专利名称：重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒(Norwalk-likeviruses，NLVs)衣壳蛋白(recombinant Beijing virus，rBJV)及其制备方法，具体涉及的是诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达的衣壳蛋白及其制备方法。
背景技术：
诺瓦克样病毒是导致急性胃肠炎的主要病原之一，其通过水、食物等途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎的暴发和散发，其中生吃贝类食物是导致急性胃肠炎暴发流行的最常见原因。1987～1992年，在日本Kyushu地区暴发的急性胃肠炎中，有4次被证实与生食牡蛎有关。Schwab等用逆转录聚合酶链式反应的方法证实可以在贝类生物体内累积，且用消灭大肠杆菌的方法不能净化。诺瓦克样病毒作为急性胃肠炎的主要病原，在美国、英国、荷兰、日本、澳大利亚、南非等国家均有大量报道，在美国由诺瓦克样病毒引起的急性胃肠炎已占到42％。诺瓦克样病毒具有高感染性，能导致学校、军队、医院、食堂、旅游区等人口密集的社区爆发流行急性胃肠炎。尽管引起的急性胃肠炎症状(呕吐、腹泻、腹部痉挛等)温和、呈自限性，但诺瓦克样病毒亦能在少数情况下导致死亡。
对我国部分地区人群诺瓦克样病毒抗体水平调查显示，我国感染诺瓦克样病毒也相当普遍。1998～2002年在福州地区用逆转录聚合酶链式反应方法对288份腹泻患者粪便标本诺瓦克样病毒病原检测显示，诺瓦克样病毒阳性率为39.9％。据报道，我国2003年10月22日广州某小学引发了一次82人诺瓦克样病毒合并金黄色葡萄球菌中毒的事件。
我国尚无重组诺瓦克样病毒衣壳蛋白的报道，对我国抗体水平及抗原的调查所用检测抗原均来自国外的重组蛋白。在各国的流行毒株均有差异，本发明用来产生重组蛋白的诺瓦克样病毒是在我国分离的毒株，用此重组蛋白作为检测抗原或用来制备检测抗体所得到的检测结果更贴近实际。并且，用本发明的实验方法能够得到其他国内重组衣壳蛋白。
由于诺瓦克样病毒无法用细胞培养又无合适的动物模型，只能从患者粪便标本中获得数量很少的病毒抗原，这对诺瓦克样病毒血清学和流行病学研究造成了极大困难。而应用基因工程技术可以获得大量的人工重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，使人们对诺瓦克样病毒的研究不再受粪便标本中病毒数量的影响，并且重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白所产生的病毒样颗粒与天然病毒的形态和抗原性极为相似，对建立灵敏度高、诊断迅速和特异性强的酶联免疫吸附试验方法和研制口服疫苗打下了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达衣壳蛋白及制备方法。
本发明提供的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，是一种诺瓦克样病毒衣壳蛋白第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达蛋白，所述第二个开放阅读框基因共1623个碱基，编码540个氨基酸残基，重组蛋白分子量为58kDa，该衣壳蛋白在昆虫细胞中自我组装成的病毒样颗粒在抗原性和形态方面与天然病毒相似。
本发明的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，其中用于产生所述第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达衣壳蛋白的共1623个碱基的第二个开放阅读框基因，其核酸具有序列表中SEQ ID NO1所述的碱基序列。
本发明的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，其中所述第二个开放阅读框基因编码的540个氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
本发明所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白的制备方法其过程包括(1)设计扩增诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因的特异性引物；(2)提取病毒RNA；(3)将病毒RNA反转录成cDNA；(4)通过聚合酶链式反应扩增获得第二个开放阅读框基因片段；(5)对第二个开放阅读框基因进行克隆、测序鉴定；(6)将第二个开放阅读框基因定向亚克隆至pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体；(7)纯化质粒pBacHis2-第二个开放阅读框；(8)将纯化好的质粒pBacHis2-第二个开放阅读框与线性化野生型杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞sf9中，通过噬斑法筛选和纯化重组病毒；(9)在杆状病毒系统中表达病毒样颗粒；
