究提示在自身免疫性疾病、代谢和心血管疾病等患者中，血浆SCD40L水平明显增高，后者参与了上述疾病的发生发展(Ferroni P. Santilli F, Guadagni F ；BasiliS, DaviG.Contribution of platelet-derived CD40 ligand to inflammation, thrombosis andneoangiogenesis. Curr Med Chem 2007 ;14 :2170-80.) 部分研究还发现，在蛋白质合成未被阻滞等条件下，SCD40L会促进肿瘤生长。因此，CD40L基因治疗可能因产生sCD40L而存在潜在的危险。为了避免⑶ 40L基因治疗的副作用，本项目组将⑶40L的基质金属蛋白酶的切割位点 Q114K115D117Q118N119 突变为 P114R115E117E118D119,即突变型 / 膜稳定型 CD40L(CD40L_M)。该膜稳定型⑶40L单体的空间结构无明显变化，应用⑶40L-M基因替代野生型⑶40L(⑶40L-WT)基因转导肺癌细胞的体内外试验证实，其SCD40L产生显著减少，而直接抗肿瘤作用及对宿主的免疫激活作用等同于甚至优于CD40L-WT，是安全而有效的目的基因。基因治疗的另一要素是寻求安全有效的载体。外源基因在目的细胞中的高效稳定表达，即基因治疗的靶向性、高效性和安全性，很大程度上取决于基因治疗的载体系统。好的基因治疗载体具备靶向性、无毒副作用、不引起炎症反应和免疫反应等优点。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)具有安全性高,宿主范围广,物理性质稳定,携带目的基因长效表达以及宿主免疫反应小等多种优点，因而在基因治疗中得到越来越广泛的应用。迄今为止，已有81个临床治疗研究证明了该载体的有效性。虽然以AAV为载体的基因治疗在临床前研究和临床试验中取得了可喜的结果，但是大多应用的是第一代AAV，仍存在缺点和局限性，包括病毒载体细胞组织嗜性(tropism)、转导效率及载体剂量相关毒性问题。随着分子病毒学及AAV基础研究的进展，利用AAV不同血清型(WangJ，Faust SM，Rabinowitz JE. The next step in gene delivery molecular engineeringof adeno-associated virus serotypes. J Mol Cell Cardiol. 2011 ;50 (5) :793-802.)^自身互补 AAV (self-complementary AAV, scAAV) (McCarty DM. Self-complementary AAVvectors ；advances and applications. Mol Ther. 2008 ；16 (10) 1648-56.)以及 AAV 衣壳蛋白点突变(Zhong L, Li B，Mah CS，Govindasamy L, Agbandje-McKenna M，et al. Nextgeneration of adeno-associated virus 2vectors point mutations in tyrosineslead to high-efficiency transduction at lower doses.Proc Natl Acad SciUSA. 2008； 105 (22) :7827-32.)等策略改良的新一代AAV可望克服第一代AAV的缺点和不足。AAV不同血清型迄今以血清型定名的AAV亚型分为AAV1-AAV12，主要以人类和灵长类动物为宿主。各种血清型AAV载体的构建通常采用“杂合”策略，即AAV载体质粒都采用AAV2的ITR，而AAV rep cap基因部分采用全部或部分AAV2的rap基因与不同血清型AAV的cap基因“杂合”，包装出来的AAV就具有AAV2载体的基因组，而包裹它的衣壳则是非AAV2的其它血清型AAV病毒衣壳。比如AAV2/5载体，就具有AAV2的2个ITR、位于两者之间的治疗基因表达盒和AAV5的衣壳，所以其感染特性与AAV5—致(Hildinger M，AuricchioA, Gao G, Wang L, Chirmule N, Wilson JM. Hybrid vectors based on adeno-associatedvirus serotypes 2 and 5 for muscle-directed gene transfer. J Virol. 2001 ；75 (13)6199-203.)。尽管不同AAV血清型的病毒都具有正二十面体的结构，但其衣壳蛋白在序列与空间构象上的多样性，使得其细胞表面的结合受体以及对细胞的嗜性存在显著差异。