(10)纯化重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白形成的病毒样颗粒。
本发明可用于采用本发明的方法可同样制备出诺瓦克样病毒其他不同毒株的重组衣壳蛋白。
采用本发明的方法得到的诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达衣壳蛋白，可用其制备检测抗体并建立酶联免疫吸附试验方法，检测污染诺瓦克样病毒的海洋生物或感染诺瓦克样病毒患者粪便标本中的诺瓦克样病毒。
采用本发明的方法得到的诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达衣壳蛋白，可作为检测抗原建立间接酶联免疫吸附试验方法，检测人群中诺瓦克样病毒抗体水平的血清学调查。
利用本发明的产品可用于研制开发预防诺瓦克样病毒感染的基因工程口服疫苗。
本发明的产品优点体现在由于本发明的产品重组杆状病毒表达的衣壳蛋白并非全病毒，因此无散毒危险。
利用本产品可获得大量与天然病毒形态与抗原性相似的病毒样颗粒。
作为诊断抗原特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济。
作为诊断抗原检测诺瓦克样病毒患者粪便标本时，不再受粪便标本中病毒数量的限制。
图1为显示有酶切位点的pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体的序列。
图2为病毒样颗粒电镜照片。
图3为病毒样颗粒电泳结果。
具体实施例方式
本发明诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达的衣壳蛋白，是利用基因工程技术，在对诺瓦克样病毒衣壳蛋白基因完整开放阅读框进行克隆的基础上，将其与杆状病毒表达转移载体pBlueBacHis2连接，与Bac-N-BlueDNA共转染进入昆虫细胞，通过噬斑法筛选并纯化重组病毒，在昆虫细胞表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，分子量约为58kDa，能自我组装成病毒样颗粒，其形态与免疫性与天然病毒极为相似。
制备实施例(重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白的制备)1.设计扩增诺瓦克样病毒第二个开放阅读框(ORF2)基因的特异性引物在基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov)上下载已发表的诺瓦克样病毒毒株序列，所用参考毒株为Camberwell virus、Lordsdale virus、Hawaii virus、Mexico virus、OTH25virus，它们在Genebank上的基因序列认证号相应分别为U46500、X86557、U07611、U22498、L23830。根据这些参考序列在ORF2基因外两端区域设计一对引物。
合成引物。
2.提取病毒RNA用Trizol法提取病毒RNA，过程为将粪便标本(250μl)在冰上融化，4℃，8000rpm离心分钟，取上清；4℃，10000rpm离心5分钟，取上清200μl；加入400μl Trizol，反复倒置1分钟，室温静止10分钟；加入氯仿400μl混匀，室温静止10分钟；4℃，12000rpm离心15分钟；取上层液加1.5倍体积异丙醇，-20℃沉淀2h；4℃，15000rpm离心10分钟，去上清；37℃干燥；加入10μl用焦碳酸二乙酯处理过的无菌水。
3.将病毒RNA反转录成cDNA将提取的病毒RNA用所设计的特异性引物的下游引物在反转录酶的作用下反转录成cDNA，作为聚合酶链式反应的模板。
4.通过聚合酶链式反应扩增获得第二个开放阅读框基因片段。
5.对第二个开放阅读框基因进行克隆、测序鉴定将聚合酶链式反应得到的第二个开放阅读框基因片段回收、纯化。
将纯化的第二个开放阅读框基因片段与PMD18-T载体连接转化进入大肠杆菌TG I中筛选出阳性克隆，测序鉴定，测序结果为序列表中SEQ ID NO1所述的碱基序列。
6.将第二个开放阅读框基因定向亚克隆至pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体设计一对带酶切位点的特异性引物，此酶切位点在pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体的多克隆位点中能找到(图1)。
其中，图1 EK cleavage site为蛋白酶K裂解位点(与本发明无关)。图1给出的序列是pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体的多克隆位点，BamH I、Xho I、Sac I、Bgl II、Pst I、Kpn I、Nco I、EcoR I、Hind III及Sal I为限制性内切酶名称，指向的位置是每个酶识别的核苷酸序列。