目前研究发现，AAV2/5和AAV2/6在肺及呼吸道上皮中的转导效率优势显著，我们课题组曾以不同血清型AAV分别转导肺癌细胞，结果提示AAV2/5的转导效率较其它血清型高(WuJQ,Zhao WH,Li Y，Zhu B，Yin KS. Adeno-associated virus mediated gene transfer intolung cancer cells promoting CD40 ligand-based immunotherapy. Virology. 2007 ；368(2) :309-16.)，其次为AAV2/6。进一步的研究证实，AAV5的主受体——N交联唾液酸在气道上皮的数量较其他AAV的受体——硫化肝素蛋白多糖数量明显增多，而AAV2/6具有以上两种受体。自身互补型AAV 传统的AAV为单链AAV (ssAAV)，需经过基因组的第二链合成才能启动基因的转录，AAV基因组的双链转化被认为是其转导过程的限速(rate-limiting)步骤。自身互补AAV (scAAV)或称为双链AAV (dsAAV)克服了 AAV转导过程中病毒第二链DNA合成的障碍，因此在多种靶向组织，特别是体外实验中表现出快速和高效的表达。AAV衣壳蛋白点突变新近，为减少病毒载体可能的剂量相关毒性，同时也为减少今后临床基因治疗中病毒载体的剂量，Srivastava等报道了 AAV衣壳蛋白点突变的新一代AAV。研究者们将AAV2晶体结构分析所确定的暴露于AAV2衣壳蛋白表面的七个酪氨酸残基(Y)逐个定点突变为苯丙氨酸(F)，以减少AAV2在胞运过程中酪氨酸残基的磷酸化，并降低随后启动的衣壳蛋白泛素化，从而使AAV2逃逸了蛋白酶体的识别和降解。体内外实验证明，衣壳蛋白点突变的新一代AAV2注射剂量减少10倍情况下，外源基因在小鼠肝癌细胞的表达效率仍能提高近30倍，其中，病毒衣壳蛋白730位点Y — F突变的载体(AAV2-Y730F)转导效率最高。 目前，国内外尚未见报道是何种血清型的外壳酪氨酸残基突变的scAAV能高效转导肺癌细胞，也无关于构建膜稳定的CD40L基因的腺相关病毒载体及其抗肿瘤基因治疗应用的报道。

发明内容
发明目的为了克服现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种人源膜稳定突变基因⑶40L-M，其核苷酸序列如SEQ ID No:l。其中，质粒载体pdsAAV-CB-CD40L-M的构建方法，在源克隆pcDNA3. 1+-CD40L-WT的目的基因片段中通过特异引物设计、高保真DNA聚合酶PCR扩增、自身连接处理引入点突变，再通过亚克隆，得到pdsAAV-CB-⑶40L-M质粒载体。一种重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，它包含CD40L-M基因。
其中，重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M，是从不同血清型的自身互补的双链腺相关病毒(scAAV)野生体和突变体中遴选出的，外壳蛋白719位点酪氨酸残基点突变为苯丙氨酸的自身互补的重组AAV2/5载体。其中，重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M的制备方法，采用三质粒共转染法包装腺相关病毒，经纯化、浓缩后，Slot-blot测定病毒滴度，AAV包装时，通过选择不同的野生型或外壳蛋白突变型AAV的pAAV-R/C，及现有的pdsAAV-GFP和pHelper辅助质粒包装成scAAVX-R/C-GFP(其中X表示为1_10十位自然数)病毒颗粒，从不同的血清型scAAV野生型和突变型载体中，通过转导肺癌细胞GFP基因的表达效率，遴选出转导肺癌细胞效率最高的载体 scAAV2/5-Y719F-GFP，再以三质粒 pAAV2/5_Y719F_R/C、pdsAAV-CB-CD40L_M、pHelper 共转染法，制备得到 scAAV2/5-Y719F-CD40L_M。其中，重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M在制备治疗肺癌药物中的应用。技术方案为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下一种人源膜稳定突变基因CD40L-M，其核苷酸序列如SEQ ID No :1。其中，⑶40L-M基因所编码的氨基酸序列与GenBank报道的人⑶40L的氨基酸序列相比具有如下突变 第114位氨基酸由Gln变成Pro，第115位氨基酸由Lys变成Arg，第117位氨基酸由Asp变成Glu，第118位氨基酸由Gln变成Glu，第119位氨基酸由Asn变成Asp0 其中，质粒载体pdsAAV-CB-CD40L-M，它包含CD40L-M基因，其中，质粒载体pdsAAV-CB-⑶40L-M的构建方法是在源克隆pcDNA3.1+-⑶40L-WT的目的基因片段中通过特异引物设计、高保真DNA聚合酶PCR扩增、自身连接处理引入点突变，再通过亚克隆，得到pdsAAV-CB-CD40L-M 质粒载体。其中，重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，它包含CD40L-M基因，其中，重组腺相关病毒SCAAV2/5-Y719F-⑶40L-M，是从不同血清型的自身互补的双链腺相关病毒(scAAV)野生体和突变体中遴选出的，外壳蛋白719位点酪氨酸残基点突变为苯丙氨酸的自身互补的重组AAV2/5载体。本发明的腺相关病毒是在已知的双链重组腺相关病毒载体1-10血清型基础上进行改造得到的，所述腺相关病毒结构基因为Rep和Cap基因，编码AAV1-10衣壳蛋白的Cap基因的约730位点的表面酪氨酸残基分别被突变为苯丙氨酸，即pAAV2/l-Y731F-R/C、pAAV2-Y730F-R/C、pAAV2/3_Y731F_R/C、pAAV2/4_Y729F_R/C、pAAV2/5_Y719F_R/C、pAAV2/6-Y731F-R/C、pAAV2/7_Y732F_R/C、pAAV2/8_Y733F_R/C、pdsAAV2/9_Y731F-R/C、pAAV2/10-Y733F-R/Co通过对AAV2与AAV2/5基因的同源比对及晶体结构分析发现AAV2/5衣壳蛋白表面719位点对应于AAV2衣壳蛋白730位点的酪氨酸残基。通过改造AAV2/5衣壳719位点酪氨酸残基为苯丙氨酸，获得的新一代SCAAV2/5-Y719F能进一步提高AAV载体对肺癌细胞的转导效率，成为携带CD40L-M基因治疗肺癌的最优载体。重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M的制备方法，采用三质粒共转染法包装AAV，经纯化、浓缩后，Slot-blot测定病毒滴度。AAV包装时，通过选择不同的野生型或外壳蛋白突变型AAV的pAAVX-R/C(其中X表示为1_10十位自然数)，及现有的pdsAAV-GFP和pHelper辅助质粒包装成scAAVX-R/C-GFP病毒颗粒，从不同的血清型scAAV野生型和突变型载体中，通过转导肺癌细胞GFP基因的表达效率，遴选出转导肺癌细胞效率最高的载体 scAAV2/5-Y719F-GFP，再以三质粒 pAAV2/5-Y719F-R/C、pdsAAV-CB-CD40L_M、pHelper 和人胚肾293细胞共转染法，制备得到scAAV2/5-Y719F-CD40L-M。本发明以scAAV2/5-Y719F-CD40L-M转导肺癌细胞A549和人胚肾293细胞，以半定量RT-PCR检测⑶40L及⑶40L-M在肺癌细胞中的表达；以流式细胞术验证⑶40L-M基因诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡的作用，以ELISA法检测潜在炎性因子SCD40L分泌量的减少；诱导人单核细胞株THP-1来源的不成熟树突状细胞(iDCs)，以转导后的A549和iDCs共培养，通过ELISA法检测细胞上清中成熟DCs标志蛋白IL-12的表达量验证CD40L-M诱导iDCs成熟，通过免疫激活间接杀伤肺癌细胞；荷瘤小鼠的体内实验也证实了scAAV2/5-Y719F-CD40L-M具有抗肺癌作用，同时肝肾副作用较小。上述重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M在制备治疗肺癌药物中的应用。重组腺相关病毒SCAAV2/5-Y719F-⑶40L-M，已保藏于武汉大学内中国典型物保藏中心，保藏日期2012年11月26，保藏编号CCTCCN0 :V201252分类命名介导膜稳定⑶40L基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒。保藏地址湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。有益效果本发明应用⑶40L-M基因替代野生型⑶40L (⑶40L-WT)基因转导肺癌细胞的体内外试验证实，其SCD40L产生显著减少，为改进AAV基因转导效率，开发和应用自身互补的双链AAV (self-complementary AAV, scAAV)及AAV2之外的血清型病毒,构建衣壳蛋白点突变的SCAAV2/5-Y719F-⑶40L-M能高效转导肺癌细胞，⑶40L-M基因诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，诱导机体抗肿瘤免疫，抑制肺癌生长，副作用小。本发明的该基因治疗药物有望用于制备抗肺癌基因治疗新药。