以步骤5得到的阳性克隆为模板，进行聚合酶链式反应。
将聚合酶链式反应产物和pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体用相同的限制性内切酶酶切，所获得的酶切产物进行纯化后，用T4DNA酶连接并转化进入大肠杆菌TG I中，筛选出阳性克隆(pBacHis2-第二个开放阅读框)，测序鉴定结果为序列表中SEQ IDNO1所述的碱基序列。
7.纯化质粒pBacHis2-第二个开放阅读框纯化质粒pBacHis2-第二个开放阅读框，纯化后的质粒用分光光度仪测出OD260和OD280的值，OD260/OD280的值为1.81，该比值在1.6～1.8之间证明纯度达到要求，根据OD260的值计算出质粒浓度为0.2731μg/μl。
8.将纯化好的质粒pBacHis2-第二个开放阅读框与线性化野生型杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞sf9中，通过噬斑法筛选和纯化重组病毒。
9.在杆状病毒系统中表达病毒样颗粒用感染复数为10的纯化的重组病毒在无血清培养基中感染HighFive细胞，用感染复数为10的纯化的重组病毒在无血清培养基中感染HighFive细胞，表达的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白在HighFive细胞中自我组装成病毒样颗粒。
10.纯化重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白形成的病毒样颗粒重组病毒感染5天后，收获细胞裂解液。4℃，3000×g离心30min除去细胞碎片，将上清4℃，8300×g进一步离心30min以除去杆状病毒粒子。4℃，100000×g超速离心2h浓缩病毒样颗粒，将病毒样颗粒沉淀用含有10μM亮抑酶肽的Grace’s培养基重悬过夜，加入氯化铯使病毒样颗粒终浓度为1.36g/mL，10℃，38000rpm离心22h。含有病毒样颗粒的分级液用Centricon-30过柱以除去盐分，纯化的病毒样颗粒用含有10μM亮抑酶肽的Grace’s培养基洗脱下来。纯化的病毒样颗粒用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2)以及进行电镜鉴定(图3)。
图2为病毒样颗粒电镜照片，电镜照片中的病毒样颗粒约为38nm，标尺为100nm。
图3为病毒样颗粒电泳结果，其中M蛋白MarkerD1细胞对照D2野生型病毒对照rBJV重组病毒其中rBJV蛋白带中所指箭头即约58kDa的重组杆状病毒表达的衣壳蛋白。
应用实施例(用重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白制备抗体)取400μg纯化的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，加生理盐水稀释至4mL，再加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化。取健康的2公斤的雄性兔2只，每只皮下注射诺瓦克样病毒衣壳蛋白与弗氏完全佐剂混合物4mL，分8点注射，每点500μL，第二次以后均以诺瓦克样病毒衣壳蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合免疫，每次免疫后间隔4周再免疫1次，共免疫4次，最后一次免疫10天后，采血，分离血清，测效价。用双琼脂扩散试验方法测定效价，效价为1∶20000，表明该血清为高免血清，同时也证明了该诺瓦克样病毒衣壳蛋白的抗原性。
获得诺瓦克样病毒衣壳蛋白后，可以建立间接酶联免疫吸附试验，检测人群体内诺瓦克样病毒抗体水平；抗诺瓦克样病毒衣壳蛋白的高免血清获得后，更可以利用衣壳蛋白和高免血清建立竞争酶联免疫吸附试验，检测海洋生物或感染诺瓦克样病毒患者粪便标本中的诺瓦克样病毒。
另外，根据现有的文献(仓尧卿，诺沃克病毒研究的困难和进展，国外医学预防·诊断·治疗用生物制品分册，2001，24(2)49-52)，重组杆状病毒表达的NLVs衣壳蛋白可以作为候选疫苗，但其中存在的问题还需进一步研究。作为实例，用重组杆状病毒表达的NLVs衣壳蛋白给志愿者口服100μg与200μg时，显示安全并具免疫原性，给予大剂量时，所有志愿者均发生血清学应答。
序列表<110>国家海洋环境监测中心东北农业大学<120>重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白及其制备方法<130>SCP0196/2004<140>
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<150>
<151>
<160>2<170>
<210>1<211>1623<212>DNA<213>Norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Beijing/2002/China，capsid protein，complete cds.