图1A 是 pcDNA3. 1+-CD40L 和 pcDNA3. 1+-CD40L-M 以 Xho I 和 EcoR I 双酶切鉴定，I %琼脂糖凝胶电泳显示为约850bp和4800bp的两个片段。(1、2和3泳道Xho I和EcoRI 消化的 pcDNA3. 1+-CD40L ;5、6 和 7 泳道Xho I 和 EcoR I 消化的 pcDNA3. 1+-CD40L-M ；4和 8 泳道DNA marker)；图1B是⑶40L和⑶40L-M各自单体的空间结构图；图2A是pdsAAV-CB-CD40L分别经BamH I /HindIII 和 BamH I /Sac I 双酶切鉴定；(I 泳道pdsAAV-CB-CD40L 经 BamH I /HindIII 酶切；2 泳道pdsAAV-CB_CD40L 经 BamH I /Sac I 酶切；M 泳道DNA marker)；图2B 是 pdsAAV-CB-CD40L-M 分别经 BamH I /HindIII 和 BamH I /Sac I 双酶切鉴定。(I 泳道pdsAAV-CB-CD40L-M 经 BamH I /HindIII 酶切；2 泳道pdsAAV-CB-CD40L_M经 BamH I /Sac I 酶切；M 泳道DNA marker)；图2C 是 pdsAAV-CB-CD40L 和 pdsAAV-CB-CD40L_M 部分测序图；图2D 是 pdsAAV-CB-CD40L_M 质粒图谱；图3A是不同血清型AAV外壳表面的部分氨基酸序列，其中scAAV2的cap基因730位点为酪氨酸残基，因各种AAV序列的保守性，其他scAAV血清型的相应位点的分别为731(AAV1)、731 (AAV3)、729 (AAV4)、719 (AAV5)、731 (AAV6)、732 (AAV7)、733 (AAV8)、731(AAV9)、733 (AAVlO)；图3B是无辅助病毒包装系统三质粒(pdsAAV-GFP、pAAVX-R/C、pHelper)共转染法包装scAAVX-GFP简易流程；图4A和图4B是不同血清型scAAVX_GFP及其突变体载体转导人肺癌A549细胞48小时后转导效率(荧光显微镜X 100，像素2/视野X IO4, *p〈0. OOlvs其他组)；图4C和图4D是不同血清型scAAVX-GFP及其突变体载体转导鼠肺癌LLC细胞48小时后转导效率(荧光显微镜X 100，像素2/视野X IO4, *p〈0. OOlvs其他组)；图5 点杂交方法测定病毒 scAAV2/5-CD40L-M 及 scAAV2/5-Y719F-CD40L_M 的滴度(scAAV2/5-CD40L :1. 3 X 1013v. g. /ml, scAAV2/5-Y719F_CD40L 5X 10nv. g. /ml,scAAV2/5-CD40L-M :1 XlO13V. g. /ml, scAAV2/5-Y719F-CD40L_M :5XlO11V. g. /ml, (v. g. /ml vector genomes/ml,每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数))；图6A 体外实验，scAAV2/5-Y719F-CD40L 或 scAAV2/5-Y719F-CD40L_M 按每个细胞I X IO4病毒颗粒转导A549细胞48小时后，半定量RT-PCR测得CD40L或CD40L-M基因的mRNA表达量。两者无统计学差异；图6B体外实验，ELISA法检测转导后细胞上清s⑶40L的分泌量。转导24h，48h及72h后，A549细胞上清液中s⑶40L表达量提示⑶40L/A549组细胞48h及72h上清液中s⑶40L的表达量较对照组、空载组及⑶40L-M组细胞上清液中s⑶40L的表达量显著增高，差别具有显著性(*P〈0. 01)，而24h的表达量无显著性差别KD40L-M/A549组细胞上清液中s⑶40L的表达水平与空载体组和对照组均无明显差异；图6C体外实验，收获病毒转导后12h、24h和48h的肿瘤细胞，采用PI染色，流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡和细胞周期；

图6D体外实验，经过处理后流式细胞仪检测A549细胞凋亡率。⑶40L/A549组细胞24h、48h的凋亡率与⑶40L-M/A549组细胞24h、48h的凋亡率无显著性差异，且此两组的细胞凋亡率均显著高于空载组和对照组(*P〈0. 05)；图6E体外实验，经过处理后流式细胞仪检测A549细胞周期分布图。⑶40L/A549与CD40L-M/A549在24h及48h，细胞周期阻滞于G0/G1期显著高于对照组和空载组(*p〈0. 05)；而其G2/M和S期较对照组和空载组相应地减少；图6F体外实验，THP-1细胞经过细胞因子逐步诱导分化为不成熟DC。THP-1细胞经过rhGM-CSF和rhIL-4诱导，第二天小圆透亮的细胞开始成簇，第五天细胞形状变的不规贝丨J，有的生出触角，经流式细胞仪检测，THP-1经诱导后表面分子⑶la，⑶80，⑶83和⑶86上调,而CD14下调,提示单核细胞向不成熟DC转化；图6G体外实验，经过处理后的A549细胞同iDC经混合共培养、Transwell共培养48小时后其上清炎性因子IL-12分泌量测定。