<400>1
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gttaaccaat tctacacact tgcccccatg ggaaatggag cggggcgtag acgtgcgtta1620taa 1623<210>2<211>540<212>DNA<213>Norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Beijing/2002/China，capsid protein，complete cds.
<400>2Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Ala1 5 10 15Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val20 25 30Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile35 40 45Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe50 55 60Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro65 70 75 80Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr85 90 95Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn100 105 110Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe115 120 125Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile130 135 140Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp145 150 155 160Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile165 170 175Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly180 185 190Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro195 200 205Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr210 215 220
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权利要求
1.重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，其特征为它是一种诺瓦克样病毒衣壳蛋白第二个开放阅读框基因在杆状病毒表达系统中表达的衣壳蛋白，所述第二个开放阅读框基因共1623个碱基，编码540个氨基酸残基，重组蛋白分子量为58kDa，该衣壳蛋白在昆虫细胞中自我组装成的病毒样颗粒在抗原性和形态方面与天然病毒相似。
2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，其中用于产生所述第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达衣壳蛋白的共1623个碱基的第二个开放阅读框基因，其核酸具有序列表中SEQ ID NO1所述的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白，其中所述第二个开放阅读框基因编码的540个氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白的制备方法，其过程包括(1)设计扩增诺瓦克样病毒第二个开放阅读框基因的特异性引物；(2)提取病毒RNA；(3)将病毒RNA反转录成cDNA；(4)通过聚合酶链式反应扩增获得第二个开放阅读框基因片段(5)对第二个开放阅读框基因进行克隆、测序鉴定；(6)将第二个开放阅读框基因定向亚克隆至pBlueBacHis2杆状病毒表达转移载体；(7)纯化质粒pBacHis2-第二个开放阅读框；(8)将纯化好的质粒pBacHis2-第二个开放阅读框与线性化野生型杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞sf9中，通过噬斑法筛选和纯化重组病毒；(9)在杆状病毒系统中表达病毒样颗粒；(10)纯化重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白形成的病毒样颗粒。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白在制备检验抗体中的用途，用于建立酶联免疫吸附试验方法，检测海洋生物或感染诺瓦克样病毒患者粪便标本中的诺瓦克样病毒。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白在制备检验抗原中的用途，用于建立酶联免疫吸附试验方法，进行诺瓦克样病毒抗体水平的血清学调查。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒衣壳蛋白在制备疫苗中的用途。
全文摘要
本发明提供一种重组杆状病毒表达的诺瓦克样病毒(NLVs)衣壳蛋白(rBJV)，其是一种诺瓦克样病毒衣壳蛋白第二个开放阅读框基因重组杆状病毒表达蛋白，该第二个开放阅读框基因共1623个碱基，编码540个氨基酸残基。其制备方法包括设计扩增引物；提取病毒RNA；反转录；扩增；克隆、测序鉴定；定向亚克隆；纯化质粒；共转染、筛选和纯化重组病毒；表达衣壳蛋白；纯化重组病毒样颗粒。该衣壳蛋白可直接作为抗原用于建立酶联免疫吸附实验方法，进行诺瓦克样病毒抗体水平的血清学调查，也能用来制备抗体建立酶联免疫吸附实验方法检测诺瓦克样病毒，更可以进一步用其研制开发预防诺瓦克样病毒感染的基因工程口服疫苗。
文档编号C12N15/09GK1778812SQ200410091368
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者樊景凤, 靳淼, 王君伟 申请人:国家海洋环境监测中心, 东北农业大学