⑶40L/A549和⑶40L-M/A549分别与不成熟DC混合共培养或Transwell共培养48h，分别测其上清IL-12水平。在普通6孔板，CD40L/A549组和⑶40L-M/A549组分泌IL-12水平显著高于对照组和空载组(*p〈0. 01),而组间差别不显著。分别予以⑶40L单抗预处理，⑶40L/A549组和⑶40L-M/A549组分泌IL-12水平减少。在Transwell培养板，⑶40L/A549组和⑶40L-M/A549组分泌IL-12水平显著高于对照组和空载组(*P〈0. 01)，但组间差别显著，即⑶40L/A549组分泌IL-12水平高于CD40L-M/A549 组(*p〈0. 05)；
图7A体内实验，scAAV2/5-Y719F-CD40L-M治疗对裸鼠肺癌生长抑制作用。基因治疗后，肿瘤生长抑制明显，瘤体增长速度减缓，至第30天，治疗组肿瘤体积小于对照组和空载组(*p〈0. 01)。scAAV2/5-Y719F-CD40L 治疗组抑瘤率 50. 35%，scAAV2/5-Y719F-CD40L_M治疗组抑瘤率58. 75%，两组间比较有显著差异(* 〈0. 05)；图7B体内实验，scAAV2/5-Y719F-CD40L-M治疗对裸鼠肝肾功能影响。基因治疗后，scAAV2/5-Y719F-CD40L-M治疗组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及血尿素氮(BUN)水平均较 scAAV2/5-Y719F-CD40L 治疗组低(*p〈0. 05)；图8重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M的制备过程简图。
具体实施例方式实施方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见《Molecular Cloning ALaboratory Manual)) (Sambrook J, Russell David ff, Molecular Cloning A LaboratoryManual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Invitrogen公司完成；源克隆pcDNA3. 1+ 购自 Invitrogen 公司。小鼠肺癌细胞LLC、人肺癌细胞A549和人胚肾293细胞等所用细胞株均为南京医科大学老年医学科实验室保管。pdsAAV-GFP表达质粒，pAAVX-R/C质粒及pHelper质粒等均由美国佛罗里达大学医学院Arun Srivastava教授惠赠。IL_12p70 ELIS A 试剂盒购自 Genetimes 公司。所用酶均购自美国Roche公司。下面结合附图对本发明重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M及其制备方法与其在肺癌治疗方面的应用作更进一步的说明。实施例1 :如图1A和图1B，pcDNA3. 1+-CD40L-M构建及鉴定。具体步骤为①pcDNA3.1+-⑶40L质粒构建和鉴定。外周血分离人单个核细胞；细胞总RNA抽提及cDNA 转录；RT-PCR 扩增目的基因 CD40L (上游引物5’ -CCGGAAITCCCAGAAGATA-3’，下游引物5，CCGCTCGAGTCAGCTCCA-3，，产物大小850bp);以限制性内切酶EcoR I和Xho I将目的基因片段和pcDNA3.1+载体(购自Invitrogen)连接；pcDNA3. 1+-CD40L质粒转化和鉴定。②pcDNA3. 1+-CD40L-M质粒构建和鉴定。以源克隆pcDNA3. 1+-CD40L设计并合成引物引入变异点(Q114K115D117Q118N119 为 P114R115E117E118D119)；高保真 DNA 聚合酶 platinumpfx DNA Polymerase (Invitrogen)进行PCR扩增；对PCR产物进行末端平滑及5’端磷酸化反应，然后进行自身连接反应，产物转化感受态细胞DH5 a ;挑选克隆鉴定。将pcDNA3. 1+-CD40L和pcDNA3. 1+-CD40L-M两种重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳显示为约850bp和4800bp的两个片段(图1A)。重组质粒pcDNA3.1+-⑶40L测序报告证实核苷酸序列与Genebank中人⑶40L cDNA基因序列(匪000074)相吻合。pcDNA3. 1+-CD40L-M 质粒测序报告证实 hCD40L 的 Q114K115D117Q118N119 位点突变为 P114R115E117E118D119(Gin114 to Pro114jLys115 to Arg115jAsp117 to Glu117jGln118 to Glu118,Asn119 to Asp119, and Pro120 to Ser12°)其中红色箭头示突变碱基。CD40L 和 CD40L-M 单体空间结构未见改变(图1B)。 实施例2 如图2A和2B，pdsAAV-CB-⑶40L-M质粒构建及鉴定。具体步骤为①扩增pcDNA3. 1+-CD40L-M 及 pdsAAV-CB-GFP，引物为 T7 和 T405-R(T405_R CTTAGGAGCTCGTCGACGTCGAGGCTGATCAGCGGGT)，CD405-R引物添加了 Sac I酶切位点及保护碱基；然后用BamHI和Sac I双酶切PCR产物，克隆到目的载体中pdsAAV-CB-GFP中；挑单克隆菌检，阳性克隆测序，得到与标准序列一致的克隆。实施例3 如图3A，不同血清型AAV外壳表面约730位点的碱基序列及AAV2/5突变位点构建。对AAV2和AAV2/5基因行同源比对及晶体结构分析，确定AAV5衣壳蛋白表面719位点的氨基酸分别对应于AAV2衣壳蛋白730位点的酪氨酸残基。使用()uikChangeK IISite-Directed Mutagenesis Kit (Alignment Technologies)标准点突变试剂盒。先合成突变链DNA模板变性，与包含所需突变的突变引物退火，使用/丨//凡///ras DNA聚合酶进行引物延生，构建AAV2/5病毒外壳蛋白719位点酪氨酸(Y)编码碱基点突变为苯丙氨酸(F)编码碱基的 pAAV2/5-Y719F-R/C 质粒(引物 AAV2/5-Y719-F CCCATTGGCACCAGATTCCTGACGCGTAATCTGTAATTGCTTG, AAV2/5-Y719-R CAAGCAATTACAGATTACGCGTCAGGAATCTGGTGCCAATGGG ) Dpn I消化甲基化和半甲基化亲本DNA模板，即pAAV2/5-R/C ;将突变的分子转化进感受态细胞修复切口 ；筛选阳性克隆，送测序并测全长，得到PAAV2/5-Y719F-R/C质粒。实施例4 如图4A、4B、4C、4D，以不同血清型scAAVX-GFP及其突变体载体转导人肺癌A549细胞及鼠肺癌LLC细胞48小时后GFP基因的表达。按上述方法(图3)，以表达绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的pdsAA-GFP表达质粒、pAAVX-R/C或pAAVX-R/C突变体质粒及pHelper质粒，按磷酸钙三质粒共转导人胚肾293细胞法，72h后收集细胞，冻融5个循环，Benzonase消化，Iodixanol分层离心及肝素琼脂亲和柱(heparin-agarose)纯化浓缩后获得野生型scAAVX-GFP 和突变型 scAAVX-GFP 病毒。A549/LLC细胞按5*104个/孔接种于24孔板，培养液为含10%胎牛血清的DMEM液，37度5% CO2培养箱培养12h。观察细胞状态是否正常，计数细胞。按MOI值(v. g/cell)为5*105计数，加入scAAVX-GFP及其突变体载体。Ih后，吸去每孔液体，加入Iml/孔含10%胎牛血清的DMEM液，48小时后，在荧光显微镜下计数荧光细胞，并用Image J软件进行半定量分析(像素2/视野X 104)。计算转导效率，遴选出转导效率最高的SCAAV2/5-Y719F-GFP载体(在A549细胞转导效率为72%，在LLC细胞为63%)。实施例5 如图5，包装病毒 scAAV2/5-CD40L-M 及 scAAV2/5-Y719F-CD40L_M，点杂交方法测定病毒的滴度。使用 Quikrhange1、II Site-Directed Mutagenesis Kit (AlignmentTechnologies)标准点突变试剂盒。先合成突变链DNA模板变性，与包含所需突变的突变引物退火，使用PM!Hru9 mk聚合酶进行引物延伸，构建AAV2/5病毒外壳蛋自719位点酪氨酸(Y)编码碱基点突变为苯丙氨酸(F)编码碱基的pAAV2/5-Y719F-R/C质粒(引物AAV2/5-Y719-F CCCATTGGCACCAGATTCCTGACGCGTAATCTGTAATTGCTTG, AAV2/5-Y719-R CAAGCAATTACAGATTACGCGTCAGGAATCTGGTGCCAATGGG)。Dpn I 酶消化甲基化和半甲基化亲本 DNA模板，即PAAV2/5-R/C ;将突变的分子转化进感受态细胞修复切口 ；筛选阳性克隆，送测序并测全长，得到 pAAV2/5-Y719F-R/C 质粒。以 pdsAAV-CB_CD40L 和 pdsAAV-CB-CD40L_M 质粒、pAAV2/5-Y719F-R/C质粒及pHelper质粒(美国佛罗里达大学医学院Arun Srivastava教授惠赠)，按磷酸1丐法共转染 HEK293 细胞(http //www. med. upenn. edu/gtp/vector_core/production, shtml), 72h 后收集细胞，冻融 5 个循环，Benzonase 消化，Iodixanol 分层离心及肝素琼脂亲和柱(h印arin-agarose)纯化浓缩后获得scAAV2/5-Y719F_CD40L和scAAV2/5-Y719F-CD40L-M病毒。以a -32P标记探针，定量DNA Slot blot测定病毒滴度。结果显示 scAAV2/5-Y719F-CD40L 5X 10nv. g. /ml, scAAV2/5-Y719F-CD40L_M :5X 10nv. g. /ml o实施例6 如图6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G，病毒按每个细胞IO4转导A549细胞，48小时后，提取 RNA，逆转录成 cDNA，行 RT-PCR 检测 CD40L 表达量(引物 CD40L(132bp)，sense :5，-TGAGCA ACA ACT TGG TAA CCC TGG-3’ ； anti sense :5 ’ -CTG GCT ATA AAT GGA GCT TGA CTCG-3’;Trizol购自Invitrogen公司；SYBR荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo公司)。ELISA法(s⑶40L ELISA检测试剂盒购自bender公司)测定细胞培养上清s⑶40L产生量，流式细胞仪(美国BD公司FACSAria)检测细胞周期及细胞凋亡量。以rhGM_CSF和rhIL_4(P^roTech公司)诱导不成熟DC,与转导后A549细胞混合共培养或Transwell (Corning公司)共培养，分别检测培养后上清液DC成熟标志IL-12水平(IL-12p70ELISA试剂盒购自Genetimes公司)以评估其免疫诱导作用。图6A 体外实验，scAAV2/5- Y719F-CD40L 或 scAAV2/5-Y719F-CD40L_M 按每个细胞1父104病毒颗粒转导八549细胞48小时后，半定量RT-PCR测得CD40L或CD40L-M基因的mRNA表达量。两者无统计学差异。图6B体外实验，ELISA法检测转导后细胞上清s⑶40L的分泌量。转导24h，48h及72h后，A549细胞上清液中s⑶40L表达量提示⑶40L-WT/A549组细胞48h及72h上清液中s⑶40L的表达量较对照组、空载组及⑶40L-M组细胞上清液中s⑶40L的表达量显著增高，差别具有显著性(*P〈0. 01)，而24h的表达量无显著性差别。⑶40L-M/A549组细胞上清液中s⑶40L的表达水平与空载体组和对照组均无明显差异。图6C体外实验，收获病毒转导后12h、24h和48h的肿瘤细胞，采用PI染色，流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡和细胞周期。图6D体外实验，经过处理后流式细胞仪检测A549细胞凋亡率。⑶40L/A549组细胞24h、48h的凋亡率与⑶40L-M/A549组细胞24h、48h的凋亡率无显著性差异，且此两组的细胞凋亡率均显著高于空载组和对照组(*P〈0. 05)。图6E体外实验，经过处理后流式细胞仪检测A549细胞周期分布图。⑶40L/A549与CD40L-M/A549在24h及48h，细胞周期阻滞于G0/G1期显著高于对照组和空载组(*p〈0. 05)；而其G2/M和S期较对照组和空载组相应地减少。图6F体外实验，THP-1细胞经过细胞因子逐步诱导分化为不成熟DC。THP-1细胞经过rhGM-CSF和rhIL-4诱导，第二天小圆透亮的细胞开始成簇，第五天细胞形状变的不规贝丨J，有的生出触角，经流式细胞仪检测，THP-1经诱导后表面分子⑶la，⑶80，⑶83和⑶86上调，而⑶14下调,提示单核细胞向DC转化。实施例7 如图7A、7B，肺癌皮下移植瘤模型建立人肺癌A549细胞1640培养液中37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养。24只裸鼠，5-6周，体重18-25g，在SPF条件下饲养和实验。将肿瘤细胞注射到Bal/c裸鼠(南京医科大学实验动物中心提供)背部，每只接种5X IO6细胞。当肿瘤长到70mm3-100mm3时开始治疗，将动物按肿瘤大小和体重随机分成4组，每组6只。按病毒滴度，每组给病毒5X IOltV. g. /只。动物状态监测，绘制肿瘤生长曲线；治疗30天时，摘眼球法采血，干生化法(OLYMPUS AU640)检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及血尿素氮(BUN)水平，观察基因治疗对肝肾功能影响。图7A基因治疗后，肿瘤生长抑制明显，瘤体增长速度减缓，至第30天，治疗组肿瘤体积小于对照组和空载组(*P〈0. 01)。scAAV2/5-Y719F-CD40LT治疗组抑瘤率50. 35%,scAAV2/5-Y719F-CD40L-M治疗组抑瘤率58. 75%，两组间比较有显著差异(*p〈0. 05)。图7B体内实验，基因治疗后，scAAV2/5-Y719F-CD40L-M治疗组ALT及BUN水平均较 scAAV2/5-Y719F-CD40L 治疗组低(*p〈0. 05)。从图中可以看出，含有目的基因的⑶40L-M病毒对肝肾功能的影响同野生型相比显著 减小。
权利要求
1.一种人源膜稳定突变基因⑶40L-M，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No :1。
2.根据权利要求1所述的人源膜稳定的突变基因CD40L-M，其特征在于 ⑶40L-M基因所编码的氨基酸序列与GenBank报道的人⑶40L的氨基酸序列相比具有如下突变第114位氨基酸由Gln变成Pro，第115位氨基酸由Lys变成Arg，第117位氨基酸由Asp变成Glu，第118位氨基酸由Gln变成Glu，第119位氨基酸由Asn变成Asp。
3.一种质粒载体pdsAAV-CB-⑶40L-M，其特征在于它包含⑶40L-M基因。
4.权利要求3所述的质粒载体pdsAAV-CB-⑶40L-M的构建方法，其特征在于 在源克隆pcDNA3.1+-⑶40L-WT的目的基因片段中通过特异引物设计、高保真DNA聚合酶PCR扩增、自身连接处理弓I入点突变，再通过亚克隆，得到pdsAAV-CB-⑶40L-M质粒载体。
5.一种重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，其特征在于它包含CD40L-M基因。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M，其特征在于所述重组腺相关病毒的载体是从不同血清型的自身互补的双链腺相关病毒scAAV野生体和突变体中遴选出的，外壳蛋白719位点酪氨酸残基点突变为苯丙氨酸的自身互补的重组AAV2/5 载体。
7.权利要求5或6所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M，已保藏于中国典型物保藏中心，保藏日期2012年11月26，保藏编号CCTCC NO V201252分类命名介导膜稳定CD40L基因的衣壳蛋白突变的重组双链腺相关病毒。
8.权利要求5所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-⑶40L-M的制备方法，其特征在于采用三质粒共转染法包装腺相关病毒，经纯化、浓缩后，Slot-blot测定病毒滴度，AAV包装时，通过选择不同的野生型或外壳蛋白突变型AAV的pAAV-R/C，及现有的pdsAAV-GFP和pHelper辅助质粒包装成scAAVX-R/C_GFP病毒颗粒，从不同的血清型scAAV野生型和突变型载体中，通过转导肺癌细胞GFP基因的表达效率，遴选出转导肺癌细胞效率最高的载体 scAAV2/5-Y719F-GFP，再以三质粒 pAAV2/5-Y719F-R/C、pdsAAV-CB-CD40L_M、pHelper 共转染法,构建得到 scAAV2/5-Y719F-CD40L-M。
9.权利要求5所述的重组腺相关病毒SCAAV2/5-Y719F-⑶40L-M在制备治疗肺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人源膜稳定突变基因CD40L-M核苷酸序列及氨基酸序列。本发明还公开了一种质粒载体pdsAAV-CB-CD40L-M。本发明还公开了一种以CD40L-M为靶基因的、高效转导肺癌细胞的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M及其制备方法以及在制备抗肺癌药物方面的应用。本发明CD40L-M基因转导肺癌细胞的体内外试验证实，其sCD40L产生显著减少，利用重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M提高了传统AAV的转导效率，能高效转导肺癌细胞，CD40L-M基因诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，诱导免疫激活，抑制体内肺癌增长，减少肝肾受损副作用。
文档编号C12N15/864GK103060331SQ20121051611
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者吴剑卿, 赵卫红, 许伟 申请人:南京医科大学第一附属医院